專利名稱：β-葡聚糖的制備方法與制備系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及e-葡聚糖的制備方法，更特別地，本發(fā)明涉及利用新穎的蘑菇培養(yǎng)
方法與培養(yǎng)系統(tǒng)以制備e-葡聚糖。
背景技術：
近年來有許多研究發(fā)現蘑菇菌絲體或子實體中含有相當多的生理活性成分， 如P _葡聚糖(P -Glucan)、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase， SOD)、三萜類 (Triterpenoids)等物質，具有免疫調節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等作用。而其中研究最深入且最具 潛力的抗腫瘤及免疫調節(jié)物質為多糖體。 已知|3 -葡聚糖為一種良好的免疫促進劑，可有效剌激免疫細胞，不僅能增強生 物體特異性免疫反應，同時也提高了非特異性免疫反應。此外，P-葡聚糖能使生物體抵 抗細菌、真菌、病毒及寄生蟲的感染，并且抑制腫瘤的生長。近年來蘑菇多糖體(mushroom 13 -glucan)逐漸受到重視，主要原因在于蘑菇多糖體的分支度、分子量、水溶性以及結構穩(wěn) 定性都較酵母菌多糖體高出許多，具有較高的免疫促進能力。 然而，蘑菇類的成分復雜，如多糖、蛋白質、多肽類、三萜類、多種氨基酸、生物堿、 酯類和有機酸等，所以萃取蘑菇多糖體物需經繁瑣的步驟，如熱萃取、堿萃取、酸萃取等方 式，因此，易殘留有機溶齊U、氨基酸與蛋白質，此等殘留皆可能產生剌激性免疫反應。
—般培養(yǎng)蘑菇的子實體，需要二至三個月，培養(yǎng)至采收耗時耗力，若蘑菇來源是 從野外取得則更為困難；因此，目前多利用液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)蘑菇菌絲體。目前以深層培養(yǎng) (submerged culture)方式制造蘑菇菌絲體及其代謝產物最多；菌絲體經初步培養(yǎng)后，經 由小、中及大型發(fā)酵槽依序連續(xù)培養(yǎng)，藉此大量生產。公知技術中，蘑菇培養(yǎng)設備需用到大 小不同的不銹鋼材質的發(fā)酵槽串聯，加上管路及大型鍋爐連結，設備繁復并且成本很高；然 而，制備過程中除了發(fā)酵槽設備相當昂貴的外，發(fā)酵期間若有污染(contamination)的情 形發(fā)生，往往造成嚴重的損失。 一般而言，蘑菇在液態(tài)發(fā)酵時菌絲體的生長速率較慢，過程 中遭到污染的機會也相對提高，因此，通常使用較高的接種量，約10% -30%。體積越大的 發(fā)酵槽，除了混合效果不佳以外，還會造成溫度、pH及營養(yǎng)的梯度問題，并造成發(fā)酵不均勻 的狀況，故公知技術為盡量避免上述問題，勢必要增加前置培養(yǎng)的設備。
再者，對于蘑菇的深層培養(yǎng)，需要考慮培養(yǎng)基的組成、pH值、溫度、通氣、和攪 拌等條件，以制造菌絲體或其代謝物。深層培養(yǎng)的特色在于發(fā)酵過程中并無孢子形成 (sporulation)期，所產生的菌絲體在發(fā)酵時會糾結在一起而形成菌球，若菌球愈大，其中 心部分的菌絲體會因氧氣及養(yǎng)分輸送上的限制，造成饑餓的情形，對菌絲體增殖與代謝產 物生成非常不利；這也使得培養(yǎng)液中營養(yǎng)源及氧氣的傳送程度較一般低等真菌或酵母菌的 液體培養(yǎng)更為復雜。因此，在發(fā)酵期間，須控制發(fā)酵過程中的切應力、攪拌轉數及溶氧程度 等因素，以縮小菌絲體形成球狀物的體積。 蘑菇液態(tài)發(fā)酵時，培養(yǎng)基中碳源、氮源及生長因子，是多糖體產率的關鍵之一，大 多數的制造方法會尋找較便宜的生產物料，或者為提高產率而添加一些特殊化合物，如此
4卻衍生出更多純化的步驟，造成成本提高、設備增加及廢棄物處理的問題。并且以目前慣用 的發(fā)酵槽進行大量的蘑菇液態(tài)發(fā)酵，自發(fā)酵液萃取所得的P-葡聚糖濃度仍然偏低，一般 低于10重量％。 為解決上述問題，本發(fā)明提供了制備蘑菇13 -葡聚糖的方法與新穎的蘑菇培養(yǎng)系 統(tǒng)。

發(fā)明內容
由于上述公知技術的缺陷，本發(fā)明的主要目的是提供13 -葡聚糖的制備方法與制 備系統(tǒng)，利用含有簡單成分的培養(yǎng)基及價格低廉的設備，提供良好的蘑菇液態(tài)培養(yǎng)環(huán)境，即 可成功制造菌絲體及多糖體等代謝物，并克服了溶氧或菌體體積過大的問題，可作為蘑菇 液態(tài)培養(yǎng)及其他領域的液態(tài)發(fā)酵的應用。 為達上述與其他目的，本發(fā)明提供一種制備P-葡聚糖的方法，包括(a)將蘑菇 菌液置入含有培養(yǎng)液與攪拌裝置的容器，并通過該攪拌裝置攪拌培養(yǎng)該蘑菇菌液；(b)將 步驟(a)所培養(yǎng)的蘑菇菌液置入含有生產培養(yǎng)基的聚碳酸樹脂容器，且通過回轉式搖擺 機，旋轉該聚碳酸樹脂容器而震蕩培養(yǎng)該蘑菇菌液；及(c)自步驟(b)震蕩培養(yǎng)的蘑菇菌液 分離或純化P-葡聚糖。 在本發(fā)明制備e-葡聚糖的方法中，步驟(a)的容器為具有硅膠透氣瓶塞的血清 瓶，且攪拌裝置是磁石棒，提供轉速以控制溶氧量、菌絲體體積、及/或菌絲體生長速度。
根據本發(fā)明，制備13 -葡聚糖的方法進一步包含提供用于蘑菇菌種培養(yǎng)的T型培 養(yǎng)盒，用以迅速篩選所欲發(fā)酵的蘑菇菌種。 根據本發(fā)明，該生產培養(yǎng)基采用食品級原料，僅包括葡萄糖與酵母菌萃取物，其中
培養(yǎng)基成分以重量百分比表示，優(yōu)選為i-io%葡萄糖與0. 1-1 %酵母菌萃取物，更優(yōu)選為 4%葡萄糖與0. 5%酵母菌萃取物。經過實驗測試，本發(fā)明的生產培養(yǎng)基可適用于各類型蘑 菇生長，而多糖體產率也良好；可適用的蘑菇包括所有食用蘑菇類與醫(yī)藥用蘑菇類，舉例但 非限制，裂褶菌(Schizophyllum commue)、巴西蘑燕(Agaricsblaze)、冬蟲夏草(Cordyc印s sinensis)、靈芝(Ganoderma lucidum)、云芝(Coriolus versicolor)、樟芝(Anthodia c咖phorate)、桑黃(Phelli皿slinteus)、珊瑚燕(Pleurotus citrinopileatus)、香燕 (Lenti皿la edodes)、田頭燕屬(Agrocybe sp.)如賴卩松燕(Agrocybe aegerita)、猴頭燕 (Hericiumerinaceus)、杏鮑燕(Pleurotus eryngiig)、花辧葺(Sparrasis crispa)、木葺 (Auricularia auricula)、金針燕(Flammulina velutipes)等。 這種分離或純化P-葡聚糖的方法可以一般公知方法進行，在優(yōu)選實施例中，本 發(fā)明分離或純化P-葡聚糖的方法包括將經前置培養(yǎng)與大量發(fā)酵所得的蘑菇菌液粉碎、 離心并收取上清液、用乙醇沉淀上清液而得沉淀物、用水溶解沉淀物，并以薄膜進行分離而 獲得P-葡聚糖。 本發(fā)明的另一方面提供制備P-葡聚糖的培養(yǎng)液態(tài)蘑菇系統(tǒng)，包括內含攪拌裝 置的玻璃容器，用于前置發(fā)酵液態(tài)蘑菇；聚碳酸樹脂容器，用于放大培養(yǎng)前置發(fā)酵的液態(tài)蘑 菇；以及回轉式搖擺機，用于承載并旋轉該聚碳酸樹脂容器，藉以震蕩方式放大培養(yǎng)該液態(tài) 蘑菇。此培養(yǎng)系統(tǒng)可用以實施本發(fā)明制備P-葡聚糖的方法。 在上述液態(tài)蘑菇培養(yǎng)系統(tǒng)中，該玻璃容器是具有硅膠透氣瓶塞的血清瓶，該血清瓶的攪拌裝置是磁石棒。攪拌裝置提供轉速以控制溶氧量、菌絲體體積、及/或菌絲體生長 速度。利用玻璃血清瓶蓋上的硅膠透氣塞提供前蘑菇前置發(fā)酵所需氣體，利用磁石攪拌培 養(yǎng)，促進蘑菇胞外多糖體的生成、抑制菌絲體結成團塊、并可增加溶氧及物質交換的速率。
本發(fā)明用于培養(yǎng)制備e-葡聚糖的液態(tài)蘑菇系統(tǒng)，本發(fā)明進一步包括用于菌種培 養(yǎng)與快速篩選菌種的T型培養(yǎng)盒，該培養(yǎng)盒有助于快速篩選所欲發(fā)酵的蘑菇菌種。


圖1是本發(fā)明用于前置發(fā)酵的容器及磁石攪拌機的概示圖。 圖2是本發(fā)明用于液態(tài)蘑菇培養(yǎng)的聚碳酸樹脂容器及回轉搖擺機的概示圖。 圖3是根據本發(fā)明的實施例，用以說明分離與純化e-葡聚糖的流程圖。 主要元件符號說明 ll玻璃容器 12多孔硅膠塞 13磁石攪拌子 14磁石攪拌機 21聚碳酸樹脂容器 22回轉搖擺機
具體實施例方式
以下是通過特定的具體實施例說明本發(fā)明的實施方式，本領域技術人員可由本說 明書所揭示的內容了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。
1.蘑菇菌種篩選與培養(yǎng) 本發(fā)明可應用的蘑菇菌株是如裂褶菌、巴西蘑菇、冬蟲夏草、靈芝、云芝、樟芝、桑 黃、珊瑚菇、香菇、田頭菇屬如柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、木茸、金針菇等，但不限于上 述菌株。以裂褶菌與靈芝作為實施例，說明如下。 在無菌操作條件下，將其接種于預瓊脂培養(yǎng)基上，置于28。C培養(yǎng)箱(Incubator) 培養(yǎng)，其中YM瓊脂培養(yǎng)基包含0.3X (w/w)酵母菌萃取物、0.3%麥芽萃取物、0.5%蛋白胨 (p印tone) 、1. 0%右旋糖(dextrose) 、1. 5%瓊脂(agar)等。約培養(yǎng)2 3天后，開始出現 菌絲體，約一周后菌絲體長滿固體培養(yǎng)基。觀察其菌種形態(tài)及生長速率，進行蘑菇菌種篩選 及后續(xù)繼代培養(yǎng) YM培養(yǎng)液20毫升加入80T的T型動物細胞培養(yǎng)盒(T型塑膠培養(yǎng)盒)中，將篩選
出的固態(tài)培養(yǎng)菌絲體切一小塊植入培養(yǎng)液，在28t:培養(yǎng)一周后，選擇生長良好快速的菌絲
體，用作液態(tài)前置發(fā)酵的菌種。
2.前置發(fā)酵 使用圖1的裝置，取玻璃容器ll(例如1公升的血清瓶)，使用單向透氣的多孔硅 膠塞12作為瓶蓋，瓶內放入Teflon磁石攪拌子13。在玻璃容器11內配制800毫升的預 培養(yǎng)液，并將配置的培養(yǎng)液進行高溫高壓滅菌，滅菌條件121°C、15分鐘，滅菌后降至室溫。
將在T型塑膠培養(yǎng)盒培養(yǎng)完成的蘑菇菌液接種于玻璃容器11內，將玻璃容器11 置于磁石攪拌機14上，于室溫條件下培養(yǎng)。將攪拌機的轉速控制在約300rpm，使培養(yǎng)液均勻分布，并利用轉速控制液體中的溶氧量，通過磁石旋轉的切應力使菌絲體生長細密、增殖 快速并使菌球形成減少與形成體積減小。待發(fā)酵至生長曲線的靜止期(stationaryphase) 而停止發(fā)酵。 如上述條件，另取更大體積的玻璃容器(例如10公升的血清瓶)，其中注入8公升 YM培養(yǎng)液，接種前述發(fā)酵完成的菌液，進行第二次菌種放大的前置發(fā)酵步驟。當然，可視需
要而進行多次的前置發(fā)酵步驟。
3.大量發(fā)酵 經由至少兩次的前置發(fā)酵，由于菌絲體被磁石旋轉切碎，使得菌體的體積不至于 過大而影響后續(xù)的發(fā)酵，此時可進行菌種大量發(fā)酵。 本發(fā)明所使用的生產培養(yǎng)基包含4%葡萄糖(glucose)與0. 5%酵母菌萃取物，將 該生產培養(yǎng)基15-18公升注入體積為20公升的聚碳酸樹脂容器中，并放入高溫高壓滅菌， 滅菌條件為12rC、15分鐘，滅菌后降至室溫。 將前置發(fā)酵完成的蕈菇培養(yǎng)液接種入聚碳酸樹脂容器21中，將聚碳酸樹脂容器 固定在回轉搖擺機22 (如圖2)上，調節(jié)適當的轉速，約80rpm，并給予充分的溶氧及旋轉震 蕩，于室溫下培養(yǎng)，待發(fā)酵至生長曲線的靜止期(stationary phase)而停止發(fā)酵，此時菌絲 體的細胞數與多糖體的濃度維持在最高。 發(fā)酵期間，由于聚碳酸樹脂容器具有透明瓶身，可供清楚觀察整體的發(fā)酵情形，進 行篩選及控制。 4. P-葡聚糖的分離與純化 經本發(fā)明方法所獲得的液態(tài)蘑菇培養(yǎng)菌液，在培養(yǎng)液與菌絲體中皆含有13 _葡聚 糖，可直接供后續(xù)應用；但也可從培養(yǎng)液與菌絲體中將e-葡聚糖進一步分離純化。
如圖3所示，將上述發(fā)酵完成的蘑菇菌液，用超高速均質機及超音波震蕩機分別 處理10分鐘，以震碎菌絲體細胞壁。高速離心(每分鐘6， 000 8， 000轉)，逐步收取上清 液。加入與上清液等量的95%乙醇以萃取高分子多糖體，收取沉淀物。將沉淀物均勻溶解 于二次蒸餾水中，再將此水溶液利用分離膜系統(tǒng)(Membrane S印aration System)去除乙醇 及剩余的小分子物質，例如低于10kDa的小分子，則可獲得P-葡聚糖。
5. P-葡聚糖的濃度測定 以測量多糖體的酚-硫酸法(Phenol-sulfuric acid method)測定本發(fā)明萃取的 P-葡聚糖含量。于10毫升樣品加入40毫升95%乙醇(NACALAI)，充分混合。以1， 000g 離心15分鐘，沉淀物即為多糖體；倒掉上清液，以75%乙醇洗滌多糖體2次。經離心后，去 除殘余乙醇。以蒸餾水溶解沉淀物，并將最后體積調成10毫升，作為待測樣品的溶液。
取0. 5毫升溶液與等體積5%酚(AMRESC0)混合，再緩緩加入2. 5毫升濃硫酸。 靜置10分鐘后震蕩，使其充分混合。靜置30分鐘后，用分光光度計(Ultrospec1000， PHARMACIABI0TECH)測量波長490nm的吸光值。并依據葡萄糖標準曲線計算樣品中所含多 糖體的濃度。 測定本發(fā)明所制備的13 -葡聚糖，所得裂褶菌的13 -葡聚糖濃度為20 25% ;靈 芝的P-葡聚糖濃度為20 25%。 上述結果證實本發(fā)明制備13 -葡聚糖的方法與系統(tǒng)確實可提高蘑菇液態(tài)發(fā)酵的 P-葡聚糖的產率。
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經多次實驗證實多種蘑菇，如裂褶菌、巴西蘑菇、冬蟲夏草、靈芝、云芝、樟芝、桑 黃、珊瑚菇、香菇、田頭菇屬如柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、木茸、金針菇等菌株，皆適用 本發(fā)明的方法。 據上所述，本發(fā)明不僅提高蘑菇液態(tài)發(fā)酵的P-葡聚糖產率，而且具有至少以下 優(yōu)點與功效 公知技術是使用三角燒瓶進行菌種的震蕩培養(yǎng)。然而，本發(fā)明是以玻璃血清瓶蓋 上硅膠透氣塞，并且通過磁石棒進行攪拌培養(yǎng)，有助于促進蘑菇胞外多糖體生成、降低菌絲 體結成團塊、增加溶氧及物質交換的速率。 本發(fā)明利用動物細胞培養(yǎng)方式取代一般瓊脂培養(yǎng)法，用80T的T型塑膠培養(yǎng)盒來 培養(yǎng)蘑菇菌種，與公知技術的瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)法相比，本發(fā)明所培養(yǎng)的菌種具有生長快速、 復制量可提高、可提早觀察出菌種是否遭受污染等優(yōu)點。 再者，由于本發(fā)明的培養(yǎng)基采用食品級原料，故發(fā)酵完畢后，不需經過繁瑣的純化 程序，即可直接食用；且發(fā)酵液可進一步加工調制為各種不同形態(tài)的健康食品、化妝品及醫(yī) 療用品。 本發(fā)明的聚碳酸樹脂(polycarbonate,PC)容器可耐高溫達13(TC，且具有材質透 明的特性，作為發(fā)酵桶可方便觀察內部發(fā)酵狀況，使發(fā)酵控制和管理更為容易。根據本發(fā) 明，聚碳酸樹脂容器外型設計如一般蒸餾水桶，蓋上硅膠透氣塞，即可放入一般小型殺菌鍋 內滅菌，發(fā)酵時操作容積可達約16公升，比一般桌上型發(fā)酵槽容量大，并且聚碳酸樹脂容 器的重量較輕，且價格較低廉。 將培養(yǎng)基置于聚碳酸樹脂容器中，用殺菌鍋進行滅菌，待其滅菌冷卻后，將血清瓶 前置培養(yǎng)完成的菌株接種于聚碳酸樹脂容器中，置于回轉式搖擺機上，單次可操作1-16個 容器，可視需要進行增減，亦可同時培養(yǎng)多種菌株，在生產或研發(fā)上的應用極具彈性。此外， 聚碳酸樹脂容器的透明瓶身可供隨時觀察發(fā)酵的情形，以調節(jié)搖擺的轉速，控制溶氧及生 長狀況。 本發(fā)明用于培養(yǎng)制備e-葡聚糖的液態(tài)蘑菇系統(tǒng)適用于各類蘑菇的液態(tài)發(fā)酵，并
可用以制備出多糖體(如P-葡聚糖)和其他代謝產物。該系統(tǒng)利用旋轉搖擺轉速，配合操 作體積，可控制溶氧量；依此原理，本培養(yǎng)系統(tǒng)的應用范圍更可擴及嗜氧、微好氧或厭氧類
微生物發(fā)酵，并可延伸至動、植物細胞培養(yǎng)。此外，由于聚碳酸樹脂容器為透明材質，可配合 特殊光照設備，視培養(yǎng)的需要，可滿足培養(yǎng)菌株的特定光照需求，因此，也適用于對于藻類、 光合菌、或植株的液態(tài)培養(yǎng)。 上述實施例僅示例性說明本發(fā)明的系統(tǒng)與方法，而非用于限制本發(fā)明。任何本領 域技術人員均可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾與改變。因此，本 發(fā)明的權利保護范圍如前述權利要求。
權利要求
一種用于培養(yǎng)液態(tài)蘑菇以制備β-葡聚糖的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括內含攪拌裝置的容器，用于進行液態(tài)蘑菇的前置發(fā)酵；聚碳酸樹脂容器，用于放大培養(yǎng)前置發(fā)酵的液態(tài)蘑菇；以及回轉式搖擺機，用于承載并旋轉該聚碳酸樹脂容器，藉以震蕩方式放大培養(yǎng)該液態(tài)蘑菇。
2. 如權利要求1所述的系統(tǒng)，其中用于進行前置發(fā)酵的容器是具有硅膠透氣瓶塞的血 清瓶。
3. 如權利要求l所述的系統(tǒng)，其中攪拌裝置是磁石棒。
4. 如權利要求1所述的系統(tǒng)，其中回轉式搖擺機可承載單個或多個聚碳酸樹脂容器。
5. 如權利要求1所述的系統(tǒng)，其中聚碳酸樹脂容器含有液態(tài)生產培養(yǎng)基。
6. 如權利要求5所述的系統(tǒng)，其中液態(tài)生產培養(yǎng)基包括葡萄糖與酵母菌萃取物。
7. 如權利要求1所述的系統(tǒng)，該系統(tǒng)進一步包括用于菌種培養(yǎng)與快速篩選菌種的T型培養(yǎng)盒。
8. —種制備P-葡聚糖的方法，該方法包括(a) 將蘑菇菌液置入含有培養(yǎng)液與攪拌裝置的容器，并通過該攪拌裝置攪拌培養(yǎng)該蘑 燕菌液；(b) 將步驟(a)所培養(yǎng)的蘑菇菌液置入含有生產培養(yǎng)基的聚碳酸樹脂容器，且通過回 轉式搖擺機，旋轉該聚碳酸樹脂容器而震蕩培養(yǎng)該蘑菇菌液；及(c) 從步驟(b)震蕩培養(yǎng)的蘑菇菌液中分離或純化P-葡聚糖。
9. 如權利要求8所述的方法，其中步驟(c)包括 將蘑菇菌液的菌絲體粉碎； 進行離心并收取上清液； 用乙醇沉淀該上清液，而得沉淀物； 用水溶解該沉淀物，而得水溶液；以及 用薄膜分離該水溶液，而獲得P-葡聚糖。
10. 如權利要求8所述的方法，其中步驟(a)的培養(yǎng)視需要重復數次。
11. 如權利要求8所述的方法，其中生產培養(yǎng)基包括葡萄糖與酵母菌萃取物。
12. 如權利要求11所述的方法，其中生產培養(yǎng)基包括1至10%葡萄糖與0. 1至1%酵 母菌萃取物。
13. 如權利要求12所述的方法，其中生產培養(yǎng)基包括4%葡萄糖與0. 5%酵母菌萃取物。
14. 如權利要求8所述的方法，其中該步驟(a)的容器為具有硅膠透氣瓶塞的血清瓶。
15. 如權利要求8所述的方法，其中該攪拌裝置是磁石棒，用于提供轉速控制溶氧量、 菌絲體體積，及/或菌絲體生長速度。
16. 如權利要求8所述的方法，該方法進一步包含提供T型培養(yǎng)盒，用于蘑菇菌種培養(yǎng)。
17. 如權利要求8所述的方法，其中該蘑菇為裂褶菌、巴西蘑菇、冬蟲夏草、靈芝、云芝、 樟芝、桑黃、珊瑚菇、香菇、田頭菇屬如柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、木茸、金針菇或其組 合物。
18. 如權利要求8所述的方法，其中回轉式搖擺機轉速設定為50至150rpm。
19.如權利要求18所述的方法，其中回轉式搖擺機轉速設定為70至lOOrpm。
全文摘要
本發(fā)明涉及β-葡聚糖的制備方法與制備系統(tǒng)，該方法與系統(tǒng)包括(a)將蘑菇菌液置入含有培養(yǎng)液與攪拌裝置的容器，并通過該攪拌裝置攪拌培養(yǎng)該蘑菇菌液；(b)將步驟(a)所培養(yǎng)的蘑菇菌液轉移置入含有生產培養(yǎng)基的聚碳酸樹脂容器，且通過回轉式搖擺機，旋轉該聚碳酸樹脂容器而震蕩培養(yǎng)該蘑菇菌液；及(c)自步驟(b)震蕩培養(yǎng)的蘑菇菌液分離或純化β-葡聚糖。
文檔編號C12M1/02GK101768541SQ200810187740
公開日2010年7月7日 申請日期2008年12月31日 優(yōu)先權日2008年12月31日
發(fā)明者陳秀男 申請人:陳秀男