專利名稱：市售酸奶在預(yù)防尿結(jié)石中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)防尿結(jié)石的食品，具體地說，是酸奶在預(yù)防尿結(jié)石中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
尿石癥是泌尿系統(tǒng)的常見病，草酸鈣結(jié)石占70% 80%，其復(fù)發(fā)率較高，因此，預(yù) 防一直是重要的研究課題。在草酸鈣結(jié)石的形成過程中，草酸的作用遠(yuǎn)大于鈣，腸道中 的草酸吸收量是影響尿草酸排泄量變化的重要因素。如能找到一種有效減少腸道草酸吸 收量的簡便方法，則草酸鈣結(jié)石的預(yù)防將成為可能。
寄生在腸道中的食草酸桿菌具有分解草酸的能力，但目前尚無可供口服補(bǔ)充的活菌 制劑。近年來，有人嘗試給尿石癥患者的腸道補(bǔ)充具有草酸分解能力的酶，如草酰輔酶A 脫羧酶、甲酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶等，但由于這些酶通過胃腸道時(shí)大部分遭到破壞，所以很難 起到預(yù)期效果。
近年來研究發(fā)現(xiàn)，部分乳酸菌具有降解草酸的能力。Weese等從犬糞便中分離出37 株乳酸菌，其平均體外草酸降解率為17.7%，有4株降解率為0%， 10株小于10%。 Campieri等給伴有輕微高草酸尿癥的草酸鈣結(jié)石患者，每日口服大劑量的混合乳酸菌顆 粒冷懸液(含等比例的嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嬰兒雙歧桿菌和短乳桿 菌)，連續(xù)4周，所有患者24小時(shí)尿草酸排泄量都出現(xiàn)減少， 一個(gè)月后復(fù)測結(jié)果依然相 同。同時(shí)，有兩名患者的糞便草酸排泄量大大減少，表明口服大量混合乳酸菌能有效減 少草酸的吸收，并能維持一定的時(shí)間。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些乳酸菌均具有降解草酸能力。 這兩項(xiàng)研究為草酸鈣結(jié)石的預(yù)防開辟了一條新的途徑，引起了泌尿科醫(yī)生的關(guān)注。 Rogowska-Kalisz等已將乳酸菌制劑納入其腎結(jié)石患兒的綜合預(yù)防方案之中。
由于腎結(jié)石復(fù)發(fā)的預(yù)防是個(gè)終身性的任務(wù)，因此，對預(yù)防方法而言，良好的患者依 從度是個(gè)根本的前提。預(yù)防方法若不能一勞永逸，就必須易使患者長期使用，否則效果 再好，也只是短效，達(dá)不到長期預(yù)防的目的。服用活菌制劑的預(yù)防效果雖好，但需要患 者去刻意堅(jiān)持服用，因此依從度不高。而許多乳制品雖含有乳酸菌，菌量通常為104
310SCFU/克，尚難以起到較為滿意的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出關(guān)于酸奶在預(yù)防尿結(jié)石中的應(yīng)用。通常凝固型酸奶中的乳酸 菌含量約在10S l(^CFU/ml。這些乳酸菌也能分解草酸，飲用后能減少腸道的草酸吸 收量，因此飲用酸奶將是一種有效而實(shí)用的草酸鈣腎結(jié)石預(yù)防方法。
依據(jù)以上發(fā)明目的，本發(fā)明提出的關(guān)于酸奶在預(yù)防尿結(jié)石中的應(yīng)用的技術(shù)要點(diǎn)是 通過飲用酸奶，利用酸奶中的乳酸菌來分解草酸，飲用后能減少腸道的草酸吸收量，達(dá) 到有效而實(shí)用的預(yù)防草酸鈣腎結(jié)石的生成。因?yàn)樗崮逃杏喫头?wù)，訂戶必須每日更換奶 瓶，從而無法漏飲。這種被迫養(yǎng)成的自覺飲奶行為，無需主觀努力，在客觀上確保了"飲 酸奶防石法"具有極高的患者依從度。
酸奶是一種歷史悠久、深受大眾喜愛的乳飲品。其制作方法是將乳酸菌加入鮮奶發(fā) 酵而成，乳酸菌將奶中的乳糖轉(zhuǎn)變成乳酸，并賦予良好的風(fēng)味。乳酸菌是一類能利用可 發(fā)酵的糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌通稱，包括10多個(gè)屬，200多個(gè)種，廣泛分布在動物體內(nèi) 及自然界。從形態(tài)上可以分為球菌和桿菌，均為革蘭氏染色陽性的兼性厭氧性或厭氧性 細(xì)菌。普通酸奶一般采用保加利亞乳桿菌(現(xiàn)更名為德氏乳桿菌保加利亞亞種)和嗜熱 鏈球菌(現(xiàn)更名為唾液鏈球菌嗜熱亞種)發(fā)酵，前者主要產(chǎn)乳酸，后者主要產(chǎn)酸奶特有 的風(fēng)味。兩者?；旌鲜褂?，比例為l:l時(shí)口感最好，L5:l時(shí)略偏酸。酸奶生產(chǎn)時(shí)，可依 不同目的加入其他菌種，如添加嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌以加強(qiáng)保健作用；添加謝氏丙酸 桿菌以合成VitBu、嗜酸乳桿菌合成煙酸、VitC、 VitB2、明串珠菌合成VitB12、 VitB2; 添加雙乙酰乳鏈球菌、明串珠菌以加強(qiáng)風(fēng)味；添加乳鏈球菌變種以改善組織結(jié)構(gòu)。
嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌屬于益生菌。益生菌是指來源于宿主，能在宿主腸道內(nèi)生存， 改善腸內(nèi)生態(tài)菌群生態(tài)平衡，對宿主起有益作用的活性微生物。僅有小部分乳酸菌屬益生 菌，反之亦然。嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌的保健效果優(yōu)于保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌， 但單獨(dú)制作酸奶發(fā)酵時(shí)間較長，風(fēng)味較差，不利于生產(chǎn)和不易被消費(fèi)者接受。而且雙歧 桿菌的很多種類缺乏蛋白酶,不能單獨(dú)在牛奶中生長，必須與嗜酸乳桿菌合用，因此，有 些生產(chǎn)商采用4株菌聯(lián)合發(fā)酵或后混合方式來生產(chǎn)益生菌酸奶。
在酸奶形成后仍大量存活的乳酸菌和/或益生菌，與發(fā)酵過程中產(chǎn)生的各種因子一起，隨著酸奶的飲用而進(jìn)入食用者的消化道，產(chǎn)生特殊的保健功效，如降低血膽固醇、 改善胃腸微生態(tài)平衡(整腸作用)、防治肝臟疾病、防癌抗癌、提高免疫功能、抗衰老等 的生理代謝功能。胃液和膽汁有抑、殺菌作用，而酸奶能緩沖胃液和膽汁，益生菌酸奶中 的嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌在抵抗胃酸和膽汁方面,也有協(xié)同作用，因此，與益生菌制劑相 比，酸奶中的益生菌更易通過上消化道而繼續(xù)保持活性。
對普通酸奶而言，加入乳酸菌的目的只是為了發(fā)酵產(chǎn)酸；對益生菌酸奶而言，加入 益生菌是為了產(chǎn)生保健功效。美國的酸奶配方多由生產(chǎn)商自己制定，沒有明確規(guī)定活菌含 量，只要求保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌必不可少，僅加利福尼亞州和俄勒岡州規(guī)定了 所有奶制品中益生菌的最低水平。我國的酸奶生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)中，只是推薦活性乳酸菌》107ml， 尚無益生菌含量的規(guī)定，也無包裝上標(biāo)明所用菌種及其含量的規(guī)定。因此，生產(chǎn)廠商在 酸奶的包裝說明上也就乘機(jī)含糊其詞，造成消費(fèi)者無法了解市售各品牌酸奶的所用菌種 及其含量。 一般而言，凝固型酸奶中的乳酸菌含量約在106 109 CFU/ml。如市售的達(dá)能 特濃酸奶，發(fā)酵菌為嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和雙歧桿菌，菌落數(shù)〉lX10'CFU/g。
常見的酸奶含有保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌及嗜熱鏈球菌，乳酸菌含量在2.38X 107 5. 56X107ml之間，
2001年，意大利學(xué)者Campieri等發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌及嗜熱鏈球菌具有體外分解草酸 的能力，保加利亞乳桿菌有無此能力尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，保加利亞 乳桿菌也具有體外分解草酸的能力，且飲用市售的品牌酸奶可明顯減少大鼠尿草酸排泄 量，推測品牌酸奶所含的乳酸菌具有動物體內(nèi)分解草酸、減少腸道草酸吸收量的能力。
'已知益生菌的臨床效應(yīng)與其每日攝入量有關(guān)。大量的益生菌生理效應(yīng)研究證實(shí),每日 有效攝入量為1X109,CFU，按每克酸奶含1億個(gè)嗜酸乳桿菌、1百萬個(gè)雙歧桿菌計(jì),每日 飲用100ml以上的益生菌酸奶，即有很好的效果。
酸奶出廠時(shí)，pH值被控制在4.5，隨著儲存期的延長，酸奶會出現(xiàn)后發(fā)酵現(xiàn)象，pH 值隨之降至4 1或以下。由于酸奶中的益生菌對酸敏感，隨著儲存期的延長，活菌數(shù)量 易下降，廠商建議在貨架期末酸奶中益生菌含量應(yīng)為2X106CFU/ml。因此，為了益生菌 攝入量的最大化，宜選用新出廠的酸奶飲用。


圖l-l為接種酸奶的MRS培養(yǎng)基菌落形態(tài)圖，圖中l(wèi)號圓形菌落2號扁圓形
5菌落。
圖l-2為扁圓形菌落形態(tài)圖。 圖l-3為圓形菌落形態(tài)圖。 圖2-1.酸奶中乳酸菌體外72h草酸分解率比較 圖2-2不同草酸濃度對嗜酸乳桿菌分解草酸能力的影響 圖2-3不同草酸濃度對嗜熱鏈球菌分解草酸能力的影響 圖2-4不同草酸濃度對保加利亞乳桿菌分解草酸能力的影響 圖2-5不同草酸濃度對混合乳酸菌分解草酸能力的影響 圖2-6三種乳酸菌和混菌的草酸分解率和環(huán)境草酸濃度影響的比較 圖2-7三種乳酸菌和混菌的草酸分解量和環(huán)境草酸濃度影響的比較 圖2-8乳酸菌在草酸環(huán)境中培養(yǎng)72h的生長情況 圖3-l.大鼠24h尿草酸排泄量的變化 圖4.實(shí)驗(yàn)分組情況 具體實(shí)施例
實(shí)施例1.酸奶中乳酸菌的菌種鑒定、藥敏試驗(yàn)及細(xì)菌含量的測定
目的確定上海市場上六個(gè)品牌酸奶所含的乳酸菌含量和種類，確定其敏感抗生素。
材料和方法
一、材料
(一) 主要實(shí)驗(yàn)器材滅菌玻璃平板培養(yǎng)皿，稱量天平，5%(302培養(yǎng)箱(Forma， 3111 型)，高壓滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)，比濁度測量儀(DENSIMAT，梅立艾 公司)，自動微生物鑒定儀(ATB8.22，梅立艾公司)。
(二) 實(shí)驗(yàn)試劑
1. 蛋白胨、酵母浸膏、無水乙酸鈉等(分析純上?；瘜W(xué)試劑公司)
2. 厭氧菌鑒定板條及液體培養(yǎng)基(API50CH培養(yǎng)基)(梅立艾公司)
3. 藥敏鑒定試紙(上海伊華試劑公司)
4. 改良MC培養(yǎng)基(中科院上海昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司)
5. 塑罐裝達(dá)能、光明、蒙牛、味全、全佳、波力牌酸奶超市購買，同一出廠期，4
'c冰箱中儲存二、方法
(一) 乳酸菌培養(yǎng)基采用MRS固體培養(yǎng)基，按菌種說明書所載方法進(jìn)行配置 在室溫下準(zhǔn)確稱量以下各種成分蛋白胨10克，酵母浸膏10克，牛肉提取物IO
克，無水硫酸鈉5克，磷酸二氫鉀2克，七水硫酸鎂0.2克，硫酸錳0.05克，氯化鈣 1.5克，瓊脂15克，葡萄糖5克，去離子水1升。置于燒杯中加熱溶解，調(diào)節(jié)pH值至 5.8~6.3, 12KC下高溫滅菌消毒15分鐘，待冷卻到50。C時(shí)澆注平板，五個(gè)平板為一組， 牛皮紙包裝后置于4'C冰箱中備用。
(二) 實(shí)驗(yàn)步驟
1. 菌種鑒定
a) 接種每種品牌酸奶取一瓶，搖勻后，劃線法接種于MRS平板上，每瓶接種三塊 平板，然后將平板置于5。/。C02培養(yǎng)箱中，37'C培養(yǎng)48小時(shí)。
b) 確定革蘭氏陽性菌落挑取每塊MRS平板上的不同形態(tài)菌落各3個(gè)，涂片，革蘭氏 染色，40X10倍光鏡下檢視，確定革蘭氏陽性菌落。
c) 擴(kuò)大培養(yǎng)革蘭氏陽性菌將各種不同菌落形態(tài)的G+菌分別接種于MRS平板上，每 種接種一塊，標(biāo)明所屬的酸奶品牌，在5^C02培養(yǎng)箱中，37'C培養(yǎng)48小時(shí)。
d) 菌種鑒定預(yù)培養(yǎng)將單一菌落培養(yǎng)的細(xì)菌轉(zhuǎn)接到API 50 CH液體培養(yǎng)基中，在比 濁度測量儀實(shí)時(shí)監(jiān)測下，調(diào)整轉(zhuǎn)接的細(xì)菌量，使其光密度達(dá)到2個(gè)MCFARLAND單 位，再將該培養(yǎng)液滴種到API50CH驗(yàn)條管中，5。/。C02培養(yǎng)箱中37'C培養(yǎng)48小時(shí)。
e) 菌種鑒定將驗(yàn)條管置于菌種鑒定儀中進(jìn)行菌種鑒定。
2. 藥敏試驗(yàn)
采用貼紙鑒定法，將接種味全牌酸奶的MRS培養(yǎng)基上的所有菌落用無菌棉棒涂抹混 勻后，將該棉棒放到無菌生理鹽水中攪拌，在比濁度測量儀實(shí)時(shí)監(jiān)測下，調(diào)整生理鹽水 中的細(xì)菌量，使其光密度達(dá)到0.5個(gè)MCFARLAND單位，換用無菌棉棒沾取菌液，均勻涂 布在MRS培養(yǎng)基上，再將7種抗菌素藥敏試紙貼于其上，l船種，>4張/平板，在5%。02 培養(yǎng)箱中37'C培養(yǎng)48小時(shí)后，測量紙片周圍抑菌環(huán)的直徑，〉3cm為敏感。
3. 乳酸菌計(jì)數(shù)-
a) 同一出廠期的6個(gè)品牌酸奶各取三瓶。
b) 選擇合適的稀釋倍數(shù)將酸奶搖勻，每瓶酸奶取lml的樣本，分別用無菌生理鹽水
7在滅菌廣口瓶內(nèi)作成1:10的均勻稀釋液。用lml滅菌吸管吸取lml稀釋液，沿管壁 徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水的試管內(nèi)(注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液)。另 取lml滅菌吸管，按上述順序操作，連續(xù)作10倍遞增稀釋，直至達(dá)到107倍的稀釋 度。每遞增一次，即換用滅菌吸管。
c) 接種在105、 106和107倍稀釋度里各取11111,分別與冷至50。C的改良MC培養(yǎng)基15ml 混勻，澆注在二塊平板內(nèi)，并轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。同時(shí)取lml滅菌生理鹽^C做同 樣處理，作為空白對照。
d) 培養(yǎng)置于5。/。C02培養(yǎng)箱中，37'C培養(yǎng)48小時(shí)。
e) 菌落計(jì)數(shù)紅色菌落為乳酸菌，對其進(jìn)行目視計(jì)數(shù)。
f) 菌落換算成菌數(shù)按標(biāo)準(zhǔn)方法計(jì)算。 (三)統(tǒng)計(jì)方法-
采用SAS軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用幾何均數(shù)G士s表示，兩組間均數(shù)比較用單因素方 差分析。 結(jié)果
1. 菌落生長形態(tài)接種培養(yǎng)48小時(shí)后，六個(gè)品牌的酸奶培養(yǎng)基中均出現(xiàn)兩種形態(tài)的 菌落(圖l-l)， 一種為扁圓形、邊緣不整齊、質(zhì)地柔軟、顏色灰、表面粗糙、不透
明的菌落(圖l-2);另一種為圓形、邊緣整齊、質(zhì)地柔軟、顏色灰白、表面光滑、
透明的菌落(圖l-3)。
2. 細(xì)菌革蘭氏染色和形態(tài)光鏡下觀察 一部分圓形菌落為G+鏈球菌，另一部分圓形
菌落和扁圓型菌落為G+短桿菌。
3. 菌種鑒定結(jié)果G+鏈球菌為嗜熱鏈球菌，扁圓形菌落的G+短桿菌為保加利亞乳酸 桿菌，圓形菌落的G+短桿菌為嗜酸乳桿菌。
結(jié)論常見的六種市售品牌酸奶中都含有保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌及嗜熱鏈球菌。
實(shí)施例2三種乳酸菌體外分解草酸能力的測定
目的測定液體培養(yǎng)基中保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌和混菌的分解草酸 能力和耐草酸生長能力。
材料和方法
8一、材料
(一) 實(shí)驗(yàn)器材
1. 滅菌平板，5%0)2培養(yǎng)箱，高壓滅菌鍋，稱量天平，電爐，錐形瓶，量筒，吸管。
2. 721分光光度計(jì)(廈門分析儀器廠)
(二) 實(shí)驗(yàn)試劑
1. 保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌干燥冷凍純菌種
(中國科學(xué)院菌種保藏中心)2.酸奶出廠第二天的塑罐裝味全牌酸奶，超市購買，4'C冰箱中儲存3.草酸銨、葡萄糖、已糖(分析純上?；瘜W(xué)試劑公司)4.基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基(MRS肉湯).-(上海化學(xué)試劑公司提供原材料，自行配置)5.MRS培養(yǎng)基(上?；瘜W(xué)試劑公司提供原材料，自行配置)6.一水草酸鉀(分析純上海化學(xué)試劑公司)7.麝香溴酚蘭-(上?；瘜W(xué)試劑公司提供原材料，自行配置)8.甲基紅指示劑(上?；瘜W(xué)試劑公司提供原材料，自行配置)9.鉻酸鉀(分析純上?；瘜W(xué)試劑公司)
、方法
(一) 主要試劑配置
1. 各組草酸培養(yǎng)基配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基與相應(yīng)組的草酸糖溶液，按l:l的體積配置。
2. 基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基(MRS肉湯)酪蛋白胨10克，牛肉膏10克，酵母膏浸出液 5克，吐溫，801克，KH2P042克，已酸鈉5克，檸檬酸三氨2克，7水硫酸鎂0.5克， 硫酸錳0.5克，水500ml， pH5.5~5.8。在121。C高溫下滅菌15分鐘，待冷卻后置于4°C 冰箱中保存。
3. 草酸糖溶液-
1) Ai組草酸銨10mmol/L+葡萄糖40g/L; A2組草酸銨20mmol/L+葡萄糖40g/L; 八3組草酸銨40mmol/L+葡萄糖40g/L。
2) B,組草酸銨10腿01/1^葡萄糖40§/1^+已糖Z0g/L; B2組草酸鈸20mmol/L+葡萄糖40g/L+已糖20g/L;
9B3組草酸銨40mmolTL+葡萄糖40g/L+已糖20g/L。
4. 草酸標(biāo)準(zhǔn)液 一水草酸鉀1.0231克溶于蒸餾水至100ml (含無水草酸5mg/ml)， 將儲備液稀釋100倍作為應(yīng)用液，置于4"C冰箱中保存。
5. 麝香溴酚蘭指示劑:O.lg麝香溴酚蘭+ 0.05mmol/LNaOH 3.2ml +去離子200ml。
6. 鉻酸鉀配制成1.0mmol/L的水溶液。
7. 甲基紅指示劑O.lg甲基紅+0.05mmol/LNaOH7.4ml+去離子水200ml。
(二) 實(shí)驗(yàn)步驟
1. 復(fù)蘇干燥冷凍的純菌種用無菌吸管吸取0.3 0.5mlMRS液體培養(yǎng)基，滴入純 菌種安瓿中，輕輕振蕩使冷凍干菌溶解呈懸浮狀。吸取全部細(xì)菌懸浮液，移入MRS液 體培養(yǎng)基中，37'C， 5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。測定其培養(yǎng)后的細(xì)菌濃度光密度值。
2. 獲取所需濃度的酸奶乳酸菌混菌將酸奶用劃線法接種到MRS固體培養(yǎng)基中， 5。/。C02培養(yǎng)箱中37'C培養(yǎng)24小時(shí)。再用無菌棉棒將固體培養(yǎng)基上的乳酸菌移入液體MRS 培養(yǎng)基中，5。/。C02培養(yǎng)箱中37'C培養(yǎng)30小時(shí)，此時(shí)細(xì)菌光密度值(菌量)接近純菌種 復(fù)蘇培養(yǎng)48小時(shí)后的光密度值(菌量)。
3. 接種細(xì)菌將復(fù)蘇后的保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和酸奶乳酸菌混菌，各取 三份，每份lml，分別接種在不同草酸濃度的9ml A組培養(yǎng)基中；復(fù)蘇后的嗜熱鏈球菌 接種在不同草酸濃度的9ml B組培養(yǎng)基中(見表2-l)。取未接種細(xì)菌的不同草酸濃度的 A組草酸培養(yǎng)基各10ml作為空白對照組。
4. 培養(yǎng)前細(xì)菌計(jì)數(shù)從剛接種混合后的10ml菌液中取lml (109、 101Q、 1011倍連 續(xù)稀釋)與MRS培養(yǎng)基一同澆注平板，5%(302培養(yǎng)箱中37。C培養(yǎng)48小吋，記錄菌落數(shù)， 算出相應(yīng)的細(xì)菌濃度。
5. 培養(yǎng)將計(jì)數(shù)取樣后剩余的9ml菌液置于5y。C02培養(yǎng)箱中，37'C培養(yǎng)72小時(shí)。
6. 培養(yǎng)后細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)后的菌液每種取lml,作109、 101Q、 1()U倍連續(xù)稀釋后 與MRS培養(yǎng)基一同澆注平板，5y。C02培養(yǎng)箱中37'C培養(yǎng)48小時(shí)，記錄菌落數(shù)，算出相 應(yīng)的細(xì)菌濃度。
7. 草酸含量測定將培養(yǎng)72h后的含菌培養(yǎng)基置于沸水中30分鐘滅菌，離心10 分鐘，3000轉(zhuǎn)/分，每份菌液取5個(gè)樣本，每個(gè)樣本lml上清液，用鉻酸鉀氧化甲基紅催 化光度法測量培養(yǎng)液中的草酸濃度，取其均值作為該份菌液的草酸濃度值。(三)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SAS軟件進(jìn)行分析，草酸濃度均數(shù)用T士s表示，乳酸菌均數(shù)用G士s表示，兩 組間均數(shù)比較用單因素方差分析。 實(shí)驗(yàn)表明
1. 乳酸菌的分解草酸能力經(jīng)過72h培養(yǎng)后，所有培養(yǎng)基中的草酸濃度都有不同程度 的下降，而各實(shí)驗(yàn)組的草酸濃度降幅均大于對照組。在培養(yǎng)基中草酸濃度相等的情況下， 各菌種分解草酸的能力依次為嗜酸乳桿菌>混菌>保加利亞乳桿菌〉嗜熱鏈球菌(圖 2-1)。
2. 環(huán)境草酸濃度變化對乳酸菌分解草酸能力的影響草酸濃度變化對三種乳酸菌和混 菌的分解草酸能力均有一定的影響(表2-2 2-4)。隨著環(huán)境草酸濃度的變化，乳酸菌的
草酸分解量和分解率曲線呈剪式分離，既培養(yǎng)基中的草酸含量越高，乳酸菌對草酸的分
解量就越多，但分解率卻越低(圖2-2 2-5)。
表2-2.5mmol/L草酸培養(yǎng)基中草酸含量的變化(Y±S mmol/L)
組別N培養(yǎng)前 (A)培養(yǎng)72h后72h草酸總分解率(％) 細(xì)菌分解草酸率(％) (B) (A-B)/A (對照組B-細(xì)菌組B)/對照組B細(xì)菌分解草酸量 對照組B-細(xì)菌組B
對照組34.504.21 ±0.816.6 ——
酸34.503.74±0.6716.9 11.00.47
熱4.504.04 ±0.8210.2 4.60.17
保34.503.90±0.6013.3 7.30.31
混34.503.82±0.5115.1 9.00.39
(酸嗜酸乳桿菌熱嗜熱鏈球菌保保加利亞乳桿菌混酸奶中的乳酸菌) 表2-3.10mmol/L草酸培養(yǎng)基中草酸含量的變化(T±S mmol/L)組別N培養(yǎng)前 (A)培養(yǎng)72h后72h草酸總分解率(％) 細(xì)菌分解草酸率(％) (B) (A-B)/A (對照組B-細(xì)菌組B)/對照組B細(xì)菌分解草酸量 對照組B-細(xì)菌組B
對照組39.008.16±1.70 9.3 _—
11酸39.007.40 ±0.6017.89.40.76
熱39.008.01 ±0.5211.02.00.15
保9.007.56±0.9516.47.30.60
混39.007.50±0.6916.78.10.66
(酸嗜酸乳桿菌熱嗜熱鏈球菌保保加利亞乳桿菌混酸奶中的乳酸菌) 表2-4. 20mmol/L草酸培養(yǎng)基中草酸含量的變化(Y±S mmol/L)組別N培養(yǎng)前 (A)培養(yǎng)72h后 (B)72h草酸總分解率(％) (A-B)/A ()細(xì)菌分解草酸率(％) ST照組B-細(xì)菌組B)/對照組B細(xì)菌分解草酸量 ; 對照組B-細(xì)菌組B
對照組3l譜16.7 ±0.537.2——
酸318.0015.5 ±0.9013.98.2
熱318.0016.6 ±1.037.80.20.1
保318.0015.8±1.5012.25.40.9
混318.0015.4 ±1.4014.47.81.3
3. 三種乳酸菌和混菌的分解草酸能力及在不同環(huán)境草酸濃度中的表現(xiàn)嗜酸乳桿菌的
分解草酸能力最強(qiáng)，在5mmol/L的草酸環(huán)境中，3. 24X 10"CFU/ml的初始菌量在72小 時(shí)內(nèi)的分解草酸率達(dá)11.0%，在20mmol/L的草酸環(huán)境中，為8.2%;混菌的總體能 力緊隨其次；嗜熱乳桿菌的分解草酸能力最弱，在5mmol/L的草酸環(huán)境中，3.24X 10"CFU/ml的初始菌量在72小時(shí)內(nèi)的分解草酸率為4. 6%，在20咖ol/L的草酸環(huán)境 中，分解率降至0.2% (圖2-6 2-7)。
4. 環(huán)境草酸濃度變化對乳酸菌繁殖能力的影響:環(huán)境草酸濃度的高低對乳酸菌的繁殖生 長有一定的影響，表現(xiàn)為高草酸濃度對乳酸菌的繁殖有抑制，兩者呈負(fù)相關(guān)。高濃度 草酸對各菌的抑制程度不一，嗜酸乳桿菌和混菌受抑明顯，而嗜熱鏈球菌和保加利亞 乳桿菌則受抑輕微(表2-5、圖2-8)。
表2-5.乳酸菌在草酸環(huán)境中培養(yǎng)72h的生長情況(i土S CFU/mlX1011)_
組別 N 5mmol/L增值倍10mmol/L 增值倍 20mmol/L 增值倍
始 末 末-始/'始 始 末 末-始/始始 末 末-始/始
酸 33.2±4.0300±132 85.503.1 ±3.9 178±110 56.42 3.2±3.8 117±117 35.56
12熱33.1土3-0180±9557.063.0±2.0148±14348.333.1 ±4.0101 ±2531-58
保3.3±3.0150±14844.4512±5.0145 ±9344.313.3 ±2.0125 ±8936.88
混34.0±3.0300 ±2707楊3.9±3.0144±12135.904.0 ±3.092 ±7822.00
(酸嗜酸乳桿菌熱嗜熱鏈球菌保保加利亞乳桿菌混酸奶中含有的乳酸菌)
*:與5mmol/L組比較，尸<0.05 △:與10mmol/L組比較，尸<0.05 5.環(huán)境草酸濃度與乳酸菌草酸分解率的相關(guān)性環(huán)境草酸濃度與三種乳酸菌和混菌的 草酸分解率呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)性(表2-6)。
表2-6.環(huán)境草酸濃度與乳酸菌草酸分解率的相關(guān)性
菌名嗜酸乳桿菌嗜熱鏈球菌保加利亞乳桿菌混合菌
r-0. 924-O. 940-0. 919-0. 946
所有r值iM).OOl
6.乳酸菌數(shù)量與草酸分解率、分解量的相關(guān)性乳酸菌數(shù)量與草酸分解率呈強(qiáng)正相關(guān)， 其中嗜酸乳桿菌、酸奶混菌與草酸分解率的相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。乳酸菌數(shù)量與
草酸分解量的相關(guān)系數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2-7)。
表2-7.乳酸菌數(shù)量與草酸分解率、分解量的相關(guān)性
菌名嗜酸乳桿菌嗜熱鏈球菌保加利亞乳桿菌混合菌
分解率 分解量分解率 分解量分解率 分解量分解率 分解量
r=0. 99* -0. 980.900.600. 92 -0. 990.98* -0.90
實(shí)驗(yàn)表明，在草酸鈣結(jié)石的形成過程中，尿草酸的排泄量至關(guān)重要，它的輕微變化 就能明顯影響腎小管中草酸結(jié)晶的生成。有研究表明，西方人的尿草酸排泄量，50%來
源于食物性草酸在腸道的吸收。在他們的飲食中，草酸的日攝入量在50 400mg之間[39]。 在我國的國民飲食結(jié)構(gòu)中，蔬菜類占較大比例，由于蔬菜中草酸的含量較高，造成我國 國民的草酸攝入量高于西方人。有效控制腸道的草酸攝入量，對預(yù)防草酸鈣結(jié)石的生成 有積極的作用。近來發(fā)現(xiàn)，脊椎動物(包括人)腸道中的常駐菌群中，有些具有分解草 酸的能力，如食草酸桿菌、乳酸菌、糞腸球菌和遲緩真桿菌等。Campieri等觀察了6位頁
輕微高草酸尿癥患者，發(fā)現(xiàn)每日口服含菌量為8X1011的混合乳酸菌顆粒冷懸液(包括嗜 酸乳桿菌，植物乳桿菌，嗜熱鏈球菌，嬰兒雙歧桿菌和短乳桿菌)，連續(xù)4周，可以明顯 地減少患者尿草酸排泄量，停服一個(gè)月后，尿草酸排泄量仍然處于較低水平。同時(shí)，有 兩名患者的糞草酸排泄量大大減少，表明口服大量混合乳酸菌能有效減少腸道中的草酸 吸收量，并能維持一定的時(shí)間。
酸奶中含有多種乳酸菌，與口服乳酸菌制劑相比，飲用酸奶的患者依從度極高，容 易做到持之以恒，有利于預(yù)防效果的實(shí)現(xiàn)。酸奶具有緩沖胃液、膽汁pH的作用，益生菌 酸奶中的嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌在抵抗胃酸和膽汁方面，也有協(xié)同作用，因此，酸奶中的 乳酸菌更容易在通過上消化道后繼續(xù)保持活性。
從本發(fā)明實(shí)施例1中可知，常見的品牌酸奶中含有三種乳酸菌嗜酸乳桿菌、嗜熱 鏈球菌和保加利亞乳桿菌。本體外草酸代謝實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這三種乳酸菌及來自酸奶的乳酸 菌混菌都具有分解草酸的能力，其中嗜酸乳桿菌的能力最強(qiáng)，當(dāng)初始菌量為3.24X 10"CFU/ml時(shí)，在10mmol/L的草酸環(huán)境中，72小時(shí)內(nèi)分解草酸率為9. 4%,在20咖ol/L 的草酸環(huán)境中為8. 2%;保加利亞乳桿菌的能力居中；而嗜熱乳桿菌的分解草酸能力最弱， 當(dāng)初始菌量同樣為3. 24X10"CFU/ml時(shí)，在10mmol/L和20咖ol/L的草酸環(huán)境中，72小 時(shí)內(nèi)分解草酸率分別為2. 0%和0. 2%。來自酸奶的乳酸菌混菌的草酸代謝能力相當(dāng)強(qiáng)， 僅次于嗜酸乳桿菌，對環(huán)境中高濃度草酸的生長抑制作用也有一定的抗性，表明酸奶具 良好的減少腸道草酸吸收量、預(yù)防草酸鈣結(jié)石復(fù)發(fā)的潛質(zhì)。
實(shí)施例3 飲用酸奶對普通飲食大鼠尿草酸排泄量和腸道乳酸菌量的影響研究 目的了解飲用酸奶對大鼠尿草酸排泄量和腸道乳酸菌量的影響，了解大鼠腸道乳酸 菌量和尿草酸排泄量的相關(guān)性。
方法用活菌酸奶、滅菌酸奶和生理鹽水分別給三組大鼠連續(xù)灌喂20天，4ml/d，每 4天測一次尿草酸排泄量，每7天測一次腸道中的乳酸菌數(shù)量及大鼠體重變化。停灌后第 7天和第14天各測一次尿草酸排泄量、腸道中乳酸菌數(shù)量及大鼠體重。
材料和方法 一、材料
實(shí)驗(yàn)動物選用健康清潔級成年雄性SD大鼠(上海第二醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供)
1430只，體重180 200克/只。實(shí)驗(yàn)器材
大鼠代謝籠(蘇州實(shí)驗(yàn)器械有限公司)721分光光度計(jì)(廈門分析儀器廠)IVC大鼠飼養(yǎng)籠(上海紹豐實(shí)驗(yàn)動物設(shè)備有限公司)實(shí)驗(yàn)試劑
活菌酸奶出廠第二天的塑罐裝味全牌酸奶，超市購買，4'C冰箱中儲存， 一次性使
用
滅菌酸奶出廠第二天的塑罐裝味全牌酸奶，超市購買，12rC高溫滅菌15分鐘，4'C冰箱中儲存， 一次性使用
0. 9.生理鹽水(上海市華源長富藥業(yè)有限公司)
乳酸菌飲品細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(中科院上海昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司)
二、實(shí)驗(yàn)方法
(一)實(shí)驗(yàn)步驟
1. 30只大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。
2. 適應(yīng)性飼養(yǎng)三天，喂正常鼠飼料，飲自來水，第4天開始灌喂。
3. 空白對照組灌生理鹽水，酸奶對照組灌滅菌酸奶，實(shí)驗(yàn)組灌活菌酸奶，4ml/d，連續(xù)灌喂20天。每4天測定一次尿草酸排泄量，每7天測定一次腸道中乳酸菌數(shù)量及大鼠體重變化。停止灌喂后，第7天和第14天各測一次尿草酸排泄量、腸道乳酸菌量和及大鼠體重變化。
4. 大鼠腸道中乳酸菌數(shù)量的測量方法大鼠腸道中乳酸菌數(shù)量以每克新鮮糞便中的細(xì)菌數(shù)量來表示74]，選用新鮮的大鼠糞便lg，攪碎后用10ml生理鹽水稀釋混勻，離心5分鐘，1000轉(zhuǎn)/分，取上清液lml,,不同稀釋度稀釋后滴種在乳酸菌飲品細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基平板上，37'C， 5%032培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)平板上的細(xì)菌數(shù)，乘以10后得lg大鼠糞便所含乳酸菌量。
15(二)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SAS軟件進(jìn)行分析，草酸濃度均數(shù)及大鼠體重用T土S表示，菌數(shù)均數(shù)用GiS表示，兩組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組內(nèi)前后菌數(shù)比較用自身對照t-test。
結(jié)果
1. 24小時(shí)尿草酸排泄量的情況灌喂期間，三組均呈上升走勢，酸奶對照組與空白對照組的變化情況相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；活菌酸奶組的增量明顯小于對照組，12天后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第12天時(shí)，比空白對照組少14.3%，第20天時(shí)少17.P/。。停止灌喂的2周內(nèi)，活菌組出現(xiàn)向?qū)φ战M回歸的趨勢，但仍有12.5% 16.3%的差異(表3隱1、圖3-l)。表3-1.大鼠24h尿草酸排泄量的變化(i土smmol)
空白對照組A滅菌酸奶灌喂組(BO (A-BO/A 活菌酸奶灌喂(Bj) (A-B。/A
時(shí)間
(N=10)(N=10)(%)(N=10)(%)
l天0. 021 ±0.0050. 024 ±0. 004-14. 30. 024 ±0. 007-14. 2
4天0. 029±0. 0060. 028 ±0. 0053.40. 026 ±0. 00510,6
8天0. 032±0. 0040. 035 ±0. 006-6.30. 029 ±0. 0049.4
12天0. 035 ±0. 0040. 034 ±0. 0032. 70. 030±0. 005*14.3
16天0. 036±0. 0050. 035 ±0. 0032.80.029±0. 006*17. 1
20天0. 036±0. 0050. 035 ±0. 0032.80. 029 ±0. 006*17. 1
7天a0. 034 ±0. 0040. 035±0. 003-2.90. 030 ±0. 002*16.3
14天a0. 038±0. 0050. 037 ±0. 0052.70. 033 ±0. 003*12.5
*:與空白對照組比較，/^0.05停灌期
結(jié)果滅菌酸奶組與空白對照組大鼠的尿草酸排泄量、腸道中乳酸菌的變化情況相似。與之相比，活菌酸奶組的尿草酸排泄量明顯降低，第12天時(shí)，與空白對照組的差異為
14. 3%，第20天時(shí)達(dá)17. 1%;同時(shí)，腸道乳桿菌數(shù)量明顯增多，第20天時(shí)的差異為60. 7%，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。停喂后的2周內(nèi)，活菌酸奶組的尿草酸排泄量向?qū)φ战M回歸，但仍有12. 5% 16. 3%的差異，腸道乳桿菌數(shù)量亦呈回歸走勢，但仍明顯高于對照組。腸道中乳酸菌數(shù)量的變化與大鼠尿草酸排泄量呈S型曲線關(guān)系，相關(guān)系數(shù)1~=0.86， P〈0.05。灌喂期間三組大鼠體重相互之間沒有明顯差異。
結(jié)論
飲用酸奶可增加大鼠腸道中的乳酸菌數(shù)量，降低尿草酸排泄量，飲用時(shí)間越長，作用越明顯；停飲酸奶后，作用消失緩慢。腸道中乳酸菌量與尿草酸排泄量呈良好的負(fù)相關(guān)。
權(quán)利要求
1. 市售酸奶在預(yù)防尿結(jié)石中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求l所述的酸奶在預(yù)防尿結(jié)石中的應(yīng)用，其中的酸奶中至少含有保加利亞乳 桿菌、嗜酸乳桿菌及嗜熱鏈球菌。
3. 如權(quán)利要求l所述的酸奶在預(yù)防尿結(jié)石中的應(yīng)用，其中酸奶中的乳酸菌含量在106 109 CFU/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及酸奶在預(yù)防尿結(jié)石方面的應(yīng)用。酸奶中的乳酸菌具有分解草酸的作用，其在腸道內(nèi)能降解腸道中的食物源性草酸，減少腸道對草酸的吸收量，因此具有預(yù)防草酸鈣尿結(jié)石的功效，而其在藥品、食品和保健品領(lǐng)域也有重要應(yīng)用。本發(fā)明通過動物實(shí)驗(yàn)，提出了飲用市售酸奶能有效減少尿草酸排泄量，為預(yù)防草酸鈣結(jié)石的復(fù)發(fā)探索一條實(shí)用途徑。由于酸奶兼具多種明顯的保健功能和藥食同源的特性，成本低廉，服食方便，相比藥物患者依從度高，同時(shí)酸奶也無任何副作用，具有更佳的預(yù)防用途潛質(zhì)。
文檔編號A23C9/12GK101485359SQ20081018189
公開日2009年7月22日 申請日期2008年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月22日
發(fā)明者張士青, 欣 顧 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院