專利名稱：香蕉束頂病毒檢測方法所用的pcr引物及其檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測香蕉束頂病毒的引物及其檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
香蕉是中山巿水果業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)和重要的出口農(nóng)產(chǎn)品，遠(yuǎn)銷日本，在日本市場有著 良好的口碑，年出口值約十萬美元。目前香蕉病毒病一直是我國香蕉生產(chǎn)和香蕉組培苗 出境的主要限制因素之一，近年來，香蕉病毒病對(duì)中山市的香蕉產(chǎn)量和質(zhì)量也產(chǎn)生了嚴(yán) 重的影響，已成為中山巿香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因素之一。另外，香蕉一旦被病毒侵 染，很難用藥劑防治。對(duì)付香蕉病毒病，最有效的措施就是預(yù)防為主。出于對(duì)進(jìn)口食品 檢疫安全的關(guān)注，日本厚生勞動(dòng)省幾次派員來中山視察香蕉生產(chǎn)情況。而對(duì)香蕉種苗特 別是對(duì)香蕉組培苗的病毒早期檢測已經(jīng)成為控制香蕉病毒病發(fā)生蔓延和保障其順利出境 的非常有效的措施。綜合上述情況，我們認(rèn)為有必要在中山市開展香蕉病毒病的普査工 作和相關(guān)的快速檢測技術(shù)研究工作，這些工作的開展必將為中山市香蕉產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展做 出積極的貢獻(xiàn)。
香蕉病毒病一直是我國香蕉大田生產(chǎn)和香蕉組培苗出境的主要限制因素之一。近年 來，香蕉病毒病對(duì)中山市的香蕉產(chǎn)量和質(zhì)量都產(chǎn)生了比較嚴(yán)重的影響，也已成為'中山市 香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙之一。為了保障中山市香蕉產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康的發(fā)展，中山出入 境檢驗(yàn)檢疫局利用人才和儀器優(yōu)勢資源，首次對(duì)中山市主要香蕉生產(chǎn)基地進(jìn)行了病毒病 普查并對(duì)本市香蕉主要病毒進(jìn)行了分子檢測方法的相關(guān)研究。按照不同生長季、不同品 種進(jìn)行采樣，分別于2007年4 5月、10 11月和2008年4 5月、10 11月間，先后 到民眾鎮(zhèn)、火炬開發(fā)區(qū)、橫欄鎮(zhèn)、南朗鎮(zhèn)、坦洲、黃圃鎮(zhèn)和五桂山鎮(zhèn)等香蕉主要生產(chǎn)區(qū) 鎮(zhèn)的香蕉生產(chǎn)基地進(jìn)行大面積的實(shí)地調(diào)查和樣品采集，調(diào)查面積約為1000畝左右，并通 過對(duì)蕉農(nóng)咨詢來了解香蕉病毒病歷年發(fā)生與危害的情況，調(diào)査和采樣的香蕉種類有香 蕉、粉蕉和大蕉，共采集花葉、褪綠、矮縮等病毒癥狀的可疑樣品200份。對(duì)采集的樣 品首先采用血清學(xué)方法進(jìn)行篩選檢測，主要是通過ELISA方法；然后根據(jù)ELISA檢測結(jié) 果，對(duì)陽性結(jié)果和可疑結(jié)果樣品再用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法如PCR檢測法進(jìn)行針對(duì)性檢測， 尤其是對(duì)ELISA檢測呈陽性反應(yīng)的樣品進(jìn)行重點(diǎn)檢測和確證，最后再對(duì)血清學(xué)檢測和分 子檢測都為陽性的樣品結(jié)果進(jìn)行核酸序列測定，以便對(duì)病毒種類進(jìn)行終級(jí)判定。綜合血清學(xué)、PCR和序列分析檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)中山市侵染香蕉的主要病毒種類有三種，它們分 別是香蕉束頂病毒(BBTV)，總BBTV病樣100個(gè)(86.2%);香蕉花葉心腐病毒(CMV)， 總CMV病樣26個(gè)(22.4%);香蕉線條病毒(BSV)，總BSV病樣10個(gè)(8.6%)。
另外，我們對(duì)血清學(xué)檢測和PCR檢測都為陽性的樣品進(jìn)行克隆并進(jìn)行核酸序列測 序首先采用載體pGEM-T進(jìn)行克隆，構(gòu)建重組質(zhì)粒；然后采用抗生素和a —互補(bǔ)法篩 選重組質(zhì)粒；經(jīng)PCR及酶切鑒定為陽性的克隆，擴(kuò)繁菌體及抽提并純化質(zhì)粒后，再利用 通用測序引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，分別得到三條序列，分別定名為CMV-ZS、 BSV-ZS和BBTV-ZS。經(jīng)與GenBank中的核酸序列比發(fā)現(xiàn)所得序列的確分別來自黃瓜 花葉病毒CMV外殼蛋白基因、香蕉線條病毒BSV外殼蛋白基因和香蕉束頂病毒BBTV 復(fù)制酶基因；BBTV-ZS (中山分離物)與登陸號(hào)為AF246123的中國分離物同源性最高 為98.9%,與登陸號(hào)為AY222303及AM055641的印度分離物同源性最低為92.6%; CMV-ZS(中山分離物)與登陸號(hào)為AG585521的澳大利亞243株系同源性最高為98.9%， 與登陸號(hào)為CMO304397及CMO304397的ALS分離物同源性最低為69.1%; BSV-ZS(中 山分離物)與登陸號(hào)為DQ451009的中國廣東分離物同源性最高為100%。
BBTV是DNA病毒，目前，也有人用PCR檢測香蕉束頂病毒，但是其相關(guān)試劑盒 一般都是多步驟加入PCR試劑，不僅非常容易交叉污染，還費(fèi)時(shí)費(fèi)力，檢測靈敏度也不 高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測香.蕉束頂病毒的引物及其檢測試劑盒，用本發(fā)明試劑 盒進(jìn)行檢測，大大地簡化了操作過程，減少了PCR操作過程中的污染，能大大降低交叉污染 的機(jī)率，又使檢測效率大幅度提髙，同時(shí)檢測靈敏度也非常高，操作簡單方便，防止交 叉污染。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案是 一種用于檢測香蕉束頂病毒的PCR檢測引物，其上游引 物BBTV-Pl :5， -ATGTGGTATGCTGGATGTTC-3' ， 下游引物BBTV-P2 : 5' -GTTCATATTTCCCGCTTTGA-3'。
一種香蕉束頂病毒的檢測方法，包括如下步驟
(1) 提取待測樣品香蕉DNA，備用；
(2) 第(1)步提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物將進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
(3) 取PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，判斷樣品是否呈陽性，若擴(kuò)增條帶的長度 為748bp,則待測樣品呈陽性。
4所述的方法，第(1)步提取待測香蕉DNA的步驟如下
1) 取待檢測嫩葉片O. 1-0.2g,放置于1.5mL的離心管中，液氮冷凍；
2) 通過振蕩器劇烈振蕩，用玻璃棒將葉片研碎；
3) 加入O. 6mL CTAB提取緩沖液勻漿+2。/。 2-ME，振蕩混勻；
4) 65。C溫育30min;再加入O. 5mL氯仿，混勻5min;
5) 12000rpm離心5min，上層水相移至一新的離心管中；
6) 加入1X倍體積的異丙醇，輕輕混勻，-2(TC放置30min;
7) 12000rpm離心10min，棄去上清;
8) 70%乙醇洗滌沉淀，12000rpm離心2min;再用100%乙醇洗一次；
9) 棄去上清，真空干燥5min;
10) 沉淀溶于50uLTE (PH8.0)之中，-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 所述的方法，第(2)步中，進(jìn)行PCR的反應(yīng)條件如下先94'C 3min變性；然后 94°C 30sec, 52°C lmin， 72°C lmin，35個(gè)循環(huán)；最后72°C 10min。
一種用于檢測香蕉束頂病毒的試劑盒，包含所述的引物。 所述的試劑盒，還包括DNA聚合酶混合物(DNA Polymerase Mixture)，香蕉束頂 病毒陽性對(duì)照(如可直接使用香蕉束頂病毒，或者用所述引物擴(kuò)增出來的片段)。
一種用于檢測香蕉束頂病毒的的RT—PCR反應(yīng)體系，以總體積50ul計(jì)，其包括-DNA聚合酶混合物(DNA Polymerase Mixture) 25 ti 1，模板DNA 50ng，濃度為50 y M 的所述的上游引物和下游引物各1 w 1，余量為滅菌蒸餾水。
本發(fā)明的具有如下優(yōu)點(diǎn)利用本發(fā)明所述引物及其試劑盒檢測香蕉束頂病毒(BBTV)， 陽性對(duì)照是含有專門從廣東省中山市發(fā)病香蕉葉片中克隆出來的BBTV復(fù)制酶基因的載 體。只要加入待檢樣品的核酸和本試劑盒中的BBTV的一對(duì)引物，便可以進(jìn)行PCR反應(yīng)， 大大地簡化了操作過程，減少了PCR操作過程中的污染，同時(shí)使檢測效率大幅度提高，檢測 靈敏度也非常高，可以達(dá)到O. lpg;另外使用本制品擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物3'端還附有一個(gè) "A"堿基，可直接克隆于T-Vector中。


圖1為PCR法檢測香蕉束頂病毒凝膠電泳圖。
其中，M: lOObp DNA marker; CK—，空白對(duì)照；CK + ，陽性對(duì)照；1 22， 待檢 測樣品。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一1、提取香蕉總核酸(DNA+RNA)
(1) 取待檢測嫩葉片0. 1-0.2g，放置于L5mL的離心管中，液氮冷凍;
(2) 通過振蕩器劇烈振蕩，用玻璃棒將葉片研碎；
(3) 加入O. 6mL CTAB提取緩沖液勻漿+2y。 2-ME，振蕩混勻；
(4) 65。C溫育30min;再加入O. 5mL氯仿，混勻5min;
(5) 12000rpm離心5min，上層水相移至一新的離心管中；
(6) 加入1X倍體積的異丙醇，輕輕混勻，-2(TC放置30min;
(7) 12000rpm離心10min，棄去上清；
(8) 70%乙醇洗滌沉淀，12000rpm離心2min;再用100%乙醇洗一次；
(9) 棄去上清，真空干燥5min;
(10) 沉淀溶于50uLTE (pH8.0)之中，-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 上述第(3)步提取緩沖液的配制如下
配制100mL包括下組分
山梨糖醇0. 14M2.5g
Tris — HCl(pH8. 0)0. 22M22mL(lM)
Na2EDTA (pH8. 0)0. 022M4. 5mL(0. 5M)
NaCl0. 8M4. 64g
CTAB(W/V)0. 8%0.8g
N-LSC(W/V)1%lg
按照所配緩沖液的體積和不同試劑的濃度，計(jì)算不同試劑的用量，分別稱取山梨糖
醇、NaCl、 CTAB和N-LSC，再加入已經(jīng)配制好的高濃度的Tris-HC1和Na2EDTA，加入適 量的H力，溫水浴條件下磁力攪拌溶解后，加水定容到所需體積，高壓滅菌后備用。
2、 設(shè)計(jì)引物
BBTV復(fù)制酶基因特異PCR擴(kuò)增引物序列(擴(kuò)增片段大小為748 bp): 上游引物BBTV-P1 : 5'-ATGTGGTATGCTGGATGTTC-3， 下游引物BBTV-P2 : 5'-GTTCATATTTCCCGCTTTGA-3，
3、 擴(kuò)增參數(shù)體系
常規(guī)PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物4'C保存，取5 ixL在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，檢查PCR 結(jié)果。
按下列組份配制PCR反應(yīng)液.-DNA Polymerase Mixture
模板DNA
上游引物(50uM)
6
25 y 1 50ng lii 1下游引物(50uM) In 1
滅菌蒸餾水 加到50 Ul
PCR的反應(yīng)液最好在冰中配制，然后置于PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)這樣可增強(qiáng)PCR 擴(kuò)增的特異性，減少PCR過程中的非特異性反應(yīng)。 PCR反應(yīng)條件
先94。C 3min變性；然后94°C 30sec， 52°C lmin, 72°C lmin， 35個(gè)循環(huán)； 最后72°C 10min。
4、結(jié)果判定
反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液5 " 1進(jìn)行1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳，陽性結(jié)果應(yīng)該為748bP8 長度的DNA片段。結(jié)果見圖l，其中待測樣品第2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 10、 11、 12、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22號(hào)樣品BBTV呈陽性。
實(shí)施例二香蕉束頂病毒PCR試劑盒的配制
試劑盒的組成如下
DNA聚合酶混合物(DNA Polymerase Mixture) 25ulX24支 BBTV上游引物 30 y 1
BBTV下游引物 30 u 1
香蕉束頂病毒陽性對(duì)照 50ul(2.5ug)
DNA聚合酶混合物25u 1X24支，對(duì)于50y 1的PCR反應(yīng)體系第每次使用1支，即 25ul。試劑盒中引物濃度為50yM，使用時(shí)引物濃度稀釋到lym。
本發(fā)明試劑盒包含專門檢測香蕉束頂病毒(BBTV)的PCR反應(yīng)用的DNA聚合酶混合 物(DNA Polymerase Mixture)(購自Takara公司)，己分裝至0. 2 ml的Micro PCR tube (25ixl /支)中，使用時(shí)，只要加入待檢樣品的核酸和本試劑盒中的BSV引物，便可 以進(jìn)行PCR反應(yīng)，大大地簡化了操作過程，減少了PCR操作過程中的污染。使用本發(fā)明試劑盒 擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物3'端附有一個(gè)"A"堿基，可直接克隆于T-Vector中。
7核苷酸序列表
〈110〉中山出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，陳定虎，王龍貴
〈120〉香蕉束頂病毒檢測方法所用的PCR引物及其檢測試劑盒
〈140〉 200810187898.2
〈141〉 2008-12-25
〈160〉 2
〈210> 1
<211〉 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
〈223〉人工序列的描述人工合成的序列
〈400> 1
ATGTGGTATG CTGGATGTTC 20
〈210> 2 〈211〉 20 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉
〈223〉人工序列的描述人工合成的序列 〈400〉 2
GTTCATATTT CCCGCTTTGA 20
權(quán)利要求
1、一種用于檢測香蕉束頂病毒的PCR檢測引物，其特征在于其上游引物BBTV-P15’-ATGTGGTATGCTGGATGTTC-3’，下游引物BBTV-P25’-GTTCATATTTCCCGCTTTGA-3’。
2、 一種香蕉束頂病毒的檢測方法，包括如下步驟(1) 提取待測樣品香蕉DNA，備用；(2) 第(1)步提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物將進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3) 取PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，判斷樣品是否呈陽性，若擴(kuò)增條帶的長度為748bp，則待測樣品呈陽性。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于第(1)步提取待測香蕉DNA的步驟如下1) 取待檢測嫩葉片0. 1-0.2g，放置于1.5mL的離心管中，液氮冷凍；2) 通過振蕩器劇烈振蕩，用玻璃棒將葉片研碎；3) 加入0.6mL CTAB提取緩沖液勻漿+2X 2-ME，振蕩混勻；4) 65。C溫育30min;再加入O. 5mL氯仿，混勻5min;5) 12000rpm離心5min，上層水相移至一新的離心管中；6) 加入1X倍體積的異丙醇，輕輕混勻，-2(TC放置30min;7) 12000rpm離心10min,棄去上清；8) 70%乙醇洗滌沉淀，12000rpm離心2min;再用100%乙醇洗一次；9) 棄去上清，真空干燥5min;10) 沉淀溶于50uLTE (pH8.0)之中，-20'C保存?zhèn)溆谩?br> 4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于第(2)步中，進(jìn)行PCR的反應(yīng)條件如下先94。C 3min變性；然后94°C 30sec， 52°C lmin, 72°C lmin, 35個(gè)循環(huán)；最后72°C 10min。
5、 一種用于檢測香蕉束頂病毒的試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的引物。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于還包括DNA聚合酶混合物，香蕉束頂病毒陽性對(duì)照。
全文摘要
本發(fā)明提供一種香蕉束頂病毒PCR檢測引物及其檢測試劑盒，其中，其上游引物BBTV-P15’-ATGTGGTATGCTGGATGTTC-3’，下游引物BBTV-P25’-GTTCATATTTCCCGCTTTGA-3’。利用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測，能大大降低交叉污染的機(jī)率，又使檢測效率大幅度提高，同時(shí)檢測靈敏度也非常高，操作簡單方便，防止交叉污染。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101487058SQ200810187898
公開日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2008年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月25日
發(fā)明者楊雷亮, 王龍貴, 維 管, 陳定虎 申請(qǐng)人:中山出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心;陳定虎;王龍貴