專利名稱：：一種快速檢測啤酒厭氧菌的培養(yǎng)基及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于啤酒
技術領域：
，更詳細地說，涉及啤酒生產過程中一種快速檢測啤酒中有害厭氧菌的培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術：
：啤酒釀造是建立在利用啤酒酵母的發(fā)酵和控制有害微生物的污染基礎上的。我們需要的是只有培養(yǎng)酵母參與的純種發(fā)酵，但在整個啤酒釀造過程中，釀造設備、空氣、釀造用水等諸多因素都有可能導致有害微生物進入麥汁或發(fā)酵液中。如果有害微生物大量生長繁殖，就會污染麥汁和啤酒。污染的細菌會引起啤酒酸敗、異臭、粘稠和出現渾濁，嚴重地影啤酒的質量，會給消費者和啤酒廠家造成傷害和損失。啤酒對于絕大多數微生物都是營養(yǎng)貧乏的、甚至是惡劣的培養(yǎng)基。酒精含量在通常為4%-5%(w/w);pH值波動在3.8-4.7，低于多數細菌可以生長的極限；而且二氧化碳含量高(約0.5%w/V)，特別低的溶解氧(<0.lmg/L)使啤酒幾乎成為厭氧環(huán)境。只有少數細菌可以在這種惡劣的環(huán)境下生長，導致啤酒腐敗。這些細菌既有革蘭氏陽性也有陰性菌。幾乎所有的革蘭氏陽性菌都是乳酸菌，它們構成了革蘭氏陽性菌中龐大的一群。只有一部分乳酸菌會造成啤酒腐敗，啤酒廠危害最大的多屬于乳桿菌屬和片球菌屬。德國在1980-1990年間，這兩種菌大約引起了58%-88%的微生物腐敗事故。而在捷克啤酒廠，發(fā)現的啤酒有害菌都是乳酸菌。乳酸菌對啤酒造成腐敗，引起啤酒混濁，黏度增加，產生不愉快的酸味及其它非典型氣味。為了更好的監(jiān)控啤酒生產過程的微生物狀況，對啤酒厭氧菌特別是乳酸桿菌屬和片球菌屬的快速檢測至關重要。目前商品化選擇性培養(yǎng)基較多，主要有NBB、UBA、MRS、Raka-Ray、VLB-S7等，其中MRS培養(yǎng)基應用較廣，并被三家主要釀造協(xié)會(EBC-歐洲啤酒協(xié)會、ASBC-美國釀造化學家協(xié)會、BCOJ-日本釀造協(xié)會)所推薦；其它培養(yǎng)基如NBB-A，BMB的培養(yǎng)效果也比較好，培養(yǎng)檢測時間大多集中在5-14天。現有使用的培養(yǎng)基，針對啤酒有害厭氧菌培養(yǎng)時間需耗時7天，而且對于生長需求較為復雜的片球菌屬(Pediococcus.spp)及兩株乳桿菌(Lactobacilluslindneri禾口Lactobacillusparacollinoides)來說，即使培養(yǎng)7天效果也不是很理想，菌落過小，只有針尖大小，不利于觀察、計數。為了更及時地監(jiān)控啤酒生產過程的微生物狀況，啤酒行業(yè)急欲開發(fā)一種針對常見啤酒有害厭氧菌(主要包括乳酸桿菌屬和片球菌屬)培養(yǎng)速度更快、效果更好的啤酒有害菌培養(yǎng)基。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的，就在于克服上述缺點和不足，提供培養(yǎng)速度快，利于觀察和計數的一種快速檢測啤酒中有害厭氧菌的培養(yǎng)基及其制備方法?！N快速檢測啤酒中有害厭氧菌的培養(yǎng)基，其液體配方如下1L的添加量(g):碳源物質果糖(fructose)7.5g，右旋葡萄糖(dextrose)10.3-10.4g，麥芽糖(maltose)22.5g，乳糖(lactose)3.3-3.4g，L_蘋果酸(L-malicacid)O.4g;氮源物質元蛋白胨(proteosep印toneNo3)5g，牛肉提取物(beefextract)6.6-6.7g，特殊蛋白胨(p印tonespecial)12.5g，肝浸粉(liverconcentrate)1.5g;表面活性劑吐溫80;氨基酸鹽類L-半胱氨酸鹽酸鹽(L-CysteineHCL)1.25g;B族維生素及其他微量元素類物質酵母浸出物(YeastExtract)3.3_3.4g，番茄汁(tomatojuice)6g或含有等量番茄汁的番茄汁培養(yǎng)基；抑制非啤酒有害厭氧菌類物質乙酸鈉(sodiumacetate)3.3-3.4g;加快各種啤酒有害厭氧菌生長類物質胞啶(cytidine)O.lg，脫氧胸腺嘧啶(thymidine)0.2g;無機營養(yǎng)物質硫酸錳(manganesesulfate)0.025g，硫酸鎂(magnesiumsulfate)0.05g、擰樣酸銨(ammoniumcitrate)lg;其他250ml的清酒或除氣啤酒，750ml的水。其中元蛋白胨可替換為牛肉蛋白胨，或胰蛋白胨(tryptone)，或多蛋白胨(polyp印tone)或腺化牛奶(peptonizedmilk)?！N快速檢測啤酒中有害厭氧菌的培養(yǎng)基，其固體配方如下1L的添加量(g):在上述液體配方中添加瓊脂(Agar)15g。上述快速檢測啤酒中有害厭氧菌的培養(yǎng)基的制備方法，包括下述步驟(1)將上述配方成分列表里成分混合，置25%清酒或者除氣啤酒和75%的水的溶劑中加熱溶解；(2)利用1M的Na0H將pH值調節(jié)到5.8-6.2;(3)如果檢測含有酵母的樣品需加入10卯m的放線菌酮；(4)118t:高壓滅菌15分鐘，可暫存于2-l(TC無菌保藏備用。固體培養(yǎng)基的制備方法，在步驟(2)后加入瓊脂，加熱攪拌使瓊脂溶解。在步驟(4)后液體培養(yǎng)基按需求分裝到無菌試管后，塞上無菌棉塞；固體培養(yǎng)基倒平板。上述培養(yǎng)基的培養(yǎng)置于厭氧培養(yǎng)箱或者厭氧罐3(TC培養(yǎng)。對于固體培養(yǎng)基48-72小時內即可觀察、計數；對于液體培養(yǎng)基，48小時內即可觀察、測濁度。本發(fā)明所述的啤酒有害厭氧菌快速培養(yǎng)基是采用無機營養(yǎng)成分、有機營養(yǎng)成分、碳水化合物、生長剌激物質、天然提取物、表面活性劑通過混合調配、分裝、滅菌等步驟配制而成。其中碳源種類豐富多樣，包括屬于糖類的葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖和屬于有機酸的L-蘋果酸，可以滿足厭氧菌對各類碳源的需求；特殊蛋白胨與牛肝浸粉可以提供成分更豐富的氮源；吐溫80，屬于表面活性劑，可以幫助微生物更有效的接觸和吸收營養(yǎng)物質；半胱氨酸鹽酸鹽，一種有助于乳桿菌屬快速生長的氨基酸鹽類；酵母浸出物和番茄汁，為乳酸菌的生長提供必不可少的B族維生素及其他微量元素；乙酸鈉，可以抑制非啤酒有害厭氧菌的增殖，提高培養(yǎng)基的選擇度；胞啶和脫氧胸腺嘧啶，經文獻證明可以有效的加快各種啤酒有害厭氧菌的生長速度；硫酸錳、硫酸鎂、檸檬酸氨，為微生物的生長提供必要的無機營養(yǎng)物質；同時經過實驗確定添加25%的清酒，可以補充B族維生素和酵母代謝營養(yǎng)產物，同時所含的苦味物質可以抑制非啤酒有害菌的增殖；水和瓊脂，不作為營養(yǎng)物質，用來溶解、凝固培養(yǎng)基成分。雖然這種培養(yǎng)基與原來使用的同類培養(yǎng)基相比營養(yǎng)種類更加全面，但由于每種成分的用量合理、精簡，因此與各種商品化培養(yǎng)基相比檢測成本并不高，配制1L的成本大約為133元，以前成本大約116元，基本持平。而QA33培養(yǎng)基174元，NBB培養(yǎng)基212元，成本較高。有研究報道證明啤酒有害厭氧菌由于長期生存在啤酒制造環(huán)境中，已衍化出抗酒精、抗酒花物質的特點，其生理特性與實驗室標準菌株有所不同，且每一種啤酒有害厭氧菌對微量元素的需求特別是對B族維生素種類的需求相差較大，因此培養(yǎng)基優(yōu)化實驗所使用的啤酒有害厭氧菌均分離自啤酒實際生產過程，并且經過了菌種鑒定確定到種，與使用實驗室標準菌株相比，優(yōu)化出的培養(yǎng)基更適合應用于實際生產過程的微生物監(jiān)控。同時培養(yǎng)基各種成分添加量的優(yōu)化過程采用了響應面試驗設計方法，通過建立回歸方程，將常見啤酒有害菌的生長速度與每種營養(yǎng)成分的添加量之間的關系函數化，通過組合搭配安排實驗，然后對實驗數據進行回歸擬合，并對擬合方程作顯著性檢驗及方差分析，多項式模型擬合的性質由決定系數R2及方差分析判定，其統(tǒng)計學上的顯著性由F檢驗確定，最終科學性的確定每種營養(yǎng)成分的最佳添加量。本培養(yǎng)基針對啤酒生產過程當中危害性最大的厭氧細菌培養(yǎng)檢測速度非?？?，選擇度高，無論是實驗室單種劃線、涂布培養(yǎng)(具體驗證菌種見下列表格1)還是生產過程直接取樣(包括生產流程中的水、發(fā)酵、過濾后、成品等不同取樣點)，至多在72小時內即可長齊所有啤酒有害厭氧菌菌落用以觀察計數(檢測含有酵母的樣品需添加適量放線菌酮加以抑制)；并且對生長速度比較慢的lactobacillus.paracollinoides(尚無中文名，DSMZ編號:15502)、Lactobacilluslindneri(林氏乳桿菌/酸面團乳桿菌，DSMZ編號20690)和pediococcus.damnosus(片球有害菌，DSMZ編號20331)的培養(yǎng)效果特別好，與原來使用的培養(yǎng)基相比，生長速度更快，從7天縮短到2天，菌落直徑明顯增大，從針尖大小左右增大到小米粒大小，宜于觀察、計數。有害菌拉丁名及DSMZ編號(DSMZ:德國菌種保藏中心)對比參照表格1如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*快速本專利發(fā)明的啤酒有害厭氧菌快速培養(yǎng)基原原來使用的培養(yǎng)基以上實驗對照樣品取自于啤酒實際生產流程，將樣品進行無菌膜濾，然后將濾膜一分為二分別置于兩種培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，每天觀察、計數?？梢钥闯霰緦＠l(fā)明的啤酒有害菌快速培養(yǎng)基至多在第三天即可長齊菌落用以觀察、計數；而原來所用的培養(yǎng)基至少要等到第七天才能觀察、計數。具體實施方式實施例l?！N快速檢測啤酒中有害厭氧菌的培養(yǎng)基，其液體配方如下1L的添加量(g):果糖(fructose)7.5g，L-半胱氨酸鹽酸鹽(L-CysteineHCL)1.25g，檸檬酸銨(ammoniumcitrate)lg，牛肉提取物(beefextract)6.6-6.7g，右旋葡萄糖(dextrose)10.3-10.4g，磷酸氫二鉀(dipotassiumphosphate)1.3-1.4g，硫酸鎂(m卿esiumsulfate)0.05g，硫酸錳(manganesesulfate)0.025g，吐溫80(polysorbate80)0.6g，元蛋白胨(proteosep印toneNo3)5g，乙酸納(sodiumacetate)3.3—3.4g，酵母浸出物(YeastExtract)3.3_3.4g，牛肝浸粉(liverconcentrate)1.5g丄-蘋果酸(X_malicacid)O.4g，麥芽糖(maltose)22.5g，乳糖(lactose)3.3-3.4g，番茄汁(tomatojuice)6g，特殊蛋白胨(p印tonespecial)12.5g，胞啶(cytidine)O.lg，脫氧胸腺嘧啶(thymidine)0.2g?！N快速檢測啤酒中有害厭氧菌的培養(yǎng)基，其固體配方如下1L的添加量(g):在上述液體配方中添加瓊脂(Agar)15g。本發(fā)明所述的啤酒有害厭氧菌快速培養(yǎng)基是采用無機營養(yǎng)成分、有機營養(yǎng)成分、碳水化合物、生長剌激物質、天然提取物、表面活性劑通過混合調配、分裝、滅菌等步驟配制而成，包括下述步驟(1)將上述配方成分列表里成分混合，置25%清酒或者除氣啤酒和75%的水的溶劑中加熱溶解；(2)利用1M的Na0H將pH值調節(jié)到5.8-6.2;(3)如果檢測含有酵母的樣品需加入10卯m的放線菌酮；(4)118t:高壓滅菌15分鐘，可暫存于2-l(TC無菌保藏備用。固體培養(yǎng)基的制備方法，在步驟(2)后加入瓊脂，加熱攪拌使瓊脂溶解。在步驟(4)后液體培養(yǎng)基按需求分裝到無菌試管后，塞上無菌棉塞；固體培養(yǎng)基倒平板。上述培養(yǎng)基的培養(yǎng)置于厭氧培養(yǎng)箱或者厭氧罐3(TC培養(yǎng)。對于固體培養(yǎng)基48-72小時內即可觀察、計數；對于液體培養(yǎng)基，48小時內即可觀察、測濁度。本發(fā)明參照附圖和實施例進行說明，但保護范圍不限于此，在本發(fā)明技術范圍內具有普通技術人員可以經過簡單的變換，而獲得本發(fā)明同樣的技術效果，同樣在本發(fā)明的保護范圍內。權利要求一種快速檢測啤酒中有害厭氧菌的培養(yǎng)基，其特征是液體配方如下1L的添加量碳源物質果糖7.5g，右旋葡萄糖10.3-10.4g，麥芽糖22.5g，乳糖3.3-3.4g，L-蘋果酸0.4g；氮源物質元蛋白胨5g，牛肉提取物6.6-6.7g，特殊蛋白胨12.5g，牛肝浸粉1.5g；表面活性劑吐溫80；氨基酸鹽類L-半胱氨酸鹽酸1.25g；B族維生素及其他微量元素類物質酵母浸出物3.3-3.4g，番茄汁6g或含有等量番茄汁的番茄汁培養(yǎng)基；抑制非啤酒有害厭氧菌類物質乙酸鈉3.3-3.4g；加快各種啤酒有害厭氧菌生長類物質胞啶0.1g，脫氧胸腺嘧啶0.2g；無機營養(yǎng)物質硫酸錳0.025g，硫酸鎂0.05g、檸檬酸銨1g；其他250ml的清酒或除氣啤酒，750ml的水。2.如權利要求1所述的一種快速檢測啤酒中有害厭氧菌的培養(yǎng)基，其特征是其中元蛋白胨可替換為牛肉蛋白胨，或胰蛋白胨，或多蛋白胨或胨化牛奶。3.如權利要求1或2所述的一種快速檢測啤酒中有害厭氧菌的培養(yǎng)基，其特征是固體配方上述液體配方中添加瓊脂15g。4.上述權利要求1所述的培養(yǎng)基的制備方法，其特征是包括下述步驟(1)將上述配方成分列表里成分混合，置25%清酒或者除氣啤酒和75%的水的溶劑中加熱溶解；(2)利用1M的NaOH將pH值調節(jié)到5.8-6.2;(3)如果檢測含有酵母的樣品需加入10ppm的放線菌酮；(4)11『C高壓滅菌15分鐘，可暫存于2-l(TC無菌保藏備用。5.如權利要求4所述的培養(yǎng)基的制備方法，其特征是固體培養(yǎng)基的制備，在步驟(2)后加入瓊脂，加熱攪拌使瓊脂溶解。6.如權利要求4所述的培養(yǎng)基的制備方法，其特征是在步驟(4)后液體培養(yǎng)基按需求分裝到無菌試管后，塞上無菌棉塞；固體培養(yǎng)基倒平板。7.如權利要求4所述的培養(yǎng)基的制備方法，其特征是還可以包括步驟(5)培養(yǎng)基的培養(yǎng)置于厭氧培養(yǎng)箱或者厭氧罐3(TC培養(yǎng)，固體培養(yǎng)基48-72小時內，液體培養(yǎng)基48小時內。全文摘要一種快速檢測啤酒中有害厭氧菌的培養(yǎng)基，其特征是液體配方如下1L的添加量果糖7.5g，L-半胱氨酸鹽酸鹽1.25g，檸檬酸銨1g，牛肉提取物6.6-6.7g，右旋葡萄糖10.3-10.4g，磷酸氫二鉀1.3-1.4g，硫酸鎂0.05g，硫酸錳0.025g，吐溫800.6g，元蛋白胨5g，乙酸鈉3.3-3.4g，酵母浸出物3.3-3.4，牛肝浸粉1.5g，L-蘋果酸0.4g，麥芽糖22.5g，乳糖3.3-3.4g，番茄汁6g，特殊蛋白胨12.5g，胞啶0.1g，脫氧胸腺嘧啶0.2g。固體配方上述液體配方中添加瓊脂15g。本發(fā)明所述的啤酒有害厭氧菌快速培養(yǎng)基是采用無機營養(yǎng)成分、有機營養(yǎng)成分、碳水化合物、生長刺激物質、天然提取物、表面活性劑通過混合調配、分裝、滅菌等步驟配制而成，培養(yǎng)速度更快、培養(yǎng)效果更好。文檔編號C12Q1/04GK101760503SQ20081018759公開日2010年6月30日申請日期2008年12月26日優(yōu)先權日2008年12月26日發(fā)明者單連菊,楊梅,董建軍,郝俊光,錢中華,陳璐申請人:青島啤酒股份有限公司