專利名稱：：阿佛曼鏈霉菌種的重離子輻照誘變及輻照菌種的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物菌種選育的領(lǐng)域，尤其是采用重離子12C+6輻照誘變。
背景技術(shù)：
：優(yōu)良的微生物菌種是發(fā)酵工業(yè)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，要使發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的種類、產(chǎn)量和質(zhì)量有較大的改善，首先必須選育性能優(yōu)良的生產(chǎn)菌種。目前常用的發(fā)酵微生物菌種選育技術(shù)，一種是常規(guī)的誘變育種方法，另一種是分子育種方法。常規(guī)的誘變育種方法采用物理誘變因子如紫外線等進(jìn)行誘變育種，或者采用化學(xué)誘變因子如硫酸二乙酯(DES)、亞硝基胍、氯化鋰、香豆素等進(jìn)行誘變育種，或者采用物理因子和化學(xué)因子的復(fù)合誘變育種。常規(guī)育種具有盲目性強(qiáng)，工作量大、成功率低，而且現(xiàn)有的生產(chǎn)菌種對(duì)以往常用的物理和化學(xué)方法均表現(xiàn)出不同的抗性。分子育種方法是采用原生質(zhì)體融合技術(shù)和DNA重組技術(shù)等一系方法選育菌種，該方法操作難度大，而且由于發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模大，基因工程菌經(jīng)反擴(kuò)大培養(yǎng)很容易引起質(zhì)粒失活甚至丟失，造成基因表達(dá)困難。因此尋找新的誘變育種方法是迫切要解決的問(wèn)題。阿維菌素是當(dāng)今最受關(guān)注的生物殺蟲殺螨劑之一，是被推薦使用的高效低毒農(nóng)藥，阿維菌素(Avermectin)是由阿佛曼鏈霉素經(jīng)液體發(fā)酵加工而成，與傳統(tǒng)農(nóng)、獸藥相比，具有高效、廣譜、劑量小、適口性好、有效期長(zhǎng)、不易產(chǎn)生抗藥性，易降解，無(wú)殘留等特點(diǎn)，且不易產(chǎn)生耐藥性，與其他殺蟲藥無(wú)交叉抗性。在土壤降解快、光解迅速。對(duì)作物安全，不易產(chǎn)生藥害。目前影響其發(fā)展的主要原因?yàn)樽鳛榫N的阿佛曼鏈霉菌發(fā)酵效價(jià)提升緩慢，甚至長(zhǎng)期得不到突破性進(jìn)展。天然阿維菌素中含有8個(gè)組分，主要有4種即Ala、A2a、Bla和B2a，其總含量》80%;對(duì)應(yīng)的4個(gè)比例較小的同系物是Alb、A2b、Blb和B2b，其總含量《20%。目前市售阿維菌素農(nóng)藥是以abamectin為主要?dú)⑾x成分(AvermectinBla+Blb，其中Bla不低于90%、Blb不超過(guò)5%)，以Bla的含量來(lái)標(biāo)定。AVMBla分子式C48H72014(R=C2H5)AVMBla分子量872阿維菌素為白色或淡黃色結(jié)晶物，熔點(diǎn)為157_162°C，a(CHC13)=+55.7在237、245、254nm處均有吸收峰，Amax=244±2nm，阿維菌素溶于甲苯、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、乙醇等溶劑，微溶于正己烷和石油醚，在水中的溶解度極低(10i!g/l)，本品應(yīng)在干燥、密閉、陰涼遮光下保存。分子中無(wú)酸性或堿性官能團(tuán)，在一般條件下穩(wěn)定，在ra5-9時(shí)不會(huì)水解，無(wú)腐蝕性，對(duì)環(huán)境安全。阿佛曼鏈霉菌菌種的選育時(shí)，經(jīng)紫外線和亞硝基胍反復(fù)處理，菌種的發(fā)酵效價(jià)得到了顯著的提高，從野生菌種發(fā)酵效價(jià)的10微克/毫升提高到了目前的4000微克/毫升，但是再提高已經(jīng)非常困難，嚴(yán)重影響了生產(chǎn)規(guī)模，生產(chǎn)成本居高不下。業(yè)內(nèi)人士目前面臨的主要問(wèn)題是尋求一種能提高菌種選育技術(shù)水平的好方法，以便得到一種對(duì)阿維菌素深層培養(yǎng)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種和達(dá)到大幅度降低生產(chǎn)成本的目的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的為提供一種正突變變率高，發(fā)酵效價(jià)高、誘變條件可控可調(diào)可多次重復(fù)的阿佛曼鏈霉菌種的重離子輻照誘變及輻照菌種的培養(yǎng)方法。菌種的中能重離子束輻照誘變是一種新近發(fā)現(xiàn)的獨(dú)特的物理誘變方法，因?yàn)橹仉x子束具有參數(shù)多樣，LET大，RBE高等特性，利用它可提高突變率，拓寬突變譜，縮短育種周期，是近年來(lái)輻射育種的一種新方法。實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案為阿佛曼鏈霉素菌種用12C+6重離子束輻照進(jìn)行誘變，輻照劑量范圍為40-70Gy，優(yōu)選劑量為50Gy。阿佛曼鏈霉菌種的重離子輻照誘變及輻照菌種的培養(yǎng)方法的具體步驟(1)阿佛曼鏈霉素菌種孢子懸液用12C+6重離子束輻照進(jìn)行誘變；(2)將輻照誘變后的孢子懸液和出發(fā)菌種的孢子懸液分別進(jìn)行梯度稀釋，用生理鹽水稀釋至10—4_10—5倍；(3)將稀釋的懸液準(zhǔn)確轉(zhuǎn)到分離平板培養(yǎng)基上，涂抹均勻，分離單個(gè)菌落，測(cè)定最佳正突變率最佳誘變劑量；(4)對(duì)突變明顯的菌落，用接種環(huán)取菌落孢子接種在斜面培養(yǎng)基上；(5)將(3)的平板培養(yǎng)基與(4)的斜面培養(yǎng)基包扎后置于28t:恒溫箱中培養(yǎng)6天，再置于2-4t:冰箱中等待菌種接種；(6)對(duì)比輻照誘變菌種與出發(fā)菌種的平板培養(yǎng)結(jié)果和斜面培養(yǎng)結(jié)果，得出最佳正突變率、最佳誘變劑量，測(cè)出致死率和菌落態(tài)，得到高效價(jià)菌種。斜面培養(yǎng)基及分離平板培養(yǎng)基配方可溶性淀粉7g、葡萄糖5g、氯化鈉0.5g、硫酸銨2g、硫酸鎂lg、磷酸氫二鉀3g、輕質(zhì)碳酸鈣3g、瓊脂粉20g。斜面培養(yǎng)基及分離平板培養(yǎng)基的制備方法如下(1)準(zhǔn)確稱量可溶性淀粉、葡萄糖、氯化鈉、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸氫二鉀依次加入燒杯中，攪拌均勻后調(diào)節(jié)ra值至7.50;(2)加入瓊脂粉攪拌均勻，加熱煮沸，待瓊脂充分溶解，加入輕質(zhì)碳酸鈣攪拌均勻，定溶質(zhì)1000ml，再煮沸，趁熱分別分裝在試管中和三角瓶中；(3)加棉塞包扎試管和三角瓶后，進(jìn)行120_123°C，22分鐘的高壓滅菌；(4)斜面培養(yǎng)基的制備滅菌結(jié)束后，待培養(yǎng)基溫度降至50-6(TC培養(yǎng)基在試管中制備成斜面，待瓊脂凝固后，置37t:的恒溫箱中空培6-7天，置入2-4t:冰箱保存等待菌種接種；分離平板培養(yǎng)基的制備待三角瓶中的分離培養(yǎng)基溫度降至50-6(TC時(shí)，趁熱在平皿上制備平板培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后包扎，置37t:的恒溫箱中空培6-7天，置入2-4t:冰箱保存，等待菌種接種。本技術(shù)方案的實(shí)驗(yàn)情況如下1實(shí)驗(yàn)材料和儀器1.1出發(fā)菌種阿佛曼菌種系列的除蟲鏈霉菌S.avermitilisZJAV-A1。1.2儀器及試劑41.2.1"HIFRL"型中能重離子加速器，中科院蘭州近代物理研究所提供。1.2.2美國(guó)瓦里安Prostar210型高效液相色譜儀，瓦里安Prostar325型紫外_可見檢測(cè)器1.2.3超凈工作臺(tái)1.2.4旋轉(zhuǎn)搖瓶機(jī)，型號(hào)X-X1.2.5離心機(jī)AnkeTDL81.2.6隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱WGP-6001.2.7pH計(jì)pHS-3C型，上海雷磁儀器廠1.2.8電子精密天平FA2004ElectronicBalanceAccuracy:0.lmg1.2.9生物顯微鏡CX21BIM1.2.10高壓蒸汽滅菌器1.2.11SB超聲波清洗器上海Branson公司1.2.12生理鹽水，無(wú)水甲醇(分析純)，無(wú)水甲醇(HPLC純)，雙蒸餾水。2.實(shí)驗(yàn)步驟及方法2.1菌種的活化取已知效價(jià)且生產(chǎn)性能優(yōu)良的除蟲鏈霉菌S.avermitilisZJAV-A1菌種一支，放置在恒溫緩沖間(28°C士0.6t:，30min)，使其活化。2.212C+6離子束穿透誘變對(duì)出發(fā)菌株S.avermitilisZJAV-A1分批設(shè)計(jì)多點(diǎn)的不同輻照劑量，以重離子加速器提供的12C+6離子束對(duì)阿維菌素菌種孢子懸浮液二個(gè)樣品進(jìn)行第一次輻照誘變，對(duì)突變菌株進(jìn)行篩選、檢測(cè)，掌握輻照劑量與正突變菌株產(chǎn)生之間的規(guī)律和趨勢(shì)。在第一次的基礎(chǔ)上，調(diào)整劑量再進(jìn)行第二次輻照誘變。處理4次，然后將處理過(guò)的孢子懸液梯度稀釋，準(zhǔn)確吸取一個(gè)樣品的孢子懸液O.2ml/板，倒在制好的分離平板培養(yǎng)基上，分離單個(gè)菌落，以追求最佳正突變率及最佳誘變劑量。同時(shí)，以出發(fā)菌種另一個(gè)樣品孢子懸液同法以普通分離平板培養(yǎng)基分離對(duì)照，以便進(jìn)行菌落形態(tài)對(duì)比和致死率統(tǒng)計(jì)。待分離平板培養(yǎng)基在28°C士0.6t:培養(yǎng)6-7天生長(zhǎng)成熟，于冰箱中2-4t:保存?zhèn)溆?。研究重離子束12C+6離子對(duì)出發(fā)菌種誘變劑量的選擇，誘變劑量對(duì)菌種的致死率，菌種致死率與誘變后篩選出高產(chǎn)菌株的趨勢(shì)。2.3正突變菌株的篩選2.3.1單個(gè)菌落的挑選在超凈工作臺(tái)，從分離好的平板上仔細(xì)挑選孢子灰白色、豐滿的單菌落，以及菌落形態(tài)有一定變異的單菌落，在記錄好菌落詳細(xì)形態(tài)及大小后轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基上，于恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C±0.6t:、培養(yǎng)時(shí)間為6-7天后冷藏備用。2.3.2致死率統(tǒng)計(jì)分別對(duì)每個(gè)劑量經(jīng)過(guò)挑選轉(zhuǎn)接后的分離平板和出發(fā)菌種對(duì)照平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，然后按劑量分別計(jì)算出誘變前后的平均孢子濃度，統(tǒng)計(jì)出每個(gè)劑量的致死率。誘變前孢子濃度(個(gè)/ml)-誘變后孢子濃度(個(gè)/ml)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>2.3.3搖瓶初篩2.3.3.1—級(jí)搖瓶發(fā)酵取出已生長(zhǎng)成熟的轉(zhuǎn)接斜面菌種進(jìn)行觀察，將長(zhǎng)好的孢子挖取一定量轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以220-260r/min旋轉(zhuǎn)搖瓶機(jī)，恒溫、恒濕條件下進(jìn)行一級(jí)發(fā)酵。2.3.3.2二級(jí)搖瓶發(fā)酵取培養(yǎng)好的種子液以一定的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基(60ml/500ml三角瓶)進(jìn)行二級(jí)發(fā)酵，以220-260r/min旋轉(zhuǎn)搖瓶機(jī)，恒溫、恒濕條件下培養(yǎng)9-10天后進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)。2.3.4發(fā)酵觀察發(fā)酵過(guò)程中仔細(xì)觀察發(fā)酵液的顏色、氣味的變化，以及進(jìn)行涂片鏡檢仔細(xì)觀察菌絲的形態(tài)以及自溶現(xiàn)象等。2.4效價(jià)測(cè)定2.4.1菌絲溶媒萃取取發(fā)酵液3ml于具塞離心管中，4000r/min離心10min，棄上清。加入甲醇至9ml，于旋渦式混合器上振蕩lh，4000r/min離心10min，取上清液稀釋10倍，O.5ym樣品濾膜過(guò)濾器過(guò)濾、待測(cè)。2.4.2HPLC-UV法測(cè)定效價(jià)采用C18反相柱，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，顆粒大小5iim，柱長(zhǎng)250mm，內(nèi)徑4.6mm不銹鋼柱，流動(dòng)相為無(wú)水甲醇水(85:15)，流速lml/min，進(jìn)樣量20u1/次(樣品管20ul)，檢測(cè)波長(zhǎng)245nm，AVMBla和AVMBlb的分離度應(yīng)符合規(guī)定(>1.5)。準(zhǔn)確吸取20ul樣品進(jìn)樣，根據(jù)樣品、對(duì)照品AVMBla的峰面積，以及樣品的稀釋倍數(shù)計(jì)算發(fā)酵液AVMB^含量。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>3結(jié)果3.1輻照劑量與致死率結(jié)果列于表1。表1輻照劑量與阿佛曼鏈霉菌致死率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>輻照劑量與阿佛曼鏈霉菌致死率趨勢(shì)示于附圖13.2輻照劑量與正突變率輻照劑量與阿佛曼鏈霉菌正突變率趨勢(shì)示于附圖212C+6對(duì)阿維菌素菌種正突變的最佳輻照劑量范圍40-70Gy，在50Gy該劑量范圍內(nèi)得到的最高正突變率為34%。3.3菌落形態(tài)分析出發(fā)菌種S.avermitilisPAN-A1與正突變菌株S.avermitilisPAN-YII的生長(zhǎng)及形態(tài)分別存在以下特征PAN-Al與PAN-YII在基本培養(yǎng)基上都能迅速生長(zhǎng)，28。C培養(yǎng)6_7d，PAN-A1菌落直徑可達(dá)12mm，孢子區(qū)直徑為約為1mm;而PAN-YII的菌落直徑可達(dá)24mm，孢子區(qū)直徑約2-3mm，且PAN-Al的孢子為灰白色，色較深，泛黃；而PAN-YII的孢子為灰白色，色較淡，有朦朧感。菌懸液經(jīng)12C+6離子束處理后，所培養(yǎng)形成的菌落形態(tài)變化很大，但主要表現(xiàn)為以下三種形態(tài)1.光禿型不產(chǎn)抗；2.饅頭型產(chǎn)抗能力較差；3.草帽型產(chǎn)抗能力最好。3.4搖瓶效價(jià)分析采用12C+6離子束貫穿誘變對(duì)出發(fā)菌種S.avermitilisPAN-A1進(jìn)行處理，經(jīng)初篩、復(fù)篩后，得到的高產(chǎn)除蟲鏈霉菌突變株，對(duì)此高產(chǎn)除蟲鏈霉菌突變株進(jìn)行斜面培養(yǎng)，搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵觀察以及提取工藝。對(duì)經(jīng)誘變處理獲得的菌株及出發(fā)菌株進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如圖3所示。通過(guò)圖譜分析可以得知，這次經(jīng)過(guò)誘變處理后所得到的除蟲鏈霉菌突變株，與出發(fā)菌種相比，雜質(zhì)比例明顯降低，主要活性成分AVMBla在產(chǎn)物中的所占比例明顯提高，效價(jià)可達(dá)5500微克/毫升以上。此高效價(jià)菌株連續(xù)傳代三次，阿維菌素生產(chǎn)能力基本穩(wěn)定保持不變.4結(jié)論通過(guò)重離子輻照阿維菌素菌種，劑量效應(yīng)研究，得出如下結(jié)論。半致死劑量為23Gy左右，正突變率為4%;正突變的最佳輻照劑量范圍40-70Gy;97%致死劑量為50Gy，正突變率最高為34%。基礎(chǔ)菌株用重離子加速器誘變處理后，挑選出了突變形態(tài)典型的單菌株850株，通過(guò)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)測(cè)試效價(jià)后，得到29株正突變的菌株，發(fā)酵效價(jià)提高了802000微克采用重離子加速器第一次誘變處理后，阿維菌素菌種的正突變率為3.41%，菌種Fl代的發(fā)酵效價(jià)比基礎(chǔ)菌株4000微克/毫升提高到6000微克/毫升左右，提高幅度約50%，由此可見，用重離子加速器進(jìn)行誘變育種使抗生素生產(chǎn)菌種提高發(fā)酵效價(jià)，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明具有以下有益效果(1)變異穩(wěn)定可靠、快，可以大大縮短育種周期；(2)突變?nèi)菀卓刂?，方法?jiǎn)便易行；(3)變異譜寬，能產(chǎn)生新的菌種類型；(4)變異頻率高，比自然變異率高1000倍以上。圖1為本發(fā)明輻照劑量與阿佛曼鏈霉菌致死率趨勢(shì)圖圖2為輻照劑量與阿佛曼鏈霉菌正突變率趨勢(shì)圖圖3為誘變處理獲得的菌株及出發(fā)菌株的效價(jià)測(cè)定結(jié)果圖圖4為阿維菌素的結(jié)構(gòu)圖具體實(shí)施例方式1、用重離子加速器提供的"C+e離子束對(duì)出發(fā)菌株S.avermitilisPAN-A1兩個(gè)試樣的孢子懸浮液進(jìn)行輻照誘變，設(shè)計(jì)劑量為0、0.25、0.5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80Gy，進(jìn)行第一次輻照誘變，研究輻照劑量與發(fā)生正突變菌株的規(guī)律，調(diào)整輻照劑量，再進(jìn)行第二次輻照誘變。2、對(duì)上述處理過(guò)的孢子懸浮液進(jìn)行梯度稀釋，準(zhǔn)確吸取一個(gè)試樣的孢子懸浮液0.2ml/板，倒在制好的分離平板培養(yǎng)基上，分離單個(gè)菌落，獲得高效價(jià)，并得出最佳正突變率和誘變劑量。3、將發(fā)出菌種另一個(gè)試樣孢子懸浮液用上述同樣的方法以普通分離培養(yǎng)基分離對(duì)照，進(jìn)行菌落形態(tài)對(duì)比和致死率統(tǒng)計(jì)。以上斜面培養(yǎng)基及分離平板培養(yǎng)基的配方為可溶性淀粉7g、葡萄糖5g、氯化鈉0.5g、硫酸銨2g、硫酸鎂lg、磷酸氫二鉀3g、輕質(zhì)碳酸鈣3g、瓊脂粉20g。斜面培養(yǎng)基及分離平板培養(yǎng)基的制備方法如下(1)準(zhǔn)確稱量可溶性淀粉、葡萄糖、氯化鈉、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸氫二鉀依次加入i號(hào)燒杯中，攪拌均勻后調(diào)節(jié)ra值至7.50;(2)加入瓊脂粉攪拌均勻，加熱煮沸，待瓊脂充分溶解，加入輕質(zhì)碳酸鈣攪拌均勻，定溶質(zhì)1000ml，再煮沸，趁熱分裝；(3)每支15X150mm的試管中分裝5ml，每支250ml三角瓶分裝200ml加棉塞包扎試管和三角瓶后，進(jìn)行120°C，20分鐘的高壓滅菌；(4)斜面的制備滅菌結(jié)束后，待培養(yǎng)基溫度降至55t:培養(yǎng)基在試管中制備成斜面，待瓊脂凝固后，置37t:的恒溫箱中空培7天，置入3t:冰箱保存等待接種菌種；分離平板培養(yǎng)基的制備待三角瓶中的分離培養(yǎng)基溫度降至6(TC時(shí)，趁熱在平皿上制備平板，在每個(gè)90mm的無(wú)菌平皿中加入培養(yǎng)基15ml，待瓊脂凝固后包扎，置37t:的恒溫箱中空培7天，置入2t:冰箱保存等待接種菌種。權(quán)利要求阿佛曼鏈霉菌種的重離子輻照誘變及輻照菌種的培養(yǎng)方法，其特征為(1)阿佛曼鏈霉素菌種孢子懸液用12C+6重離子束輻照進(jìn)行誘變，輻照劑量范圍為40-70Gy；(2)將輻照誘變后的孢子懸液和出發(fā)菌種的孢子懸液分別進(jìn)行梯度稀釋，用生理鹽水稀釋至10-4-10-5；(3)將稀釋的懸液準(zhǔn)確轉(zhuǎn)到分離平板培養(yǎng)基上，涂抹均勻，分離單個(gè)菌落，測(cè)定最佳正突變率最佳誘變劑量；(4)對(duì)突變明顯的菌落，用接種環(huán)取菌落孢子接種在斜面培養(yǎng)基上；(5)將(3)的平板培養(yǎng)基與(4)的斜面培養(yǎng)基包扎后置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)6天，再置于2-4℃冰箱中等待菌種接種；(6)對(duì)比輻照誘變菌種與出發(fā)菌種的平板培養(yǎng)結(jié)果和斜面培養(yǎng)結(jié)果，得出最佳正突變率、最佳誘變劑量，測(cè)出致死率、觀察菌落形態(tài)，得到正突變的菌株。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿佛曼鏈霉菌種的重離子輻照誘變及輻照菌種的培養(yǎng)方法，其特征為12C+6重離子束輻照進(jìn)行誘變的劑量為50Gy。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的阿佛曼鏈霉菌種的重離子輻照誘變及輻照菌種的培養(yǎng)方法，其特征為斜面培養(yǎng)基及分離平板培養(yǎng)基配方可溶性淀粉7g、葡萄糖5g、氯化鈉0.5g、硫酸銨2g、硫酸鎂lg、磷酸氫二鉀3g、輕質(zhì)碳酸鈣3g、瓊脂粉20g，加水定容至1000ml。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的阿佛曼鏈霉菌種的重離子輻照誘變及輻照菌種的培養(yǎng)方法，其特征為斜面培養(yǎng)基及分離平板培養(yǎng)基的制備方法如下(1)準(zhǔn)確稱量可溶性淀粉、葡萄糖、氯化鈉、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸氫二鉀依次加入燒杯中，攪拌均勻后調(diào)節(jié)ra值至7.50;(2)加入瓊脂粉攪拌均勻，加熱煮沸，待瓊脂充分溶解，加入輕質(zhì)碳酸鈣攪拌均勻，加水定溶至1000ml，再煮沸，趁熱分別分裝在試管中和三角瓶中；(3)加棉塞包扎試管和三角瓶后，進(jìn)行120-123°C，20分鐘的高壓滅菌；(4)斜面培養(yǎng)基的制備滅菌結(jié)束后，待培養(yǎng)基溫度降至50-6(TC培養(yǎng)基在試管中制備成斜面，待瓊脂凝固后，置37°C的恒溫箱中空培6-7天，置入2-4t:冰箱保存等待菌種接種；分離平板培養(yǎng)基的制備待三角瓶中的分離培養(yǎng)基溫度降至50-60°C時(shí)，趁熱在平皿上制備平板培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后包扎，置37°C的恒溫箱中空培6-7天，置入2-4t:冰箱保存，等待菌種接種。全文摘要本發(fā)明為阿佛曼鏈霉菌種的重離子輻照誘變方法及輻照菌種的培養(yǎng)，涉及微生物菌種選育的領(lǐng)域，阿佛曼鏈霉菌種用現(xiàn)有的誘變方法發(fā)酵效價(jià)達(dá)到4000微克/毫升，再提高已非常困難，為此本發(fā)明采用12C+6重離子束輻照進(jìn)行誘變，輻照劑量40-70Gy，優(yōu)選輻照劑量50Gy，進(jìn)行平板培養(yǎng)基及斜面培養(yǎng)基的正突變菌株篩選，發(fā)酵效價(jià)可達(dá)到6000微克/毫升，得到高效價(jià)菌種，本發(fā)明具有變異穩(wěn)定、快速、突變?nèi)菀卓刂?、方法?jiǎn)便易行的有益效果。文檔編號(hào)C12N15/01GK101768585SQ20081018796公開日2010年7月7日申請(qǐng)日期2008年12月31日優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日發(fā)明者劉敬,李文建,王曙陽(yáng),陳積紅,頡紅梅申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所