專利名稱：：圓斑星鰈性別特異分子標記及遺傳性別鑒定方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于水產生物
技術領域：
中的魚類遺傳性別鑒定和性別控制技術，是一種能在魚類單性育種中應用的魚類遺傳性別鑒定的分子生物學方法。
背景技術：
：我國有著豐富的魚類資源，其中許多魚類在生長速率上存在著性別差異，例如，羅非魚雄性比雌性生長快約40%以上，而圓斑星鰈等海水魚類，雌性個體比雄性個體生長快40%-100%，因此，開展這些魚類遺傳性別^r測和性別控制的研究既有重要的科學意義，又有重大的應用潛力和推廣前景。圓斑星鰈(^^wrra,/eg"e"是我國特有的一種名貴經濟海水魚類，屬于近海冷水性魚類，我國北方沿海均有分布，以黃海、渤海為多。圓斑星鰈由于其味道鮮美，肉質細嫩，營養(yǎng)豐富，深受廣大消費者歡迎，其市場價值極高，養(yǎng)殖前景非常廣闊。盡管近2年來，圓斑星鰈人工育苗技術獲得突破，年產圓斑星鰈苗種近百萬尾，但是，研究表明圓斑星鰈雌性個體和雄性個體在生長速率上存在很大差別，其雌性個體比雄性個體大80-100%。由于雄性個體生長過慢，降低了圓斑星鰈的養(yǎng)殖產量，增加了養(yǎng)殖成本，因而嚴重影響了圓斑星鰈苗種的推廣及養(yǎng)殖產業(yè)的形成，由于難以鑒定圓斑星鰈的遺傳性別，嚴重影響了圓斑星鰈雌核發(fā)育和性別控制研究的進行。有關魚類性別相關分子標記的研究，目前只是在少數幾種魚類上進行過。采用的主要方法包括RAPD、SSR和AFLP等。加拿大西溫哥華實—驗室的Devlin(1994)找到了大鱗大馬哈魚Y染色體特異的DNA片段；匈牙利農業(yè)生物技術中心的Kovacs等(2000)用RAPD掃描非洲鯰魚雌雄基因池，找到兩個雄性性別相關的RAPD標記，一個(CgaYl)大約2.6kb，另一個(CgaY2)458bp,這是首次從鯰魚中找到性別特異的DNA標記。美國新罕布什爾大學的Lee等(2004)用分離集團分析法尋找羅非魚表型性別相連鎖的DNA標記，找到IO個與羅非魚表型性別連鎖的微衛(wèi)星標記。這些標記可以直接用于不同Y染色體等位基因功能的研究和具有一個或者幾個Y染色體拷貝的親魚的鑒定。英國Stirling大學的Ezaz等(2004)用AFLP4支術掃描尼羅羅非魚基因組，找到三個Y染色體連鎖(to/Y425、ft/Y382、to/Y227)和一個X染色體連鎖(ft/X420)的AFLP標記。而有關圓斑星鰈性別特異分子標記以及遺傳性別鑒定的分子生物學技術，目前國內外均未見報道。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是為了篩選出圓斑星鰈性別特異分子標記，建立遺傳性別鑒定的分子生物學方法，為圓斑星鰈性別控制和全雌育種研究提供分子標記和技術方法。本發(fā)明其技術內容如下一、圓斑星鰈性別特異分子標記篩選及其序列；二、圓斑星鰈遺傳性別鑒定方法。一、圓斑星鰈性別特異分子標記篩選及其序列，包括1.圓斑星鰈性別特異分子標記篩選方法；2.圓斑星鰈性別特異分子標記的序列。1.圓斑星鰈性別特異分子標記篩選方法；包括1)、圓斑星鰈鰭條DNA的提取；2)、基因組DNA的AFLP分析；3)、性別特異分子標記的篩選1)、圓斑星鰈鰭條DNA的提取剪取重約10mg鰭條置于600ju1裂解液中勻漿，加蛋白酶K和RNaseA,于55。C水浴消化至澄清。加入600iu1的酚氯仿異戊醇混合物(25:24:1)抽提，充分混勻后離心(12000rpm，10min);吸取上清液再次抽提、離心；最后，用1000jul的冰乙醇沉淀DNA，經70%乙醇洗滌和自然干燥后，用TE溶解，將DNA保存在-20。C備用。所述的裂解液組成為10mMTris-HCl，pH8.0;100mMEDTA，pH8.0;100mMNaCl;0.5%SDS;所述的蛋白酶K終濃度為18-22mg/ml;所述的RNaseA終;農度為95-105jug/ml;所述的基因組DNA的濃度應不低于20ng/ji1，基因組DNA的純度要求OD26。/OD，值為1.76-1.80。2)、基因組DNA的AFLP分析基因組DNA的AFLP分析主要包括如下步驟第一步對DNA才莫板進行酶切，第二步是將特異接頭連接到酶切片段上，第三步是進行預擴增，第四步是進行選擇性擴增，第五步是電泳分析。所述的對DNA模板進行酶切，其方法是先用EcoRI/Msel酶混合物(1.25U/)i1)消化80-110ng模板DNA6小時，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否充分，將充分酶切的DNA溶液置于7(TC孵育15分鐘滅活限制性內切酶。所述的特異接頭連接到酶切片段上，其方法是向上面的酶切反應混合液中加入12.0ju1接頭混合物和0.5ia1T4DNA連接酶，20。C孵育20小時。所述的預擴增，其方法是將上述連接產物稀釋10倍，作為PCR預擴增的模板；PCR引物是3，末端帶有一個選擇性石A^(A或者C)的引物混合物，進行PCR預擴增。所述的選擇性擴增其方法是將預擴增產物稀釋45倍，作為選擇性擴增的模板。用熒光標記的化oRI引物和他el引物進行選擇性PCR擴增，這兩種引物3，末端帶有三個選擇性堿基。向PCR擴增產物中加入適量的變性劑，于94。C變性5分鐘后立即置于水上待用?？偣灿昧?4個引物組合進行選擇性擴增，獲得的PCR產物經94。C變性后用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離。所述的電泳分析，其方法是將變性好的擴增產物用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。電泳條件電壓1500V,功率40W,電流40mA，溫度45°C,時間3.5小時。然后對電泳后產生的DNA條帶進行觀察，照相和分析。3)、性別特異分子標記的篩選總共用64個引物組合(即8個M序列引物分別與8個E序列引物進行組合，這些引物購自美國LifeTechnologies^^司)對20尾圓斑星鰈Ji準性個體和20尾圓斑星鰈雄性個體的基因組DNA進行了AFLP-PCR擴增，通過SAGA軟件分析篩選出兩個引物組合產生了兩條雌性特異的DNA片段，這些片段在雄性個體基因組DNA中不存在其中商品名為M-CAG和E-ACC的引物組合M3-E4擴增出一條533bp的雌性特異DNA片段，命名為VevaF533;商品名為M-CAT和E-AGG的引物組合M4-E8擴增出一條長度為218bp的雌性特異DNA片段，命名為VevaF218。將只在雌性個體中出現(xiàn)，而在雄性個體中不出現(xiàn)的片段作為雌性特異DNA標記。82.圓斑星鰈性別特異分子標記的序列，包括1)圓斑星鰈雌性特異AFLP片段的回收；2)雌性特異AFLP片段的克??；3)雌性特異AFLP標記的序列1)、雌性特異AFLP片段的回收選取能擴增出VevaF533bp、VevaF218bp雌性特異AFLP條帶的引物組合，進行AFLP擴增，擴增產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，用刀片切下分別含有以上三種長度的雌性特異DNA條帶的聚丙烯酰胺凝膠，溶解后回收目的片段備用。2)、AFLP片段的克隆將回收的雌性特異AFLP片段，克隆到pMD18-T載體中，采用標準方法進行連接和轉化，采用常規(guī)PCR法篩選含有目的片段的克隆，用瓊脂糖凝膠電泳檢測產物的長度，符合預期長度的樣品可以視為陽性克隆。3)、性別特異分子標記的序列選取陽性克隆，用ABI3730測序儀進行序列分析。將來自5個陽性克隆的相同長度的雌性特異AFLP片段的核苷^列，用DNAMANVersion4.0進行多序列比對，其同源性分別為99.56%、99.78%，表明各個個體得到的條帶是同一個序列。兩條序列之間也沒有同源性。共有序列同源性比對和相似性搜索用BLAST軟件進行，在GenBank中沒有找到任何同源的序列。二、圓斑星鰈遺傳性別鑒定方法剪取待測圓斑星鰈的鰭條，應用上面建立的鰭條DNA提取方法提取DNA，再用上面篩選出來的能產生圓斑星鰈J難性特異DNA片賴:(VevaF533或VevaF218)的AFLP引物(商品名為M-CAG和E-ACC的引物組合M3-E4,或商品名為M-CAT和E-AGG的引物組合M4-E8)對基因組DNA進行AFLP分牙斤，電泳證實DM條帶的有無，如果M-CAG和E-ACC的引物組合在某一尾魚的基因組DNA中擴增出533bp的特異DNA片^殳，或者M-CAT和E-AGG的引物組合在某一尾魚的基因組DNA中擴增出218bp的雌性特異片段，即可認為這些魚為遺傳上的雌性個體，而沒有該片段的個體則可認為是遺傳上的雄性個體。本發(fā)明與已有技術對比其特點是本發(fā)明采用分子標記技術，以圓斑星鰈為材料首次篩選到雌性特異DNA分子標記，建立了我國鰈類遺傳性別鑒定的分子生物學^J支術。該纟支術具有準確、靈壽文、可靠等優(yōu)點，為魚類性別控制和單性育種開辟了新的技術途徑，適宜在所有養(yǎng)殖魚類上推廣應用，對養(yǎng)殖魚類單性育種具有重要意義和應用價值。附圖il明圖1、圓斑星鰈雌性特異AFLP片段VevaF533電泳圖表示引物組合M3E4的擴增產物；M表示分子量標準；圖2、圓斑星鰈雌性特異AFLP片段VevaF218電泳圖表示引物組合M4E8的擴增產物；M表示分子量標準；圖3、圓斑星鰈雌性特異AFLP片段VevaF533的核苷酸序列"有下劃線的字符"表示選擇性引物序列；圖4、圓斑星鰈雌性特異AFLP片段VevaF218的核苷酸序列"有下劃線的字符"表示選擇性引物序列；圖5、圓斑星鰈雌性個體和雄性個體遺傳性別PCR鑒定結果(M4E8引物組合)M表示分子量標準；"C"表示雌性對照；1-24表示檢測了24尾個體，其中，6-10,15,16,18,19，24共10個個體為雌性，其余14個個體為雄性。具體實施例方式采用現(xiàn)代分子生物學技術，篩選出性別特異的分子標記，采用分子克隆技術，克隆出性別特異的AFLP片段，建立圓斑星鰈遺傳性別鑒定的PCR分析技術，這對于培育圓斑星鰈全雌苗種，進行全雌苗種養(yǎng)殖，提高養(yǎng)殖產量，提高養(yǎng)殖的經濟效益，真正將圓斑星鰈開發(fā)為一個被廣大養(yǎng)殖戶接受的優(yōu)良養(yǎng)殖品種，推動圓斑星鰈養(yǎng)殖產業(yè)的發(fā)展及海水魚類養(yǎng)殖品種的更新?lián)Q代，具有重要的現(xiàn)實意義和巨大的經濟效益。下面通過圓斑星鰈雌性特異AFLP分子標記的篩選及遺傳性別鑒定方法的建立，結合附圖對本發(fā)明的技術內容進行詳細說明本發(fā)明其技術內容如下一、圓斑星鰈性別特異分子標記篩選及其序列；二、圓斑星鰈遺傳性別鑒定方法。一、圓斑星鰈性別特異分子標記篩選及其序列，包括1.圓斑星鰈性別特異分子標記篩選；2.圓斑星鰈性別特異分子標記的序列。1.圓斑星鰈性別特異分子標記篩選；包括1)、圓斑星鰈鰭條DNA提取，2)、基因組DNA的AFLP分析，3)、性別特異分子標記的篩選。1)、圓斑星鰈鰭條DNA的提取剪取重約10mg鰭條置于600m1裂解液(lOmMTris-HC1，pH8.0;100mMEDTA，pH8.0;100mMNaCl;0.5%SDS)中勻漿，加蛋白酶K(終濃度為18-22mg/ml)和RNaseA(終濃度為95-105jug/ml)，于55。C水浴消化至澄清。加入600jul的酚氯仿異戊醇混合物(25:24:1)抽提，充分混勻后離心(12000rpm,10min);吸取上清液再次抽^是、離心；最后，用1000ju1的水乙醇沉淀DNA,經70%乙醇洗滌和自然干燥后，用TE溶解，將DNA保存在-20。C備用?；蚪MDNA的濃度應不低于20ng/ju1，基因組DNA的純度要求0026。/0028。值為1.8左右。2)、基因組DNA的AFLP分析主要包括如下步驟第一步對DNA模板進行酶切，第二步是將特異接頭連接到酶切片段上，第三步是進行預擴增，第四步是進行選擇性擴增，第五步是電泳分析。(1)、對DNA模板進行酶切用1.0ia1fcoRI/v^el酶混合物(1.25U/ju1)消化80-110ng模板DNA6小時，再用ly。的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否充分，然后將充分酶切的DNA溶液于7(TC孵育15分鐘滅活限制性內切酶。(2)、將特異接頭連接到酶切片段上向上面的酶切反應混合液中加入12.0ju1接頭混合物和0.5m1T4DNA連接酶，2(TC孵育20小時，保證接頭充分連接。(3)、預擴增將連接產物稀釋10倍，作為預擴增的模板；預擴增引物是3，末端帶有一個選4奪性石絲(A或者C)的引物混合物。PCR反應條件為92-94°C，30秒；54-56°C,1分鐘；70-72°C，1分鐘。20個循環(huán)后，4。C待用。(4)、選擇性擴增將預擴增產物稀釋45倍，作為選擇性擴增的模板。用含酶切位點#"1的引物和含酶切位點fcoRI的引物進行擴增，這兩種引物3，末端帶有三個選擇性石成基。PCR反應分為三步第一步進行1個循環(huán)92-94°C，30秒；63-65°C，30秒；70-72°C,1分鐘；第二步進4亍12個循環(huán)92-94°C,30秒；65-54°C,30秒；70-72°C,1分鐘；第三步進行23個循環(huán)——92-94°C,30秒；54-56°C，30秒；70-72°C，1分鐘。擴增產物加入適量的變性劑，94'C變性5分鐘，立即置于水上。(5)、電泳分析將變性好的擴增產物用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。電泳條件電壓1500V,功率40W,電流40mA,溫度45。C，時間3.5小時?？偣灿昧?4個引物組合對20尾圓斑星鰈雌性個體和20尾圓斑星鰈雄性個體的基因組DNA進行了AFLP分析，用SAGA軟件分析電泳圖譜后，篩選出產生特異片段的引物組合兩個，這兩個引物組合共產生了兩條雌性特異的DNA片段。3)性別特異分子標記的篩選總共用64個引物組合(即8個M序列引物分別與8個E序列引物進行組合，這些引物購自美國LifeTechnologies/>司)對20尾圓斑星鰈jt準性個體和20尾圓斑星鰈i,性個體的基因組DNA進^亍了AFLP-PCR擴增，這64個引物組合的核苷酸序列見表1。20尾雌性個體為性成熟的雌性親魚，20尾雄性個體為能擠得出精液的雄性親魚。表l64個AFLP引物組合的核苷^列<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>通過SAGA軟件分析篩選出兩個引物組合產生了兩條雌性特異的DNA片段(圖1、圖2),這些片段在雄性個體基因組DM中不存在其中商品名為M-CAG和E-ACC的引物組合M3-E4擴增出一條533bp的雌性特異DNA片段，命名為VevaF533;商品名為M-CAT和E-AGG的引物組合M4-E8擴增出一條長度為218bp的雌性特異DNA片段，命名為VevaF218。將只在雌性個體中出現(xiàn)，而在雄性個體中不出現(xiàn)的片段作為雌性特異DNA標記，即可用于遺傳性別鑒定。2、圓斑星鰈性別特異分子標記的序列包括1)、雌性特異AFLP片段的回收；2)、AFLP片段的克隆；3)、雌性特異分子標記的序列。1)、雌性特異AFLP片段的回收根據雌性特異AFLP標記的篩選結果，選取能分別擴增533bp、218bp雌性特異AFLP條帶的引物組合，進行AFLP擴增，然后進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，分別獲得533bp、218bp的雌性特異AFLP條帶，用無污染的刀片切下含有目的DNA片段的聚丙烯酰胺凝膠，力口20iul超純水，50。C溶解約1.5小時，得到了微量的DNA,回收目的片段備用。2)、AFLP片段的克隆采用商品化的pMD18-T連接試劑盒將回收的雌性特異AFLP片段，克隆到PMD18-T載體中，采用標準的CaCl2轉化方法將連接產物轉化感受態(tài)細菌，將轉化產物涂布LB培養(yǎng)m,37。C過夜培養(yǎng)。次日，用滅菌的牙簽挑取單菌落，投入1mlLB(含氨卞青霉素)液體培養(yǎng)基中，37°C,250rpm過夜培養(yǎng)。然后采用pcr法篩選目的克隆，從每個樣品中取1m1菌液做為模板，用所對應的選擇性擴增的引物和反應程序進行擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測產物的長度，符合預期長度的樣品可以視為陽性克隆。3)、雌性特異分子標記的序列選取陽性克隆，用ABI3730測序儀進行序列分析。將來自5個陽性克隆的相同長度的雌性特異AFLP片段的核苷酸序列，用DNAMANVersion4.0進行多序列比對，其同源性分別為99.56%、99.78%，表明各個個體得到的條帶是同一個序列。兩條序列之間也沒有同源性。共有序列同源性比對和相似性搜索用BLAST軟件進行，在GenBank中沒有找到4壬何同源的序列。圓斑星鰈雌性特異AFLP片段的核苷酸序列(示于圖3、圖4)。二、遺傳性別鑒定方法應用上面建立的鰭條DNA提取技術提取DNA,這種方法不用殺魚，為非損傷性技術，適于推廣應用；然后再用上面篩選出來的能產生圓斑星鰈雌性特異DM片段(VevaF533或VevaF218)的AFLP引物(商品名為M-CAG和E-ACC的引物組合M3-E4或商品名為M-CAT和E-AGG的引物組合M4-E8，這兩個引物組合中的任意一個組合)對基因組DNA進行AFLP分析，電泳證實DNA條帶的有無，如果M-CAG和E-ACC的引物組合M3-E4在某一尾魚的基因組DNA中擴增出533bp的特異DNA片段，或者M-CAT和E-AGG的引物組合M4-E8在某一尾魚的基因組DNA中擴增出218bp的Ji準性特異片^:，即可認為這些魚為遺傳上的雌性個體，而沒有該片段的個體則可認為是遺傳上的雄性個體。通過這種方法就可以鑒定圓斑星鰈的遺傳性別，為圓斑星鰈性別控制和全雌育種研究提供技術手^更。這種方法準確、可靠，在圓斑星鰈性別控制和單性育種中具有重要應用價值(圖5)。14序列表<110>中國水產科學研究院黃海水產研究所<120>圓斑星鰈性別特異分子標記及遺傳性別鑒定方法<160>1<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>533、218<212〉DNA<213>圓斑星鰈(Veraspervariegates)<400>1gactgcgtaccaattcaccctccttttagctcagttttggtctccaccagcUgtg柳a60agatatttgtctctttagctgctacgtgttctacttttttttagcagctcattgtttgcg120tgtcttctggagctgg織ggtcgtgcacagcgggtttttatctttactgaaaagcagct180gcctgccgctgctggc"cggcgttgatgagagggctgagactcgtgctgagactcgtgc240gcacacagatggtctgctcgtgcaaggagtgaaacactgaagtgatcctctgcagagaag300ccttctctctcactacagggUataaaaccattacgatgccnggtgc"360gcacacctggctttcaaacggagaggcaggtggatttattgcatgtcactccc"aatct420gc柳atccgaaggtgaggcacacgatctcagggctggagtgaaaagcatcagctgttgg480ctttttteatUatctteatteatatgeagaaagctgttactcaggactcate533gatgagtcctgagtaacatgctaacaggctcgtgttaacttccgttgtgtggatgg"tc60C3tCtgttCggettgeattccaactaaaggaggctatcagcgagctaacg"gcaggagc120UacagcgagcUacggatacacggcagctacaagacaaaccgagctaaxcgagctuag180gctagataaacacattacacctg^ttggtaegcagtc218權利要求1、一種圓斑星鰈性別特異分子標記篩選方法及其序列，其特征在于它技術內容如下1)、圓斑星鰈性別特異分子標記篩選；2)、圓斑星鰈性別特異分子標記克隆及其序列；1)、圓斑星鰈性別特異分子標記篩選方法，包括(1)、圓斑星鰈鰭條DNA的提?。?2)、基因組DNA的AFLP分析；(3)、性別特異分子標記的篩選(1)、圓斑星鰈鰭條DNA的提取剪取重約10mg鰭條置于600μl裂解液中勻漿，加終濃度為18-22mg/ml的蛋白酶K和終濃度為95-105μg/ml的RNaseA，于55℃水浴消化至澄清；加入600μl的酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1混合物抽提，充分混勻后離心12000rpm，10min；吸取上清液再次抽提、離心；最后，用1000μl的冰乙醇沉淀DNA，經70％乙醇洗滌和自然干燥后，用TE溶解，將DNA保存在-20℃?zhèn)溆?；所述的裂解液組成為10mMTris-HCl，pH8.0；100mMEDTA，pH8.0；100mMNaCl；0.5％SDS；所述的基因組DNA的濃度應不低于20ng/μl，基因組DNA的純度要求OD260/OD280值為1.76-1.80；(2)、基因組DNA的AFLP分析基因組DNA的AFLP分析主要包括如下步驟第一步對DNA模板進行酶切，第二步是將特異接頭連接到酶切片段上，第三步是進行預擴增，第四步是進行選擇性擴增，第五步是電泳分析；所述的對DNA模板進行酶切，其方法是先用EcoRI/MseI酶混合物(1.25U/μl)消化80-110ng模板DNA6小時，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否充分，將充分酶切的DNA溶液置于70℃孵育15分鐘滅活限制性內切酶；所述的特異接頭連接到酶切片段上，其方法是向上面的酶切反應混合液中加入12.0μl接頭混合物和0.5μlT4DNA連接酶，20℃孵育20小時；所述的預擴增，其方法是將上述連接產物稀釋10倍，作為PCR預擴增的模板；PCR引物是3’末端帶有一個選擇性堿基(A或者C)的引物混合物，進行PCR預擴增；所述的選擇性擴增其方法是將預擴增產物稀釋45倍，作為選擇性擴增的模板；用熒光標記的EcoRI引物和MseI引物進行選擇性PCR擴增，這兩種引物3’末端帶有三個選擇性堿基；向PCR擴增產物中加入適量的變性劑，于94℃變性5分鐘后立即置于冰上待用；總共用了64個引物組合進行選擇性擴增，獲得的PCR產物經94℃變性后用6％的變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離；所述的電泳分析，其方法是將變性好的擴增產物用6％的變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳；電泳條件電壓1500V，功率40W，電流40mA，溫度45℃，時間3.5小時；然后對電泳后產生的DNA條帶進行觀察，照相和分析；2、一種圓斑星鰈遺傳性別鑒定方法，其特征在于它的方法是:剪取待測圓斑星鰈的鰭條，應用上面建立的鰭條DNA提取方法提取DNA，再用上面篩選出來的M-CAG和E-ACC的引物組合M3-E4，或M-CAT和E-AGG的引物組合M4-E8對基因組DNA進行AFLP分析，電泳證實DNA條帶的有無，如果M-CAG和E-ACC的引物組合在某一尾魚的基因組DNA中擴增出533bp的雌性特異DNA片革爻，或者M-CAT和E-AGG的引物組合在某一尾魚的基因組DNA中擴增出218bp的雌性特異DNA片段，即可認為這些魚為全文摘要一種圓斑星鰈性別特異分子標記及遺傳性別檢測方法，它的方法是鰭條DNA的提取、基因組DNA的AFLP分析、性別特異AFLP標記的篩選及其序列，以及遺傳性別鑒定方法的建立。本發(fā)明建立了圓斑星鰈鰭條DNA提取方法和AFLP分析技術，篩選出分子量分別為533bp和218bp的2個雌性特異AFLP分子標記，獲得了這2個AFLP標記的核苷酸序列，創(chuàng)建了圓斑星鰈遺傳性別鑒定的分子標記技術。本發(fā)明首次篩選到圓斑星鰈雌性特異AFLP分子標記，建立了圓斑星鰈遺傳性別鑒定的分子標記技術。本發(fā)明方法具有先進、準確、可靠的特點，在圓斑星鰈性別控制和全雌苗種生產中具有重要應用價值，同時在其它魚類遺傳性別鑒定和性別控制研究中也具有廣闊應用前景。文檔編號C12Q1/68GK101429557SQ20081018227公開日2009年5月13日申請日期2008年11月26日優(yōu)先權日2008年11月26日發(fā)明者田永勝,陳松林,馬洪雨申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所