專利名稱：Emx2腺病毒載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥的基因治療。具體地說，本發(fā)明涉及腺病毒表達(dá)載體介導(dǎo)的EMX2基因表達(dá)及其在治療癌癥以及延緩癌癥的復(fù)發(fā)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肺癌是世界上最常見的，也是致死率最高的癌癥。同源盒(Homeobox)基因介導(dǎo)胚胎成型，近年來被認(rèn)為同成癌作用相關(guān)聯(lián)[l]。 EMX2是果蠅ems基因的人類同源基因，它是一個(gè)包含同源結(jié)構(gòu)域(Homeodomain)的轉(zhuǎn)錄因子，在早期頭部發(fā)育過程中起到重要作用。例如，EMX2同源突變(EMX2-/-)老鼠表現(xiàn)出縮小的大腦半球和嗅球[2]。 EMX2的過量表達(dá)能夠降低對(duì)稱分裂的頻率，從而EMX2通過調(diào)節(jié)對(duì)稱分裂頻率影響成人神經(jīng)干細(xì)胞的增殖[3]。 EMX2通過調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖但不影響其分化，進(jìn)而控制哺乳動(dòng)物的生殖[4]。EMX2基因功能的缺失導(dǎo)致發(fā)育中的哺乳動(dòng)物前腦胞中Wntl表達(dá)異常，引起皮質(zhì)發(fā)育異常[5]。然而EMX2在成癌過程中的角色并不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)EMX2基因在肺癌中能下調(diào)Wnt癌基因，降低Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路水平并影響腫瘤細(xì)胞增殖和存活。同時(shí)發(fā)明人最新的結(jié)果表明，EMX2表達(dá)量的高低和癌癥患者的預(yù)后及復(fù)發(fā)有直接的相關(guān)性EMX2表達(dá)高的病人的預(yù)后明顯優(yōu)于EMX2表達(dá)低的病人；EMX2表達(dá)高的病人的癌癥復(fù)發(fā)時(shí)間明顯晚于EMX2表達(dá)低的病人。因此發(fā)明人認(rèn)為利用表達(dá)EMX2的基因治療方法可以起到治療癌癥和延緩癌癥復(fù)發(fā)的作用。 本發(fā)明一方面涉及EMX2基因，其包含序列表中序列l(wèi)(SEQ ID N0:1)所示的DNA序列，以及該序列的如下變體 1.其編碼在SEQ ID NO :1所編碼的蛋白的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)(優(yōu)選1至6個(gè))氨基酸且具有SEQ ID NO :1所編碼的蛋白的活性；
2.在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO :1的DNA序列雜交且具有SEQ IDN0 :1的DNA的活性的DNA。其中所述嚴(yán)格條件例如是68。。 本發(fā)明另一方面涉及包含上述EMX2基因的載體。優(yōu)選地，所述載體是腺病毒載體。更優(yōu)選地，所述載體是E1/E3缺失型的人5型腺病毒載體。
本發(fā)明另 一方面涉及包含上述載體的藥物組合物。 本發(fā)明還涉及EMX2基因在制備用于治療癌癥以及延緩癌癥的復(fù)發(fā)的藥物中的應(yīng)用。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述癌癥選自肺癌、乳癌、肝癌、胃癌。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述癌癥是肺癌。 本發(fā)明還涉及治療癌癥以及延緩癌癥的復(fù)發(fā)的方法，包括給病人施用包含EMX2基因的載體。


圖1顯示基因治療表達(dá)載體。 圖2顯示EMX2腺病毒對(duì)Wnt癌基因的表達(dá)量的影響。 圖3顯示EMX2腺病毒對(duì)Wnt信號(hào)通路活性的影響。 圖4顯示EMX2腺病毒對(duì)肺癌細(xì)胞A549生長速率的影響。 圖5顯示EMX2腺病毒對(duì)肺癌細(xì)胞H1299生長速率的影響。 圖6顯示EMX2腺病毒對(duì)肺癌細(xì)胞H322生長速率的影響。 圖7顯示EMX2腺病毒對(duì)肺癌細(xì)胞A427生長速率的影響。 圖8顯示EMX2腺病毒影響肺癌細(xì)胞存活率的影響。
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)材料和方法 基因治療表達(dá)載體構(gòu)建 將EMX2基因序列(見序列表SEQ ID NO. 1中的ORF序列)插入人源腺病毒Type5(DE1/E3)表達(dá)載體。此腺病毒表達(dá)載體利用CMV啟動(dòng)子表達(dá)EMX2基因。具體地說，將pCMV6-XL5 EMX2載體中EMX2的cDNA序列插入中轉(zhuǎn)載體(pDNR-CMV)，經(jīng)限制性內(nèi)切酶鑒定正確后，將基因表達(dá)部分轉(zhuǎn)移至腺病毒基因組載體，線性化之后轉(zhuǎn)入HEK 293細(xì)胞，約2-3周后，腺病毒量增加，濃縮后通過空斑形成實(shí)驗(yàn)精確確定活性腺病毒含量。腺病毒類型為El/E3缺失型的人5型腺病毒。載體簡圖如圖1所示。
RT-PCR : 使用TRIzol試齊U (Invitrogen， Carlsbad， CA)提取細(xì)胞總RNA，使用iScript cDNA Synthesis Kit (Biorad， Hercules, CA)對(duì)1 u g RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取1 y L進(jìn)行PCR。 EMX2弓|物序歹lj為5' -ACCTTCTACCCCTGGCTCAT-3，(正向，SEQ IDNO :2) ，5' -CCAGCTTCTGCCTTTTGAAC-3'(反向，SEQ ID NO :3) 。 GAPDH引物序列為5， -ATGGGGAAGGTGAAGGTCGG-3'(正向，SEQ ID NO :4) ，5， -GACGGTGCCATGGAATTTGC-3'(反向，SEQ ID NO :5)。 Wnt2弓| 物序歹lj 為5'-GGATGCCAGAGCCCTGATGAATCTT-3'(正向，SEQ ID NO :6) ， 5' -GCCAGCCAGCATGTCCTGAGAGTA-3'(反向，SEQ ID NO :7)。 Wnt7a弓|物序列為5'-CCTGGACGAGTGTCAGTTTCAG—3'(正向，SEQID NO :8)，5， -GGCCTCGTTGTACTTGTCCTTG-3'(反向，SEQ ID NO :9)PCR程序?yàn)?5。C，5分鐘；94。C，30秒，55 °C ， 30秒，72°C ， 1分鐘，共25-30輪；最終延伸72°C ， 7分鐘。
Western印跡 細(xì)胞經(jīng)過裂解之后，通過超速離心(44krpm，30分鐘)取上清得到細(xì)胞胞質(zhì)蛋白，SDS-PAGE電泳之后轉(zhuǎn)膜，一抗使用抗P連環(huán)蛋白(catenin) (Abcam， Cambridge, MA， USA)和抗肌動(dòng)蛋白(Sigma，Bellefonte，PA，USA)抗體孵育過夜，二抗使用HRP偶聯(lián)羊抗鼠抗體。使用GE公司的ECL發(fā)光系統(tǒng)檢測。
結(jié)晶紫染色 將待染色細(xì)胞培養(yǎng)基去除，用PBS洗一遍，加入結(jié)晶紫染料(0. 07%溶于酒精)，室溫放置30分鐘，輕輕去除染液，用清水小心漂洗，待多余染料去除徹底后，觀察拍照。
細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)物
4
所有的人類細(xì)胞系得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。這些細(xì)胞系包括肺癌A549、 H1299、 H322和A427。細(xì)胞系常規(guī)地在RPMI 1640培養(yǎng)基中在37°C、5% C02的恒溫恒濕箱中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充了 10%胎牛血清、青霉素(100 IU/ml)和鏈霉素(100 yg/ml)。 腺病毒EMX2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞 在治療前一天，將細(xì)胞(5xl04)置于6孔板中并用不含抗生素，較少血清(2. 5% )的生長培養(yǎng)基在371\5% C02的恒溫恒濕箱中培養(yǎng)。然后以相同的培養(yǎng)基中用含有不同濃度的腺病毒EMX2表達(dá)載體溫育細(xì)胞，直至下一步分析。
細(xì)胞擴(kuò)增測試 在96孔平板中用腺病毒EMX2表達(dá)載體處理細(xì)胞6_7天。根據(jù)制造商的方案用MTS測試(Promega公司)評(píng)估細(xì)胞擴(kuò)增。MTS試劑包含四唑(tetrazolium)化合物[3-(4，5- 二甲基噻唑-2-基)-5- (3-羧基甲氧基苯基)-2- (4-磺苯基)-2H-四唑，內(nèi)鹽；MTS]和電子偶聯(lián)劑(吩嗪硫酸乙酯(phenazine eth固lfate ;PES)) 。 PES具有增強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性，使得它可以與MTS結(jié)合，形成穩(wěn)定的溶液。MTS四唑化合物(Owen公司的試劑)被細(xì)胞生物還原成帶顏色的甲臘(formazan)產(chǎn)物，該產(chǎn)物可溶于組織培養(yǎng)基。此轉(zhuǎn)變可在代謝活性細(xì)胞中由脫氫酶產(chǎn)生的NADra或NADH完成。甲臘產(chǎn)物的量根據(jù)490nm吸收測定，它與培養(yǎng)物中活細(xì)胞的數(shù)目成正比。由于MTS甲臘產(chǎn)物可溶于組織培養(yǎng)基，與使用四唑化合物(例如MTT)的方法相比，此測試的步驟較少。MTT還原的甲臘產(chǎn)物是結(jié)晶沉淀物，在記錄570nm吸收讀數(shù)之前，需要額外的步驟來溶解結(jié)晶。劑量滴定和時(shí)程實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行三次。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所示數(shù)據(jù)以數(shù)據(jù)以平均值(+標(biāo)準(zhǔn)差)表示。未配對(duì)的T-Test用于比較對(duì)照組和不同的治療組。 實(shí)施例1 :EMX2腺病毒影響Wnt基因表達(dá) 使用兩種濃度(200PFU/細(xì)胞、500PFU/細(xì)胞，分別標(biāo)記為E200、E500的EMX2腺病毒作用于肺癌細(xì)胞(A549、 H1299、 H322和A427)，對(duì)照組為使用含熒光素酶(Luciferase)的腺病毒(500PFU/細(xì)胞，標(biāo)記為L500)作用細(xì)胞。6小時(shí)后換為普通培養(yǎng)基。3天后提取細(xì)胞總RNA，并用等量的RNA用于RT-PCR分析。結(jié)果表明，EMX2腺病毒作用細(xì)胞后，EMX2表達(dá)量顯著上升；Wnt2(有證據(jù)顯示其在肺癌中為癌基因)基因表達(dá)量在A549、 H1299和H322細(xì)胞中下降，在A427細(xì)胞中上升；Wnt7a(有證據(jù)顯示其在肺癌中為抑癌基因)表達(dá)量在A549細(xì)胞中上升，在H322細(xì)胞中變化不明顯，在H1299和A427細(xì)胞中未表達(dá)。此結(jié)果表明，EMX2腺病毒可以使Wnt癌基因的表達(dá)量降低，使Wnt抑癌基因的表達(dá)量升高(圖2)。GAPDH(3-磷酸甘油醛脫氫酶)作為上樣參照。
實(shí)施例2 :EMX2腺病毒影響Wnt信號(hào)通路活性 使用兩種濃度(200PFU/細(xì)胞、500PFU/細(xì)胞，分別標(biāo)記為E200、 E500)的EMX2腺病毒作用于肺癌細(xì)胞(A549、H322和A427)，對(duì)照組為使用含熒光素酶(Luciferase)的腺病毒(500PFU/細(xì)胞，標(biāo)記為L500)作用細(xì)胞。6小時(shí)后換為普通培養(yǎng)基。3天后提取細(xì)胞胞質(zhì)蛋白(Cytosolicprotein)，并用等量的蛋白用于蛋白印跡(Western blotting)分析。結(jié)果表明，EMX2腺病毒作用細(xì)胞后，胞質(zhì)13連環(huán)蛋白(Wnt信號(hào)通路活性表征蛋白)表達(dá)
5量在A549和H322細(xì)胞中顯著下降，在A427細(xì)胞中上升。此結(jié)果表明，EMX2腺病毒可以使 Wnt信號(hào)通路活性降低(圖3)。
P-肌動(dòng)蛋白(e-actin)作為上樣參照。
實(shí)施例3 :EMX2腺病毒影響肺癌細(xì)胞生長速率 使用EMX2腺病毒作用于肺癌細(xì)胞(A549、 H1299、 H322和A427)，對(duì)照組為使用含熒 光素酶(Luciferase)的腺病毒作用細(xì)胞。6小時(shí)后換為普通培養(yǎng)基。從腺病毒作用細(xì)胞1天 開始，每天利用MTT實(shí)驗(yàn)監(jiān)測細(xì)胞生長速率，共監(jiān)測5天。結(jié)果表明，EMX2腺病毒作用細(xì)胞5 天后，A549、 H1299、 H322細(xì)胞比對(duì)照有顯著性差異(p < 0. 05) ， A427細(xì)胞生長速率變化不明 顯(p > 0. 05)。此結(jié)果表明，EMX2腺病毒可以使肺癌細(xì)胞生長速率降低(圖4、5、6、7)。
實(shí)施例4 :EMX2腺病毒影響肺癌細(xì)胞存活率 使用兩種濃度(200PFU/細(xì)胞、500PFU/細(xì)胞，分別標(biāo)記為EMX200、E500)的EMX2腺 病毒作用于肺癌細(xì)胞(A549、H1299、H322和A427)，對(duì)照組為使用含熒光素酶(Luciferase) 的腺病毒(500PFU/細(xì)胞，標(biāo)記為L500)作用細(xì)胞。6小時(shí)后換為普通培養(yǎng)基。4天后利用結(jié) 晶紫染色，觀察細(xì)胞存活率。發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組，EMX2腺病毒作用下的A549、H1299和H322 細(xì)胞存活率明顯下降，而A427細(xì)胞存活率變化不明顯。此結(jié)果表明，EMX2腺病毒可以降低 細(xì)胞存活率(圖8)。 實(shí)施例5 :EMX2變體腺病毒影響肺癌細(xì)胞存活率
制備如下EMX2變體缺失型SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11、SEQ ID NO :12 ;
添加型SEQ ID NO :13。 SEQ ID NO :10-13均可以在嚴(yán)格條件(68° )下與SEQ ID NO :1雜交。
用SEQ ID NO :10-13重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，得到與SEQ ID NO :1相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
參考文獻(xiàn) [l]Raman V， Tamori A， Vali M， et al. H0XA5 regulates expression ofthe progesterone receptor. J Biol Chem. 2000 ;275 (34) :p. 26551-5. [2]Dalton D， Chadwick R， McGi皿is W. Expression and embryonicf皿ction of empty spiracles :a Drosophila homeo box gene with twopatterning functions on the anterior—posterior axis of the embryo. Genes Devl989 ;3 :1940—56.
[3]Galli R，F(xiàn)iocco R，De Filippis L，et al. Emx2 regulates th印roliferation of stem cells of the adult mammalian central nervous system. Development 2002; 129 :1633-44. [4]Taylor HS， Fei X.Emx2 regulates mammalian reproduction byaltering
endometrial cell proliferation. Mol Endocrinol 2005 ;19 :2839—46. [5]Ligon KL， Echelard Y， Assimacopoulos S， et al丄oss of Emx2function
leads to ectopic expression of Wntl in the developing telenc印halonand cortical
dysplasia. Development 2003 ;130 :2275-87. 序列表 〈110〉陳釗，許軍普，何颼
〈120>EMX2腺病毒載體及其應(yīng)用
〈210>1
〈211>2907
〈212>DNA 〈213〉人源EMX2mRNA序列(ACCESSION :AF301598)，其中黑體加下畫線部分為 EMX2基因的開放閱讀框(ORF):〈400>1cgggcgccgc3gg￡lgCg￡lgtgagctgggagcg鄉(xiāng)ggcga鄉(xiāng)cgcggagaagcccggccgcccggtgggCggC卿3ggctcagccgaggcggcggcgccgactccgttccactctcggcccggatccaggcctccgggttcccaggcgctcacctccctctgacgcacctccccccttccacctcagggcgaccaatcatcaagccatttaccaggcttCgg￡lgg￡l￡lgctgtttatgtgatccccgcactaattaggctcatgaactaacaaatcgtttgcacaacttgtg朋g朋gcgaacacttccatggattgtccttggacttagggcgccctgcccgccttttgc卿gg卿aaaaacttttttttttttttgcctcccccgagaactttccccccttctcctccctgcctctaactccgatCCCCCC3CgCcatctcgccaa a a a a a a a a aa a a g a a a a a aaattaccccaatccacgcctgcaaattcttctgg卿gattttcccccctctcttcaggttgggcgcgtttggtgca卿ttctcgggatcctcggctttgcctctccctctccctcccccctcctttcctttttcctttcctttcctttctttcttcctttccttccccCC3CCCCC3CCCCC3CCCC3tccccaattctcgtccgtcctcgccgcgggcagcgggcggcgg鄉(xiāng)cagcgtgcggcggtcgccaggagcgggcgcccgctcctcggcgcagcatgttccagccggcgcccaagcgctgcttcaccatcgagtcgctggtggCC33gg3Cagtcccctgcccgcctcgcgctccgaggaccccatccgtcccgcggcactcagctacgctaactccagccccataaatccgttcctcaacggcttccactcggccgccgccgccgccgccggteggggcgtctactccaacccggacttggtgttcgccgaggcggtctcgcacccgcccaaccccgccgtgccagtgcacccggtgccgccgccgcacgccctggccgcccacccccteccctcctcgcactcgccacaccccctattcgcctcgcagc3gcgggatccgtccaccttctacccctggctcatccaccgctaccgatatctgggtcatcgcttccaaggg^cgacact3gCCCCg3g3gtttccttttgcac朋cgcgctggcccgaa3gCCC33gCggatccgaaccgccttctccccgtcccagcttctaaggctggaacacgccttcactacgtggtgggcgccggctggcacacagcctcagcctC3Cgg^3Cgtatggtttc3g^CCg^g朋C333gttC■■ggcaga3g^ggctcagattcgcaacagggacgcaccatattaaccggtgg卿atcgccaccaagcaggcgagtc3g3Cgtg3CCtcagatgattaccteacccc3C3g^3Cggc鄉(xiāng)g卿gg3C^3CCgC3tacacgttcaCCg3g^3ggg卿ggg^tcgg鄉(xiāng)gagc3gCgg33tgCggCg33g3Ctctggacagcg鄉(xiāng)gcac鄉(xiāng)gtcccaaaccgaggccgcgcC^g3tggC3g鄉(xiāng)atggaggctccttcatc^c^gcgaccctcgtcta^gaggcagctgagtg卿g3g3gag^3g3g3gag^3gag卿g卿gag卿g卿g3g朋3gCtg3acgtgcactctgac卿gggagctgtcaat3CCgggg卿C33g3tg3ttggc鄉(xiāng)tettccgtttatcacagtccactt
3朋3CC3Cg3 CCC33CC3ggcacaggacttttttgttttttgcacttcgctgtgtttcccccccatcttt aaaaataattccatatctagccccatcccacacctgtttc aaatccttga朋tgcatgtegcagttgttgggcg^tggtcg朋朋tg朋ttgt朋ttttcttttcctttte^gacaggttctgtgtgctttttettttgatttttttt cccaagaaatgtgcagtctgtaaacactttttgataccttctgatgtcaaagtgattgtg c朋gcte朋tg朋gteggctcagcgategtggtcctcttaC3g3g^3Cgggg￡lgC￡lgg￡l Cg3Cgggggggctgggggtggcggggg鄉(xiāng)gtgcccacaagacttgtect ggg朋333朋cccctaaattcttggacattccctttcctaacatcctgag gcttaaaaccctgatgc朋3cttctcctttcagtggttggcgagttcaac cattcactgcaatgcctattccaaactttaaatctatctattgcaaaacctgaaggactg tagttagcggggatgatgtt■gtgtggcc■gcgcacggcggcaagttttcaagcactg agtttctattccaagatcatagacttacta■gagagtgacaaatgcttccttaatgtct tctataccagtttttgtgttttgtgttaatttgttagaattctaacacac tatatacttcgtcaatgtcaatattttgtca a a a a a a〈210>2〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>2ACCTTCTACCCCTGGCTCAT〈210>3〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>3CCAGCTTCTGCCTTTTGAAC〈210>4〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>4ATGGGGAAGGTGAAGGTCGG
8
〈210>5〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>5GACGGTGCCATGGAATTTGC〈210>6〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>6GGATGCCAGAGCCCTGATGAATCTT〈210>7〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>7GCCAGCCAGCATGTCCTGAGAGTA〈210>8〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>8CCTGGACGAGTGTCAGTTTCAG〈210>9〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>9
GGCCTCGTTGTACTTGTCCTTG〈210>10〈211>2907〈212>DNA〈213〉基因變體，缺失1〈400>10atgttccagccggcgcccaagcgctgcttcaccatcgagtcgctggtggCC33gg3Cagtcccctgcccgcctcgcgctccgaggaccccatccgtcccgcggcactcagctacgctaactccagccccataaatccgttcctcaacggcttccactcggccgccgccgccgccgccggteggggcgtctactccaacccggacttggtgttcgccgaggcggtctcgcacccgcccaaccccgccgtgccagtgcacccggtgccgccgccgcacgccctggccgcccacccccteccctcctcgcactcgccacaccccctattcgcctcgcagc3gcgggatccgtccaccttctacccctggctcatccaccgctaccgatatctgggtcatcgcttccaaggg^cgacact3gCCCCg3g3gtttccttttgC3C33CgCgctggcccgaa3gCCC33gCggatccgaaccgccttctccccgtcccagcttctaaggctggaacacgccttcactacgtggtgggcgccggctggcacacagcctcagcctC3Cgg^3Cgtatggtttc3g朋CCg朋g■■ggcaga3g^ggctcagattcgcaaca a a a g a a a a a3ggg3CgC3Ccatattaaccggtgg卿atcgccaccaagcaggcgagtcCgg3gg3朋t3g3Cgtg3CCtcagatgatt〈210>11〈211>2907〈212>DNA〈213〉基因變體，缺失2〈400>11cgggcgccgc3gg￡lgCg￡lgtgagctgggagcg鄉(xiāng)ggcga鄉(xiāng)cgcggagaagcccggccgcccggtgggCggC卿3ggctcagccgaggcggcggcgccgactccgttccactctcggcccggatccaggcctccgggttcccaggcgctcacctccctctgacgcacctccccccttccacctcagggcgaccaatcatcaagccatttaccaggcttCgg￡lgg￡l￡lgctgtttatgtgatccccgcactaattaggctcatgaactaacaaatcgtttgcacaacttgtg朋g朋gcgaacacttccatggattgtccttggacttagggcgccctgcccgccttttgc卿gg卿aaaaacttttttttttttttgcctcccccgagaactttccccccttctcctccctgcctctaactccgatccccccacgccatctcgccaa a a a a a a a a aa a a g a a a a a aaattaccccaatccacgcctgcaaattcttctgg卿gattttcccccctctcttcaggttgggcgcgtttggtgca卿ttctcgggatcctcggctttgcctctccctctccctcccccctcctttcctttttcctttcctttcctttctttcttcctttccttccccCC3CCCCC3CCCCC3CCCC3tccccaattctcgtccgtcctcgccgcgggcagcgggcggcgg鄉(xiāng)cagcgtgcggcggtcgccaggagcgggcgcccgctcctcggcgcagcatgttccagccggcgcccaagcgctgcttcaccatcgagtcgctggtggCC33gg3Cagtcccctgcccgcctcgcg
8/10頁
10
ctccgaggaccccatccgtcccgcggcactcagctacgctaactccagccccataaatccgttcctcaacggcttccactcggccgccgccgccgccgccggteggggcgtctactccaacccggacttggtgttcgccgaggcggtctcgcacccgcccaaccccgccgtgccagtgcacccggtgccgccgccgcacgccctggccgcccacccccteccctcctcgcactcgccacaccccctattcgcctcgcagc3gcgggatccgtccaccttctacccctggctcatccaccgctaccgatatctgggtcatcgcttccaaggg^cgacact3gCCCCg3g3gtttccttttgC3C33CgCgctggcccgaa3gCCC33gCggatccgaaccgccttctccccgtcccagcttctaaggctggaacacgccttcactacgtggtgggcgccggctggcacacagcctcagcctC3Cgg^3Cgtatggtttc3g^CCg^g3g^ggctcagattcgcaac3ggg3CgC3Ccatattaaccggtgg卿atcgccaccaagcaggcgagtc3g3Cgtg3CCtcagatgatt〈210〉12〈211〉2907〈212〉DNA〈213〉基因變體，缺失3〈400〉12atgttcc agccggcgcccaagcgctgcttcaccatcgagtcgctggtggCC33gg3Cagtcccctgcccgcctcgcgctccgaggaccccatccgtcccgcggcactcagctacgctaactccagccccataaatccgttcctcaacggcttccactcggccgccgccgccgccgccggteggggcgtctactccaacccggacttggtgttcgccgaggcggtctcgcacccgcccaaccccgccgtgccagtgcacccggtgccgccgccgcacgccctggccgcccacccccteccctcctcgcactcgccacaccccctattcgcctcgcagc3gcgggatccgtccaccttctacccctggctcatccaccgctaccgatatctgggtcatcgcttccaaggg^cgacact3gCCCCg3g3gtttccttttgC3C33CgCgctggcccgaa3gCCC33gCggatccgaaccgccttctccccgtcccagcttctaaggctggaacacgccttcactacgtggtgggcgccg■agg^gcagctggcacacagcctcagcctC3Cgg^3Cgtatggtttcag^ccg^g3g^ggctcagattcgcaac3ggg3CgC3Ccatattaaccggtgg卿atcgccaccaagcaggcgagtc3g3Cgtg3CCtcagatgattaccteacccc3C3g^3Cgggc^^gagac鄉(xiāng)g卿gg3C^3CCgC3tacacgttcaCCg3g^3ggg卿ggg^tcgg鄉(xiāng)gagc3gCgg33tgCggCg33g3Ctctggacagcg鄉(xiāng)gcac鄉(xiāng)gtcccaaaccgaggccgcgcC^g3tggC3g鄉(xiāng)atggaggctccttcatc^c^gcgaccctcgtcta^gaggcagctgagtg卿g■ggag^ag3g3gag^3g3g3gag^3gag卿g卿gag卿g卿gacgtgcactctgac卿gggagctgtcaat3CCgggg卿ggc鄉(xiāng)tettccgtttatcacagtccacttcccaaccaggcacaggacttttttgttttttgcacttcgctgtgtttccc
ccccatcttta a a a a t a a 11ccatatctagCCCC3tCCC3cacctgtttcaaatccttgagcagttgttgggCg33tggtcg朋朋tg朋ttgtaattttcttttcctttte^gacaggttctgtgtgctttttettttgattttttttCCC33g3朋tgtgcagtctgtaaacactttttgataccttctgatgtcaaagtgattgtgg卿teggctcagcgategtggtcctcttaC3g3g^3Cgggg￡lgC￡lgg￡lCg3CgggggggCtgggggtggcggggg鄉(xiāng)gtgcccacaagacttgtactcccctaaattcttggacattccctttcctaacatcctgaggcttaaaaccctgatgc^acttctcctttcagtggttggcgagttcaaccattcactgcaatgcctattccaaactttaaatctatctattgcaaaacctg￡l￡lgg￡lCtgtagttagcgggg3tg3tgtt^gtgtggcc■gcgcacggcggcaagttttcaagcactgagtttctattccaagatcatagacttacta^gagagtg3caaatgcttccttaatgtcttctataccagtttttgtgttttgtgttaatttgttagaattctaacacactatatacttcgtcaatgtcaatattttgtctatcaatatg〈210>13〈211>2907〈212>DNA〈213〉基因變體，添加6Xhis tag〈400>13gcaaattcttctgg卿gattttcccccctctcttcaggttgggcgcgtttggtgca卿ttctcgggatcctcggctttgcctctccctctccctcccccctcctttcctttttcctttcctttcctttctttcttcctttccttccccCC3CCCCC3CCCCC3CCCC3tccccaattctcgtccgtcctcgccgcgggcagcgggcggcgg鄉(xiāng)cagcgtgcggcggtcgccaggagcgggcgcccgctcctcggcgcagcatgttccagccggcgcccaagcgctgcttcaccatcgagtcgctggtggCC33gg3Cagtcccctgcccgcctcgcgctccgaggaccccatccgtcccgcggcactcagctacgctaactccagccccataaatccgttcctcaacggcttccactcggccgccgccgccgccgccggteggggcgtctactccaacccggacttggtgttcgccgaggcggtctcgcacccgcccaaccccgccgtgccagtgcacccggtgccgccgccgcacgccctggccgcccacccccteccctcctcgcactcgccacaccccctattcgcctcgcagc3gcgggatccgtccaccttctacccctggctcatccaccgctaccgatatctgggtcatcgcttccaaggg^cgacact3gCCCCg3g3gtttccttttgcac朋cgcgctggcccgaa3gCCC33gCggatccgaaccgccttctccccgtcccagcttctaaggctggaacacgccttcactacgtggtgggcgccggctggcacacagcctcagcctC3Cgg^3Cgtatggtttc3g^CCg^g朋C333gttC■■ggcaga3g^ggctcagattcgcaacagggacgcaccatattaaccggtgg卿atcgccaccaagcaggcgagtcagacgtgacc tcagatgatCACCACCACCACCACCACt aaaaacataa acctaacccc3C3g朋3Cgggc^^gagac鄉(xiāng)g卿gg
權(quán)利要求
一種載體，其包含序列表中SEQ ID NO1所示的DNA序列，或該序列的如下變體1)其編碼在SEQ ID NO1所編碼的蛋白的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有SEQ ID NO1所編碼的蛋白的活性；2)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1的DNA序列雜交且具有SEQ IDNO1的DNA的活性的DNA；其中所述嚴(yán)格條件是68℃。
2. 權(quán)利要求l的載體，其中所述載體是腺病毒表達(dá)載體。
3. 權(quán)利要求2的載體，其中所述載體是DE1/E3腺病毒表達(dá)載體。
4. 權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)的載體，其中所述序列的變體選自SEQ IDNO :10、 11、 12禾口 13。
5. —種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的載體。
6. 權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)的載體在制備用于治療癌癥以及延緩癌癥的復(fù)發(fā)的藥物中的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求5的應(yīng)用，其中所述癌癥選自肺癌、乳癌、肝癌、胃癌。
8. 權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述癌癥是肺癌。
9. 一種治療癌癥以及延緩癌癥的復(fù)發(fā)的方法，其包括給病人施用權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的載體。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述癌癥選自肺癌、乳癌、肝癌、胃癌。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中所述癌癥是肺癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及EMX2腺病毒載體及其應(yīng)用，包含該基因的載體，所述載體在治療癌癥以及延緩癌癥的復(fù)發(fā)中的應(yīng)用，以及用所述載體治療癌癥以及延緩癌癥的復(fù)發(fā)的方法。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101760474SQ20081018831
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月25日
發(fā)明者何飚, 許軍普, 陳釗 申請(qǐng)人:許軍普;何飚;陳釗