專利名稱：從食品樣品中簡易提取細(xì)菌dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌基因組DNA的提取方法，尤其涉及從食品樣品中簡易提取適 用于致病菌檢測的DNA的方法。
背景技術(shù)：
自2004年4月安徽阜陽發(fā)生"劣質(zhì)奶粉"事件以來，奶粉安全問題成為社會(huì)各界 廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)。奶粉的主要消費(fèi)群體是嬰幼兒、兒童、老人或病人等免疫力較低的人群， 尤其嬰幼兒是奶粉的重要消費(fèi)群體，因此，奶粉的安全性尤為重要，一直受到國務(wù)院、職能 部門和各級(jí)政府的高度重視。2002年科技部下達(dá)了"十五"國家重大科技奶業(yè)專項(xiàng)，對(duì)乳制 品中幾種常見致病菌進(jìn)行了快速檢測方法的研究。由此可見，研究并建立快速準(zhǔn)確檢測奶 粉中的致病菌的方法以保障奶制品的安全非常必要。 國標(biāo)中檢測食品中致病菌的方法多是采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定的方法，報(bào) 告檢驗(yàn)結(jié)果大致需5 7天，加之檢驗(yàn)方法繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不僅成為檢驗(yàn)部門的一項(xiàng)沉重 負(fù)擔(dān)，而且越來越不能滿足食品安全和日益發(fā)展的國際貿(mào)易的需要。另外，在檢驗(yàn)環(huán)境中， 也很容易造成環(huán)境和/或標(biāo)本的污染。再者，傳統(tǒng)方法還存在培養(yǎng)條件苛刻或某些致病菌 難以培養(yǎng)的問題。 以PCR為基礎(chǔ)的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)為病原微生物的檢測開辟了一條快速靈敏 的途徑。分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于微生物檢測首先需要用PCR方法擴(kuò)增臨床樣品中病原體的 靶核酸序列，然后用其它多種分子生物學(xué)手段對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，從而鑒定病原體的有 無和種類。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析的常用方法包括電泳、雜交等。以DNA雜交為基礎(chǔ)的基因 芯片技術(shù)，更具有敏感性高、特異性強(qiáng)、可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模集成化等優(yōu)點(diǎn)。 分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于食品致病微生物檢測的核心之一是樣品中病原體DNA的 有效提取。食品中可能的致病菌既有G+菌，也有G—菌，且食品種類復(fù)雜，成分多樣，含有豐富 的蛋白、脂肪、維生素、微量元素等，某些成分有強(qiáng)烈抑制PCR反應(yīng)的作用，如果在細(xì)菌DNA 提取過程中不能有效去除這些抑制成分，將會(huì)對(duì)以后的PCR反應(yīng)造成很大問題。
為了克服上述缺陷，目前人們已采取了多種方法，例如對(duì)標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理并使用 柱層析方法分離DNA，以及P. Cremonesi等人的方法(J. DairySci， 89 (2006) :163-169)。但 這些方法皆因成本較高或試劑有毒且易于造成DNA的損傷等問題，而難以在基層醫(yī)療單位 的實(shí)驗(yàn)室廣泛使用。 因此，本領(lǐng)域有必要提供一種新的食品樣品中細(xì)菌的基因組DNA的方法，以便能 夠以較低的成本，簡單、快速地從食品樣品中提取高質(zhì)量的總DNA，使其適應(yīng)檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域 檢測食品中致病菌的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種操作簡便、易行的從食品 樣品中提取高質(zhì)量細(xì)菌基因組DNA的方法，以適應(yīng)檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域快速檢測食品中致病菌的需要。 本發(fā)明提供的從食品樣品中提取細(xì)菌基因組DNA的方法，主要包含步驟 1)以含有細(xì)菌的食品為樣品，過夜培養(yǎng)，離心富集菌體，然后用無菌水充分洗滌，
得沉淀物； 2)使用含KC1， Tris-HCl， MgCl2和蛋白酶K的裂解液重懸步驟1)所得的沉淀物， 得重懸液； 3)將步驟2)所得的重懸液進(jìn)行第一次水浴，裂解細(xì)菌細(xì)胞，然后再經(jīng)第二次水 ??； 4)將步驟3)的所得物進(jìn)行離心，獲得含所述細(xì)菌基因組DNA的中層上清；
5)收集步驟4)的含所述細(xì)菌基因組DNA的中層上清，烘干，即制得所述細(xì)菌基因 組DNA。
本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，步驟1)中樣品可以為嬰兒配方奶粉，該嬰兒配方奶粉中 含有沙門氏菌、志賀氏菌、化膿性鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、金黃色葡萄球 菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、單增李斯特氏菌、阪崎腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏 菌、弗氏檸檬酸桿菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、副溶血弧菌中的至少一種致病菌。
本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，步驟2)所述的裂解液還可以包含TritonX-lOO， NP40或 Tween 20中的至少一種。優(yōu)選地，步驟2)所述的裂解液包含KC1，Tris_HCl，MgCl2，Triton X-IOO， NP40， Tween 20和蛋白酶K ;具體地可以為裂解液包含50mM KCl，10mM Tris-HCl， 2. 5mM MgCl2，0. 1%的Triton X-IOO，O. 5% NP40，0. 5% Tween 20禾P 0. lmg/ml的蛋白酶K ; 其中Tris-HCl的pH值優(yōu)選為9. 0。 本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，步驟3)中第一次水浴的溫度為40 60°C ，優(yōu)選為45 55t:，更佳地為50°C。 本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，步驟3)中第一次水浴的時(shí)間為0 120分鐘，較佳地為 20 100分鐘，更佳地為40 80分鐘，最合適為60分鐘；第二次水浴的溫度優(yōu)選為100°C 。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所述的方法其去除抑制劑的效果明顯，其所使用 的裂解液可有效破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，去除蛋白并去除抑劑成分；靈敏度高，使用本發(fā)明的方 法，可對(duì)少至102cfu的樣品進(jìn)行處理，而獲得穩(wěn)定的PCR擴(kuò)增效果；操作簡便，適用于實(shí)際 檢驗(yàn)；所需試劑均為常規(guī)試劑，無毒且費(fèi)用低；而且對(duì)DNA的損傷很小，提高了 PCR的穩(wěn)定 性和分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。 下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說明，而不是限制本發(fā)明。在不違背本發(fā)明的精神和 原則前提下，對(duì)發(fā)明個(gè)別技術(shù)步驟進(jìn)行的任何改動(dòng)和改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍 內(nèi)。


圖1A-圖IB為經(jīng)裂解液溶液處理奶粉樣品中不同細(xì)菌后所得DNA的瓊脂糖電泳 結(jié)果及以其為模板的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果。其中l(wèi)-15分別為沙門氏菌、志賀氏菌、 化膿性鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、單增李斯 特氏菌、阪崎腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、普通變形 桿菌、奇異變形桿菌、副溶血弧菌，M為DL2000Marker， N為負(fù)對(duì)照。
圖2為對(duì)不同食品樣品(豬肉、雞蛋)經(jīng)裂解液處理得到的DNA及以其為模板的 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果。1為將金黃色葡萄球菌摻入的雞蛋樣品中，2為將金黃色葡萄 球菌摻入的豬肉樣品中，3為將阪崎腸桿菌摻入的雞蛋樣品中，4為將阪崎腸桿菌摻入的豬 肉樣品中，M為DL2000Marker。 圖3A-圖3B為裂解液不同時(shí)間下的裂解效果梯度試驗(yàn)。其中3A為革蘭氏陽性菌 的結(jié)果，3B為革蘭氏陰性菌的結(jié)果，M為DL2000Marker。 圖4A-圖4B為裂解液在不同溫度下裂解效果的梯度試驗(yàn)。其中4A為革蘭氏陽性 菌的結(jié)果，4B為革蘭氏陰性菌的結(jié)果，M為DL2000Marker。 圖5為使用裂解液提取基因組與使用商品化試劑盒提取基因組的對(duì)比實(shí)驗(yàn)。其中 G+(裂)為裂解液提取的革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌的結(jié)果，G-(裂)為裂解液提取的 革蘭氏陰性細(xì)菌阪崎腸桿菌的結(jié)果，G+(kit)為基因組提取試劑盒提取革蘭氏陽性細(xì)菌金 黃色葡萄球菌的結(jié)果，G-(kit)為基因組提取試劑盒提取的革蘭氏陰性細(xì)菌阪崎腸桿菌的 結(jié)果，M為DL2000Marker。
具體實(shí)施例方式
下面通過最佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。以下實(shí)施例僅僅是用于說明 而不是限制本發(fā)明。 實(shí)施例1提取嬰兒配方奶粉樣品中的細(xì)菌總DNA 提取嬰兒配方奶粉樣品中的細(xì)菌總DNA的完整步驟包括 1)取1. 5ml的含菌的嬰兒奶粉過夜培養(yǎng)物加入到1. 5ml滅菌離心管中，8000rpm 離心5分鐘收集菌體。 2)加入700 ii 1的無菌水洗滌菌體2次 3)加入100ii 1裂解液(50mM KCl，10mM Tris-HCl (pH9. 0) ， 2. 5mMMgCl2， 0. 1 %的 Triton X-IOO，O. 5% NP40，0. 5% Tween 20和0. lmg/ml的蛋白酶K)重懸菌體。
4)將上述菌懸液5(TC水浴1小時(shí)后再IO(TC水浴15分鐘。 5)16，000Xg離心4分鐘，取中層上清20iil轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1. 5ml滅菌離心管 中，進(jìn)行后續(xù)PCR反應(yīng)或-201:儲(chǔ)存。 實(shí)施例2裂解溶液處理不同細(xì)菌的奶粉樣品實(shí)驗(yàn) 將沙門氏菌、志賀氏菌、化膿性鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、金黃色葡 萄球菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、單增李斯特氏菌、阪崎腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森 氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、副溶血弧菌分別攙入含嬰兒配方奶 粉的培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，按照上述實(shí)施例的提取嬰兒配方奶粉樣品中細(xì)菌中總DNA的 方法操作，最終所得DNA的瓊脂糖電泳結(jié)果及以其為模板的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果如 圖1A和圖1B所示，其中1-15分別為上述15種細(xì)菌，M為DL2000Marker， N為負(fù)對(duì)照。從 所述圖中可以看出該提取方法可以提取出高質(zhì)量的、對(duì)PCR無影響的基因組DNA。
實(shí)施例3裂解液處理不同食品樣品的實(shí)驗(yàn) 將革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)、革蘭氏陰性菌(坂崎桿菌)分別攙入雞蛋、 豬肉食品中，過夜培養(yǎng)后，分別參照上述實(shí)施例的提取嬰兒配方奶粉樣品中細(xì)菌DNA的方 法操作，所提取的DNA和以其為模板的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果如圖2所示，其中的1為將金黃色葡萄球菌摻入的雞蛋樣品中，2為將金黃色葡萄球菌摻入的豬肉樣品中，3為將阪 崎腸桿菌摻入的雞蛋樣品中，4為將阪崎腸桿菌摻入的豬肉樣品中，M為DL2000Marker。從 中可以看出該提取方法可以從不同的食品中提取出高質(zhì)量的、對(duì)PCR無影響的基因組DNA。
實(shí)施例4裂解液不同時(shí)間下裂解效果的實(shí)驗(yàn) 將革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)、革蘭氏陰性菌(坂崎桿菌)分別過夜培養(yǎng) 后，按照上述實(shí)施例的提取嬰兒配方奶粉樣品中細(xì)菌中總DNA的方法操作，5(TC水浴時(shí)間 分別為0分鐘、20分鐘、40分鐘、60分鐘、80分鐘、100分鐘、120分鐘，最終所得DNA的瓊脂 糖電泳結(jié)果及以其為模板的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果如圖3A和3B所示，其中3A為革蘭 氏陽性菌的結(jié)果，3B為革蘭氏陰性菌的結(jié)果，M為DL2000Marker。從所述圖中可以看出，不 小于60分鐘的作用時(shí)間，效果較好，優(yōu)選時(shí)間為60分鐘。
實(shí)施例5裂解液不同溫度下裂解效果的實(shí)驗(yàn) 將革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)、革蘭氏陰性菌(坂崎桿菌)分別過夜培養(yǎng) 后，按照上述實(shí)施例的提取嬰兒配方奶粉樣品中細(xì)菌中總DNA的方法操作，水浴時(shí)間分別 為4(TC、45t:、5(rC、55t:、6(rC，最終所得DNA的瓊脂糖電泳結(jié)果及以其為模板的PCR產(chǎn)物 的瓊脂糖電泳結(jié)果如圖3A和3B所示，其中4A為革蘭氏陽性菌的結(jié)果，4B為革蘭氏陰性菌 的結(jié)果，M為DL2000Marker。從所述圖中可以看出，5(TC或更高的作用溫度，效果較好，但由 于成分中有蛋白酶K，過高溫度會(huì)影響其活性，所以最佳溫度為5(TC。
實(shí)施例6裂解液與商品化基因組提取試劑盒的對(duì)比實(shí)驗(yàn) 將革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)、革蘭氏陰性菌(坂崎桿菌)分別過夜培養(yǎng) 后，按照上述實(shí)施例的提取嬰兒配方奶粉樣品中細(xì)菌中總DNA的方法操作，同時(shí)按照基因 組提取試劑盒(北京天根公司)使用說明書的操作方法提取基因組，最終所得DNA的瓊脂 糖電泳結(jié)果及以其為模板的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果如圖5所示，其中G+(裂)為裂 解液提取的革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌的結(jié)果，G-(裂)為裂解液提取的革蘭氏陰性 細(xì)菌阪崎腸桿菌的結(jié)果，G+(kit)為基因組提取試劑盒提取革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球 菌的結(jié)果，G-(kit)為基因組提取試劑盒提取的革蘭氏陰性細(xì)菌阪崎腸桿菌的結(jié)果，M為 DL2000Marker。從所述圖中可以看出，該裂解液提取的基因組的擴(kuò)增效果與試劑盒提取效 果相當(dāng)。
權(quán)利要求
一種從食品樣品中提取細(xì)菌基因組DNA的方法，其特征在于包含步驟1)以含有細(xì)菌的食品為樣品，過夜培養(yǎng)，離心富集菌體，然后用無菌水充分洗滌，得沉淀物；2)使用含KCl，Tris-HCl，MgCl2和蛋白酶K的裂解液重懸步驟1)所得的沉淀物，得重懸液；3)將步驟2)所得的重懸液進(jìn)行第一次水浴，裂解細(xì)菌細(xì)胞，然后再經(jīng)第二次水浴；4)將步驟3)的所得物進(jìn)行離心，獲得含所述細(xì)菌基因組DNA的中層上清；5)收集步驟4)的含所述細(xì)菌基因組DNA的中層上清，烘干，即制得所述細(xì)菌基因組DNA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟l)中樣品為嬰兒配方奶粉，該嬰兒配 方奶粉中含有沙門氏菌、志賀氏菌、化膿性鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、金黃色 葡萄球菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、單增李斯特氏菌、阪崎腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、副溶血弧菌中的至少一種致病菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)所述的裂解液包含Triton X-IOO， NP40或Tween 20中的至少一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟2)所述的裂解液包含KCl，Tris-HCl， MgCl2， Triton X_100， NP40， Tween 20和蛋白酶K。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟2)所述的裂解液包含50mM KCl，10mM Tris-HC1，2. 5mM MgCl2， 0. 1 %的Triton X-IOO，O. 5% NP40，0. 5% Tween 20禾P0. lmg/ml的 蛋白酶K。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟2)所述的裂解液中Tris-HCl的pH值 為9.0。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟3)中第一次水浴的溫度為40 6(TC。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于步驟3)中第一次水浴的溫度為45 55t:。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于步驟3)中第一次水浴的溫度為5(TC。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟3)中第一次水浴的時(shí)間為0 120 分鐘。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于步驟3)中第一次水浴的時(shí)間為20 100 分鐘。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于步驟3)中第一次水浴的時(shí)間為40 80 分鐘。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于步驟3)中第一次水浴的時(shí)間為60分鐘。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟3)中第二次水浴的溫度為IO(TC。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從食品樣品中簡易提取細(xì)菌基因組DNA的方法，其主要包含步驟以含有細(xì)菌的食品為樣品，過夜培養(yǎng)，離心富集菌體，然后用無菌水充分洗滌，得沉淀物；使用含KCl，Tris-HCl，MgCl2和蛋白酶K的裂解液重懸上述的沉淀物，得重懸液；對(duì)所得的重懸液進(jìn)行第一次水浴，裂解細(xì)菌細(xì)胞，然后再經(jīng)第二次水??；將所得物進(jìn)行離心，獲得含所述細(xì)菌基因組DNA的中層上清；收集上清，烘干，即制得所述細(xì)菌基因組DNA。使用本發(fā)明的方法，可充分裂解革蘭氏陽性和革蘭氏陰性(G+、G-)菌的細(xì)胞壁，同時(shí)由于裂解液中加入了蛋白酶K，并加熱煮沸，使得蛋白凝固變性，提高了DNA的提取效率和純度。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101748175SQ20081018255
公開日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2008年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月5日
發(fā)明者曹勃陽, 楊斌, 王敏, 王磊 申請(qǐng)人:天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司