專利名稱：：一種檢測(cè)血樣中的pon-1酶活性的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)療
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體涉及一種對(duì)血漿或血清中對(duì)氧磷酯酶1(P0N-1)酶活性檢測(cè)的方法，同時(shí)還涉及一種P0N-1酶活性在冠心病、心肌梗塞等心腦血管疾病的實(shí)驗(yàn)室輔助診斷、早期檢測(cè)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及治療監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：動(dòng)脈粥樣硬化(As)所致的冠心病、中風(fēng)等心腦血管疾病是嚴(yán)重危害人類健康的"頭號(hào)殺手"。As的發(fā)生與機(jī)體血脂代謝紊亂密切相關(guān)，大量流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)血漿高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平與冠心病的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，因而被公認(rèn)為抗As的保護(hù)因子。HDL抗As作用主要包括介導(dǎo)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)、抗氧化及抗炎癥，也涉及抗血栓、保護(hù)內(nèi)皮功能等。但近來(lái)也有充分資料顯示HDL的載脂蛋白AI(即oAI)發(fā)生Argl73—Cys突變的個(gè)體中，表現(xiàn)為極低的HDL-C水平，其As發(fā)生率反而降低；在炎癥狀態(tài)和一些相關(guān)的代謝性疾病中，有較高HDL-C水平的個(gè)體，仍會(huì)有心臟病和中風(fēng)發(fā)作，其HDL的抗As功能喪失，甚至出現(xiàn)致As的作用，引起這種"失功能性HDL"的原因主要包括HDL的顆粒組成、代謝及相關(guān)的生物學(xué)活性等方面的變化。膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CETP)抑制劑Torcetr即ib的臨床研究顯示，該藥雖然顯著升高HDL-C濃度，但治療組患者的病死率卻顯著高于對(duì)照組，也至少說(shuō)明血槳HDL-C水平并不能準(zhǔn)確反映HDL對(duì)血管的保護(hù)作用。因此檢測(cè)HDL-C水平高低并不能完全反映機(jī)體HDL抗As的能力及As的危險(xiǎn)性。HDL是一種脂質(zhì)和蛋白含量大致均等的異質(zhì)性脂蛋白，組成包括多種載脂蛋白、甘油三酯、磷脂、膽固醇及其酯，其中載脂蛋白包括即oAI(占65-70X，是決定HDL結(jié)構(gòu)與功能的主要蛋白成分)，apoAll(20-25%)，apoAIV，apoAV，apoC，apoD，apoE，apoJ，apoL等。由于HDL在組成、大小、形狀、密度等性質(zhì)呈現(xiàn)極不均一性，國(guó)內(nèi)外基礎(chǔ)研究者一直關(guān)注HDL亞類的分布、組成與冠心病的密切關(guān)系，如HDL的LpA-I型比LpA-II型抗As的能力較強(qiáng)；HDL2、HDL3及前13-HDL的抗As作用明顯不同，但這些亞型都不足以準(zhǔn)確反映HDL抗As功能差異，所涉及的檢測(cè)方法復(fù)雜，在臨床上又不能常規(guī)實(shí)施，作為臨床As預(yù)示指標(biāo)的局限性是顯而易見的。急、慢性炎癥狀態(tài)下，HDL脂質(zhì)及載脂蛋白組成發(fā)生改變甘油三酯比例升高、膽固醇酯減少，游離膽固醇含量增多，磷脂含量降低；apoAI顯著降低且發(fā)生氧化、糖基化修飾；即oAIV、即oAV作為炎癥感染的急性期蛋白增加，等。結(jié)構(gòu)與組成的變化必然使HDL性質(zhì)及生物學(xué)功能受到影響，在急性期炎癥、感染、代謝性疾病(2型糖尿病、代謝綜合征)以及早發(fā)冠心病患者中除常伴有HDL-C濃度降低，其甘油三酯比例升高，HDL核心的膽固醇酯被甘油三酯置換，apoAI被血清淀粉樣物質(zhì)A(SAA)置換，使HDL對(duì)膽固醇清除能力下降，其接受氧化磷脂的能力也降低，表現(xiàn)HDL抗氧化和抗炎活性下降，同時(shí)與HDL抗脂質(zhì)氧化相關(guān)的酶_對(duì)氧磷酯酶1(P0N-1)、血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)、卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(LCAT)等活性也降低，使致炎的氧化磷脂滅活障礙，HDL的抗炎活性甚至可轉(zhuǎn)變?yōu)橹卵谆钚?，同時(shí)也不能抗氧化。目前臨床上已發(fā)現(xiàn)部分代謝綜合征和糖尿病患者，雖然HDL-C濃度降低不明顯甚至升高，但由于存在這種喪失抗炎抗氧化功能的"失功能性HDL"，反而促發(fā)As斑塊的發(fā)生發(fā)展。急、慢性炎癥狀態(tài)下，HDL功能的異常較HDL-C濃度的改變更為突出，其對(duì)于As進(jìn)展的影響可能比HDL濃度更重要，因此針對(duì)HDL功能的治療也將是代謝性疾病和炎癥狀態(tài)下抑制As形成的重要途徑，有研究證實(shí)他汀類藥物治療雖然對(duì)HDL-C濃度影響較小，但能糾正HDL的功能障礙，恢復(fù)抗炎癥作用；傳統(tǒng)治療中的貝特類藥物也能有效改善代謝性疾病中HDL顆粒的功能。由此，對(duì)于這種患者的As預(yù)防和治療過(guò)程中，HDL功能檢測(cè)尤為有意義，其可用于對(duì)冠心病高?；颊叩暮Y查，并可用于糾正HDL功能缺陷療效的評(píng)估。由于HDL在體內(nèi)介導(dǎo)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的功能主要是apoAI完成的，基礎(chǔ)與臨床研究已證實(shí)，血漿即oAI濃度與功能的測(cè)定比總膽固醇、HDL-C水平等對(duì)冠心病危險(xiǎn)性評(píng)估更具預(yù)測(cè)意義，采用免疫透射比濁法測(cè)定即oAI的含量已常規(guī)在臨床上開展，但在體外用分離純化的即oAI作用于細(xì)胞來(lái)說(shuō)明apoAI的功能并不適于臨床檢測(cè)。其次，對(duì)HDL抗炎、抗氧化作用的評(píng)價(jià)也可以間接反映As疾病的危險(xiǎn)程度，作為疾病狀態(tài)下As病變的生物標(biāo)記，通常采用測(cè)定HDL對(duì)LDL氧化或?qū)DL中磷脂氧化的影響來(lái)反映HDL抗氧化功能，測(cè)定HDL對(duì)LDL引起的單核細(xì)胞趨化活性的影響來(lái)反映HDL的抗炎或致炎作用，但這些功能測(cè)定在臨床上廣泛應(yīng)用均受到限制，主要原因均是HDL提取要求密度梯度超速離心法分離，所需血量較多，過(guò)程費(fèi)時(shí)且復(fù)雜，故目前對(duì)HDL功能的測(cè)定僅限于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，尚需找到一種簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、特異、敏感的評(píng)價(jià)HDL功能的檢測(cè)指標(biāo)，使其能廣泛應(yīng)用于臨床上，對(duì)冠心病等心腦血管疾病的危險(xiǎn)性進(jìn)行評(píng)估及治療的監(jiān)測(cè)中。研究發(fā)現(xiàn)PON-1是一種存在于血液中、f丐依賴性的HDL專有酯酶，其分子量45kDa，由354個(gè)氨基酸組成的糖蛋白。PON基因家族可編碼PON-1、P0N-2、P0N-3三種，其中僅PON-1存在于HDL中與apoAI緊密結(jié)合，具有磷脂酶A2活性，可水解LDL的氧化磷脂和血小板活化因子(PAF)，減少溶血磷脂含量，保護(hù)HDL和LDL免受氧化修飾，因而被認(rèn)為是HDL中發(fā)揮主要抗氧化功能的特征性抗氧化酶，具有心血管保護(hù)作用。有研究顯示，一些與冠心病密切相關(guān)的疾病如糖尿病、高膽固醇血癥及腎衰，其患者血清PON-1的酶活性下降，且與PON-1基因型無(wú)關(guān)，同時(shí)一些影響血清脂質(zhì)、HDL-C和主要載脂蛋白(即oAI，即oB100，即oE，即oC等)水平的因素也可能并不影響PON-1的活性，僅在一些因素如某些遺傳因素介導(dǎo)下，高脂血癥血清PON-1活性與某些脂質(zhì)如TG、TC才呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。另有報(bào)道，飲食、性別、年齡、抽煙、酒精、藥物等也可在一定程度上影響酶活性。目前在基礎(chǔ)及臨床研究中采用了不同方法檢測(cè)動(dòng)物及人血樣中的PON-1酶活性，主要是針對(duì)PON-1酶的兩種特異作用底物而建立的酶活性測(cè)定方式。一類是以乙酸苯酯(phenylacetate)為底物測(cè)量P0N-1的芳香酯酶(arylesterase)活性，一般采用反應(yīng)體系含lmmolL—taC^的50mmol-L—^ris-acetate緩沖液(pH8.0)，底物乙酸苯酯用無(wú)水乙醇以l:IO稀釋后(臨用時(shí)新鮮配制)，以終濃度為5-10mmol'L—、加入血清10iiL開始反應(yīng)，立即于270nm波長(zhǎng)的紫外分光光度計(jì)比色，測(cè)定2-5分鐘內(nèi)平均吸收值的變化(AA27。/min)，酶活性單位定義為每毫升(ml)血清每分鐘催化生成產(chǎn)物苯酚(phenol)的微摩爾數(shù)(iimolmin—1mL—0表示。反應(yīng)產(chǎn)物苯酚在測(cè)定反應(yīng)體系中于270nm波長(zhǎng)處的摩爾吸光系數(shù)為1310M—1cm—、計(jì)算公式P0N-1酶活性=(AAA27。/min/1310X10—6)X樣品稀釋倍數(shù)另一類是以對(duì)氧磷(paraoxon)為底物測(cè)量P0N-1的對(duì)氧磷酯酶(paraoxonase)活性，一般采用反應(yīng)體系含lmmol/LCaCl2的20,1L-^ris-Cl緩沖液(pH8.0)，加入終濃度為3.3mmolL—1的底物對(duì)氧磷(Sigma公司產(chǎn)品)與血清10yL反應(yīng)，即刻于紫外分光光度計(jì)上412nm波長(zhǎng)處測(cè)定2_5分鐘內(nèi)平均吸收值的變化(AA412/min)，酶活性單位定義為每毫升(ml)血清每分鐘催化生成產(chǎn)物對(duì)硝基酚(p-nitrophenol)的納摩爾數(shù)(nmol*min—1*mL—0表示。反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)硝基酚在測(cè)定反應(yīng)體系中于412nm波長(zhǎng)處的摩爾吸光系數(shù)為18290M—1cm—、計(jì)算公式P0N-1酶活性=(AA412/min/18290X10—6)X樣品稀釋倍數(shù)以上兩類酶活性測(cè)定方式分別反映P0N-1的酯酶催化活性，目的均是在不同研究中反映血液中HDL抗氧化的功能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果在各個(gè)研究報(bào)道中有直觀優(yōu)越性，但在操作方法中各個(gè)樣品均采用比色杯分別測(cè)定，批間及批內(nèi)變異系數(shù)大(對(duì)氧磷酯酶活性測(cè)定方法分別為5%和8%，芳香酯酶活性測(cè)定方法分別為13.3%和10.9%)，且在不同實(shí)驗(yàn)室用不同操作方法和實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)條件，P0N-1酶活性測(cè)定水平值相差大，可比性低，目前急需統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化分析測(cè)定方法及參考值，以便研究的可比性并將之作為有效的臨床診斷輔助標(biāo)準(zhǔn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種檢測(cè)血樣中的P0N-1酶活性的方法，本發(fā)明方法簡(jiǎn)便易行、穩(wěn)定，通過(guò)測(cè)定血清或血漿中HDL特征性抗氧化酶-P0N-1的酶活性水平，以P0N-1活性與即oAI水平的比值反映HDL的抗氧化功能。此方法的結(jié)果與已公認(rèn)的血脂檢測(cè)指標(biāo)HDL-C、apoAI比較，能夠更直接反映HDL顆?？寡趸墓δ?。在操作中本發(fā)明的P0N-1酶活性測(cè)定方法采用酶標(biāo)儀利用96孔酶標(biāo)板進(jìn)行，同批同時(shí)大樣本測(cè)定，實(shí)現(xiàn)了高通量檢測(cè)血樣中P0N-1的對(duì)氧磷酯酶活性，同時(shí)有效控制了批間及批內(nèi)誤差，批間及批內(nèi)變異系數(shù)僅為3.0%和2.3%。其次，提出了改進(jìn)的評(píng)價(jià)HDL顆?？寡趸芰Φ姆椒?，利用P0N-1是與HDL的apoAI緊密結(jié)合的特性，將P0N-1活性與apoAI水平的比值(P/A值)反映單位HDL顆粒中P0N-1抗氧化的活性值，即采用聯(lián)合信息將P0N-1活性評(píng)價(jià)以一定方式標(biāo)準(zhǔn)化。本發(fā)明的另一個(gè)目的是將P0N-1酶活性的測(cè)定作為制備治療或預(yù)防在冠心病、心肌梗塞等心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用。P0N-l酶活性與即oAI水平的比值(P/A值)制備治療或預(yù)防在冠心病、心肌梗塞等心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用，P0N-1是HDL中發(fā)揮主要抗氧化功能的特征性抗氧化酶，其活性的檢測(cè)可以反映HDL抗氧化的功能，從而作為冠心病的危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)的方法和工具。將此方法的檢測(cè)結(jié)果結(jié)合受試者的體重、年齡、常規(guī)健康狀態(tài)、病史及冠心病影像檢查的綜合分析，該方法的P0N-1酶活性與即oAI水平的比值(P/A值)評(píng)分對(duì)受試者冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)性的判斷有直接相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)達(dá)O.902)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施鑒于不同實(shí)驗(yàn)室用不同方法的測(cè)定水平值相差大，研究可比性低，本發(fā)明在常用的P0N-1酶活性測(cè)定方式上改革了實(shí)驗(yàn)操作方式與條件，提出了P0N-1活性與apoAI水平的比值(P/A值)作為HDL顆粒抗氧化功能的評(píng)價(jià)，以應(yīng)用于冠心病等心腦血管疾病中的實(shí)驗(yàn)室輔助診斷、早期檢測(cè)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及治療的監(jiān)測(cè)中。其具體步驟是(1)測(cè)量采用了酶水解特異底物對(duì)氧磷(paraoxon)為對(duì)硝基酚的原理，測(cè)定來(lái)5自血清或血漿樣品中P0N-1的酶活性。在含Ca2+的Tris-Cl緩沖液(pH8.5)分析體系中，于酶標(biāo)儀405nm處連續(xù)掃描記錄4min內(nèi)酶促反應(yīng)產(chǎn)物的生成速率，酶活性以每毫升(ml)血清每分鐘生成對(duì)硝基酚的納摩爾數(shù)(nmol)表示。具體檢測(cè)條件及方法如下(a)受試者均被收集禁食、禁飲12小時(shí)后的新鮮肘靜脈血(勿用含EDTA的抗凝劑)，即刻分離分裝血清或血漿，一份立即測(cè)定血脂全套指標(biāo)，另一份血漿或血清于-80°c凍存，用于測(cè)定酶活性，但勿反復(fù)凍溶。(b)-8(TC凍存的血樣冰上解凍，用微量移液器準(zhǔn)確吸取5ill(0.005ml)血清或不含EDTA的血漿，置于96孔酶標(biāo)板孔中，于每孔加入95y1lOOmmolL-lTris-Cl緩沖液(含2.OmolL-lNaCl，2.0,1L_lCaC12，pH8.5)，于室溫(23-25°C以下相同)下，使用多道移液器于每孔同步加入2X底物反應(yīng)液lOOiU(Tris-Cl緩沖液中含2.4mmolL_lparaoxon，臨用前配制，室溫下避光放置)反應(yīng)，即刻于酶標(biāo)掃描儀(國(guó)產(chǎn)ST-360酶標(biāo)儀或其他型號(hào)酶標(biāo)板連續(xù)掃描儀)上405nm波長(zhǎng)處每隔20秒測(cè)定一次，記錄A4。5，以測(cè)量4分鐘(min)內(nèi)吸光度值的平均變化率(AA4。5/min)。(c)按照酶活性單位的規(guī)定定義每毫升血清每分鐘生成對(duì)硝基酚的納摩爾數(shù)(nmol.min—1*mL—0表示1個(gè)PON-1酶活性單位值(可用U*mL—1表示單位)。用下列計(jì)算公式計(jì)算出血清中PON-1酶活性水平pon"醒活性=17。。4mmx5i^x樣品稀釋倍數(shù)其中AA艦/min=(A2_A》/(T廠T》;T為某一測(cè)定時(shí)間，用分鐘(min)表示，A為某一測(cè)定時(shí)間反應(yīng)體系在405nm波長(zhǎng)處的即時(shí)吸光度值；反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)硝基酚在上述測(cè)定反應(yīng)體系中于405nm波長(zhǎng)處的摩爾吸光系數(shù)為17000M—1cm—、M代表物質(zhì)的摩爾濃度mo1L-0;96孔酶標(biāo)板每孔中200ii1液體的光徑長(zhǎng)度為0.77cm。(2)測(cè)量利用全自動(dòng)生化分析儀采用免疫透射比濁法，常規(guī)測(cè)量血清或血漿樣品中即oAI的水平(以mgdL—1為統(tǒng)一單位)；(3)計(jì)算PON-1酶活性與apoAI水平的比值將步驟(1)測(cè)量的PON-1酶活性水平值(U*mL-l)與步驟(2)測(cè)量的即oAI水平(mgdL-1)進(jìn)行比較，采用P/A值(U*mg-l)表示單位HDL顆粒中PON-1的活性值來(lái)反映PON-1的抗氧化功能。P/A值=PON-1酶活性/即oAI水平其中P0N-1酶活性單位為nmolmin_lmL_l或UmL-1;apoAI水平的單位為mgdL1。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，將PON-l酶活性單位與apoAI水平的比值(P/A值)與指示存在或不存在冠心病的至少一種已知確認(rèn)指標(biāo)進(jìn)行比較，P0N-1酶活性(P/A值)作為制備治療或預(yù)防在冠心病、心肌梗塞等心腦血管疾病的藥物中的應(yīng)用，顯示P/A值可用于冠心病、心肌梗塞等心腦血管疾病的實(shí)驗(yàn)室輔助診斷、早期檢測(cè)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及治療的監(jiān)測(cè)中，通過(guò)對(duì)影像學(xué)檢測(cè)確診或心肌梗塞、中風(fēng)病史的冠心病患者分組(高甘油三酯血癥組、高膽固醇血癥組、合并糖尿病組或HDL-C高水平組以及經(jīng)普羅布考治療組)，受試者P/A值的評(píng)分與冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)性有直接相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)達(dá)0.902)。以下提供適于已知水平或比值的實(shí)例?？梢赃M(jìn)一步改進(jìn)所述的水平或比值，本說(shuō)明書中提供的具體的已知的水平或比值，可作為診斷冠心病高危人群的指南。例如，低于35Uiig—、優(yōu)選低于30Uiig—1的血清或血漿P0N-1酶活性水平與即oAI水平的比值指示受試者正處于冠心病發(fā)生的高風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài)；另一方面，高于40Ug—、優(yōu)選高于45Uyg—1的血清P0N-1酶活性水平與即oAI水平的比值指示受試者尚無(wú)冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)性。具體而言，由于P0N-1活性與其蛋白表達(dá)水平密切相關(guān)，而血液中P0N-1蛋白水平的檢測(cè)較其活性的檢測(cè)更繁雜而且誤差大，本發(fā)明以單位HDL水平中含有的PON-l活性來(lái)反映P0N-1的抗氧化功能狀態(tài)，由于HDL中即oAI的水平間接但較穩(wěn)定地反映了HDL蛋白水平并與P0N-1緊密相連，因此本發(fā)明聯(lián)合了血清P0N-1的活性水平和apoAI水平兩種信息，在每位受試者中對(duì)一個(gè)標(biāo)記相對(duì)與另一個(gè)標(biāo)記的診斷信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。例如，高血糖、高膽固醇血癥或高甘油三酯血癥的患者個(gè)體，其P0N-1酶活性受到抑制，表現(xiàn)其血清測(cè)定值下降，然而，某些情況下，P0N-1含量的高低影響整個(gè)酶活性的高低，低水平HDL的受試者表現(xiàn)相對(duì)高的抗氧化活性時(shí)，說(shuō)明機(jī)體有良好的狀態(tài)，相反，高水平HDL的患者其HDL"失功能"，其單位P0N-1活性的改變還將增大。因此，聯(lián)合信息，將P0N-1活性評(píng)價(jià)以一定方法標(biāo)準(zhǔn)化——即以P0N-1活性單位與apoAI水平的比值觀察單位HDL顆粒中P0N-1的活性值，則提供了改進(jìn)的評(píng)價(jià)方法。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"受試者"涉及健康個(gè)體、表觀上健康的個(gè)體或患者。受試者可以沒有心血管病的病史，和/或沒有或很少有冠心病風(fēng)險(xiǎn)或并發(fā)癥的癥狀，和/或受試者沒有經(jīng)受心臟病風(fēng)險(xiǎn)或并發(fā)癥的治療。"患者"是遭受疾病的個(gè)體。具體地說(shuō)，本發(fā)明所述的冠心病患者是指經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影陽(yáng)性或已發(fā)生心肌梗塞的確診。本發(fā)明利用了某些生物化學(xué)檢測(cè)指標(biāo)或標(biāo)記，術(shù)語(yǔ)"生物化學(xué)檢測(cè)指標(biāo)或標(biāo)記"是指在存在或不存在某些病癥、疾病或并發(fā)癥時(shí)，所差異表現(xiàn)出來(lái)的物質(zhì)如蛋白質(zhì)或多肽。合適的生物化學(xué)檢測(cè)指標(biāo)或標(biāo)記，可指示存在或不存在某些病癥、疾病或并發(fā)癥，并因此允許用于診斷。本發(fā)明特別利用了血清P0N-1活性水平和apoAI水平作為生物化學(xué)檢測(cè)指標(biāo)或標(biāo)記。利用血清P0N-1活性與即oAI水平的相對(duì)比值評(píng)價(jià)單位HDL顆粒中P0N-1的活性值，反映HDL的抗氧化功能與疾病發(fā)生的危險(xiǎn)性之間的關(guān)系。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)血清或血漿的保存條件、時(shí)間跨度和P0N-1酶活性測(cè)定時(shí)的環(huán)境溫度可能影響標(biāo)本的檢測(cè)效果，確立了樣本檢測(cè)需考慮的實(shí)驗(yàn)方法的影響因素。如-8(TC凍存的血漿或血清的樣本不會(huì)影響標(biāo)本的檢測(cè)效果，但勿反復(fù)凍溶。本方法首先利用不同高脂血癥的轉(zhuǎn)基因鼠模型(C57BL6種系背景的即oE基因敲除(即oE—)鼠、清道夫受體BI基因敲除(SRBI+)鼠、即oE和SRBI雙基因敲除(即oE+SRBI+)鼠、脂蛋白脂肪酶基因敲除(LPL—)作為血樣來(lái)源，進(jìn)行小鼠血清P0N-1活性的檢測(cè)分析，指示本發(fā)明中P0N-1活性方法的檢測(cè)值靈敏、穩(wěn)定、可重復(fù)性好。本發(fā)明較以往常見的P0N-1酶活性測(cè)定方法更有效反映顆粒HDL抗氧化功能，建立了一種高通量、簡(jiǎn)便快速、穩(wěn)定、靈敏、特異的血清或血漿P0N-1酶活性測(cè)定方法，并提供完成本發(fā)明的PON-1酶活性檢測(cè)試劑盒，這對(duì)于冠心病高危人群的發(fā)病危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)提供了新的方法和工具。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果(1)本發(fā)明中PON活性測(cè)定方法改紫外分光光度計(jì)比色測(cè)定為酶標(biāo)儀掃描測(cè)定，利用96孔酶標(biāo)板進(jìn)行，能夠同批同時(shí)大樣本測(cè)定，批內(nèi)變異系數(shù)小(約2.3%)，實(shí)現(xiàn)了高通量、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定檢測(cè)多樣本P0N-1活性的方法。(2)本發(fā)明中PON活性測(cè)定方法所確立的血清或血漿用量少，酶反應(yīng)體系微量，減少了底物等試劑耗費(fèi)，同時(shí)利用多道移液器準(zhǔn)確操作并明確規(guī)定了影響實(shí)驗(yàn)的試驗(yàn)條件，測(cè)定結(jié)果重復(fù)性好，批間變異系數(shù)小(約3.0%)，方法靈敏、穩(wěn)定。(3)本發(fā)明考慮個(gè)體受試者的個(gè)體差異，聯(lián)合了血清P0N-1的活性水平和即oAI水平的信息，以P0N-1酶活性水平與apoAI水平的比值(P/A值)反映單位HDL顆粒的抗氧化功能，在不同類型高脂血癥的冠心病和/或并發(fā)其它疾病的受試者的血樣檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法的P0N-1酶活性與即oAI水平的比值(P/A值)評(píng)分與受試者冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)性的判斷相關(guān)性有直觀優(yōu)越性。具體實(shí)施方式實(shí)施例1:本發(fā)明在常用的P0N-1對(duì)氧磷酯酶活性測(cè)定原理及方法基礎(chǔ)之上改革了實(shí)驗(yàn)操作方式與條件，并以P0N-1活性與即oAI水平的比值(P/A值)作為HDL顆粒抗氧化功能的評(píng)價(jià)。一種檢測(cè)血樣中的PON-1酶活性的方法，其具體步驟是(1)測(cè)量采用了酶水解特異底物對(duì)氧磷(paraoxon)為對(duì)硝基酚的原理，測(cè)定來(lái)自血清或血漿樣品中PON-1的酶活性。在含Ca2+的Tris-Cl緩沖液(pH8.5)分析體系中，于酶標(biāo)儀405nm處連續(xù)掃描記錄4min內(nèi)酶促反應(yīng)產(chǎn)物的生成速率，酶活性以每毫升(ml)血清每分鐘生成對(duì)硝基酚的納摩爾數(shù)(nmol)表示。具體檢測(cè)條件及方法如下(a)受試者均被收集禁食、禁飲12小時(shí)后的新鮮肘靜脈血(勿用含EDTA的抗凝劑)，即刻分離分裝血清或血漿，一份立即測(cè)定血脂全套指標(biāo)，另一份血漿或血清于-80°C凍存，用于測(cè)定酶活性，但勿反復(fù)凍溶。(b)-80°〇凍存的血樣冰上解凍，用微量移液器準(zhǔn)確吸取5ill(0.005ml)血清或不含EDTA的血漿，置于96孔酶標(biāo)板孔中，于每孔加入95iUlOOmmol*L—^ris-Cl緩沖液(含2.OmolL—、aC1，2.OmmolL—taCl^pH8.5)，于室溫(23_25°C)下，使用多道移液器于每孔同步加入2X底物反應(yīng)液100ii1(Tris-Cl緩沖液中含2.4mmolL—^araoxon，臨用前配制，室溫下避光放置)反應(yīng)，即刻于酶標(biāo)掃描儀(國(guó)產(chǎn)ST-360酶標(biāo)儀或其他型號(hào)酶標(biāo)板連續(xù)掃描儀)上405nm波長(zhǎng)處每隔20秒測(cè)定一次，記錄A4。5，以測(cè)量4分鐘(min)內(nèi)吸光度值的平均變化率(AA4。5/min)。(c)按照酶活性單位的規(guī)定定義每毫升血清每分鐘生成對(duì)硝基酚的納摩爾數(shù)(nmol.min—1*mL—0表示1個(gè)PON-1酶活性單位值(可用U*mL—1表示單位)。用下列計(jì)算公式計(jì)算出血清中PON-1酶活性水平<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中AA4。5/min=(A2_A》/(T廠T》;T為某一測(cè)定時(shí)間，用分鐘(min)表示，A為某一測(cè)定時(shí)間反應(yīng)體系在405nm波長(zhǎng)處的即時(shí)吸光度值；反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)硝基酚在上述測(cè)定反應(yīng)體系中于405nm波長(zhǎng)處的摩爾吸光系數(shù)為17000M—1cm—、M代表物質(zhì)的摩爾濃度mo1L-0;96孔酶標(biāo)板每孔中200ii1液體的光徑長(zhǎng)度為0.77cm。(2)測(cè)量利用全自動(dòng)生化分析儀采用免疫透射比濁法，常規(guī)測(cè)量血清或血漿樣品中即oAI的水平(以mgdL—1為統(tǒng)一單位)；(3)計(jì)算PON-1酶活性與apoAI水平的比值將步驟(1)測(cè)量的PON-1酶活性水平值(U.mL—"與步驟(2)測(cè)量的即oAI水平(mg.dL-"進(jìn)行比較，采用P/A值(Uyg-0表示單位HDL顆粒中PON-1的活性值來(lái)反映PON-1的抗氧化功能。P/A值=PON-1酶活性/即oAI水平其中:P0N-1酶活性單位為nmolmin—1mL—1或UmL—1;apoAI水平的單位為mgdL-1;P/A值的單位最后統(tǒng)一為Uiig—、實(shí)施例2:不同高脂血癥的轉(zhuǎn)基因鼠模型PON-1酶活性水平的測(cè)量將正常野生型C57BL6小鼠及不同高脂血癥模型的即oE基因敲除(即oE—〃)鼠、清道夫受體BI基因敲除(SRBI+)鼠、即oE/SRBI雙基因敲除(即oE—y—SRBI+)鼠、脂蛋白脂肪酶基因敲除(LPL—)鼠禁食12小時(shí)后，于眼眶后靜脈叢采血，離心(10minX4000rpm)制備血清，直接對(duì)各組血清樣本進(jìn)行下列指標(biāo)的檢測(cè)總膽固醇(TG)、甘油三酯(TC)、PON-1酶活性水平，或-8(TC凍存血樣再檢測(cè)P0N-1活性。N:受試者個(gè)體數(shù)目。表1.不同高脂血癥模型鼠的血清P0N-1酶活性水平分組NTC(mg'dL")TG(mg'dL—1)PON-l活性(nmol'mL-1.min力C57BL6鼠30126.2±20.798.9±25.9213.3±10.7apoE_/—鼠20457.3±80.4162.5±51.9180.8±22.6SRBI^鼠14207.9±26.0175.3±21.9104.5±16.9apoE;SRBI^鼠101107.4±152.0294.8±57.282.6±15.3LPl/鼠10189.U57.93198.6±773.270.98±10.6由于小鼠血清中，約30%的P0N-1是可以游離于HDL之外的，但這種無(wú)脂質(zhì)結(jié)合(未結(jié)合在HDL上)的P0N-1也具有抗氧化作用，因此，小鼠血清P0N-1酶活性水平可以看成機(jī)體整體的抗氧化能力，因而此實(shí)施例中未考慮HDL的載脂蛋白成分與水平。根據(jù)血清TC、TG水平及幾種As模型的基因敲除鼠特征進(jìn)行分組，可見本發(fā)明所述的P0N-1酶活性測(cè)定方法靈敏、穩(wěn)定、特異性高，測(cè)得的P0N-1酶活性水平顯著地反映了模型鼠As發(fā)生發(fā)展的狀態(tài)。組l:C57BL6鼠，為小鼠中As易感性較高的種屬鼠，此野生型鼠在普通飼料喂食過(guò)程中一般無(wú)As發(fā)生，可視為研究的正常對(duì)照組；組2:即oE—鼠，C57BL6種屬背景的即oE基因敲除鼠，此模型鼠表現(xiàn)血清中極低密度脂蛋白(VLDL)及低密度脂蛋白(LDL)水平異常升高，HDL-C水平變化不顯著。在長(zhǎng)9期普通飼料喂食過(guò)程中可自發(fā)發(fā)生As，而高脂飼料喂食8-12周，可致嚴(yán)重的As發(fā)生；組3:SRBI—/—鼠，C57BL6種屬背景的清道夫受體BI(即HDL受體)基因敲除鼠，此模型鼠表現(xiàn)血清中含大分子的HDL，且HDL-C水平高于野生型C57BL6鼠。在普通飼料喂食過(guò)程中可逐漸發(fā)生As，而高脂飼料喂食6-12周，可致嚴(yán)重的As發(fā)生；組4:即oE—SRBI+鼠，此C57BL6種屬背景的雙基因敲除鼠表現(xiàn)異常的高脂血癥(高VLDL及LDL水平，異常大分子HDL且高HDL-C水平)。此模型鼠普通飼料喂食過(guò)程中即發(fā)生早期嚴(yán)重的As，并于出生后4-8周內(nèi)死亡。組5:LPL—鼠，C57BL6種屬背景的脂蛋白脂肪酶(LPL)基因敲除鼠，此模型鼠表現(xiàn)血清高甘油三酯水平(乳糜狀血清)，普通飼料喂食即發(fā)生早期嚴(yán)重的As，并于出生后4-8周死亡。進(jìn)一步分析可知，在不同As模型的轉(zhuǎn)基因鼠中，As發(fā)生發(fā)展的程度與P0N-1活性水平密切相關(guān)，與正常對(duì)照的野生型小鼠相比，apoE—鼠、SRBI—/—鼠P0N-1活性水平降低，As的敏感性增加，可逐步發(fā)展為嚴(yán)重的As，在高脂飼料誘發(fā)下可加快加重了As斑塊的發(fā)展。而即oE—SRBI+鼠、LPL—鼠P0N-1活性水平顯著降低(低于正常對(duì)照的一半)，在異常高血脂(TC或TG)情況下，則早期出現(xiàn)嚴(yán)重的As，危及生命。實(shí)施例3:不同病因的冠心病患者P0N-1活性與即oAI水平的測(cè)量湖北地區(qū)總計(jì)165例(92位男性、73位女性，平均年齡61歲)具有冠心病診斷指標(biāo)或心梗發(fā)生的患者(其中22例冠心病患者經(jīng)普羅布考治療半月以上后復(fù)診)，與血脂檢測(cè)正常范圍的正常人65例(35位男性、30位女性，平均年齡58歲)，HDL-C低水平的看上去正常的受試者19例，包括在相關(guān)的研究中。讓受試者接受下列檢測(cè)①用于診斷冠心病的冠脈血管造影術(shù)；②超聲心動(dòng)圖，用于評(píng)價(jià)冠心病高危人群心肌缺血、心梗等信息；③血脂全套檢測(cè)包括血漿或血清TC，TG，LDL-C，HDL-C，脂蛋白(a)，即oAI，即oB100水平。④檢測(cè)血清或不含EDTA抗凝血槳的P0N-1酶活性水平。根據(jù)原發(fā)疾病、血脂的不同特征將患者分組組1:血脂檢測(cè)在正常范圍的未患冠心病的受試者(健康人)；組2:僅HDL-C低水平，但尚未患病的正常人；組3:冠心病a組，高甘油三酯血癥表現(xiàn)的冠心病患者；組4:冠心病b組，高膽固醇血癥表現(xiàn)的冠心病患者；組5:冠心病C組，HDL-C高水平的冠心病患者；組6:冠心病d組，II型糖尿病合并冠心病并發(fā)癥的患者。組6:冠心病治療組，經(jīng)普羅布考治療半月以上后復(fù)診的冠心病患者?？梢姳景l(fā)明所述的P0N-1酶活性測(cè)定結(jié)果在正常人和冠心病患者間有顯著差異，若P0N-1酶活性值顯著低于正常人的一半，通?？奢o助判斷為冠心病高危人群或患者，但人群中的個(gè)體差異大，尤其HDL水平也存在個(gè)體差異，在人血清中，大于95%的P0N-1是與HDL的即oAI緊密結(jié)合的，因此，綜合HDL-C水平、即oAI水平及血清P0N-1酶活性的信息，在此實(shí)施例中，將受試者血清或血槳P0N-1酶活性單位與apoAI水平的比值[P0N-1的nmolmin—1mL—1(UmL—0與即oAI的mgdL—1的比值，P/A值(Uyg—0]作為單位HDL顆粒的抗氧化活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。進(jìn)一步分析正常受試者和不同特征的冠心病高危人群或患10者的血樣標(biāo)本，在65份正常人和19份HDL-C低水平，但尚未患病的正常人的血清或血漿中，P0N-1活性與即oAI水平的比值高于40Ug—、指示HDL抗氧化能力強(qiáng)，冠心病危險(xiǎn)性小；而冠心病患病個(gè)體的血清或血漿中，P0N-1活性與即oAI水平的比值低于35Uyg—、優(yōu)選低于30Ug—、則提示HDL抗氧化能力強(qiáng)降低，患者處于冠心病的高危險(xiǎn)性或發(fā)病過(guò)程中；經(jīng)臨床降脂與抗氧化藥物普羅布考治療半月余，P0N-1活性明顯上升，HDL抗氧化能力有所增加，提示治療的療效。表2.不同特征的冠心病患者的血清P0N-1酶活性與apoAI水平的比值<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求一種檢測(cè)血樣中的PON-1酶活性的方法，其步驟是(1)測(cè)量采用酶水解特異底物對(duì)氧磷為對(duì)硝基酚，測(cè)定來(lái)自血清或血漿樣品中PON-1的酶活性，在含Ca2+的Tris-Cl緩沖液，pH8.5分析體系中，于酶標(biāo)儀405nm處連續(xù)掃描記錄4min內(nèi)酶促反應(yīng)產(chǎn)物的生成速率，酶活性以每毫升血清每分鐘生成對(duì)硝基酚的納摩爾數(shù)，其方法如下(a)受試者均被收集禁食、禁飲12小時(shí)后的新鮮肘靜脈血，分離分裝血清或血漿，一份測(cè)定血脂全套指標(biāo)，另一份血漿或血清于-80℃凍存，用于測(cè)定酶活性；(b)-80℃凍存的血樣冰上解凍，用微量移液器準(zhǔn)確吸取5μl血清或不含EDTA的血漿，置于96孔酶標(biāo)板孔中，于每孔加入95μl100mmol·L-1Tris-Cl緩沖液，含2.0mol·L-1NaCl，2.0mmol·L-1CaCl2，pH8.5，于室溫下，使用多道移液器于每孔同步加入2×底物反應(yīng)液100μl，Tris-Cl緩沖液中含2.4mmol·L-1paraoxon，臨用前配制，室溫下避光放置，反應(yīng)，于酶標(biāo)掃描儀上405nm波長(zhǎng)處每隔20秒測(cè)定一次，記錄A405，以測(cè)量4分鐘內(nèi)吸光度值的平均變化率，ΔA405/min；(c)按照酶活性單位的規(guī)定定義每毫升血清每分鐘生成對(duì)硝基酚的納摩爾數(shù)，nmol·min-1·mL-1表示1個(gè)PON-1酶活性單位值，用下列計(jì)算公式計(jì)算出血清中PON-1酶活性水平其中ΔA405/min＝(A2-A1)/(T2-T1)；T為測(cè)定時(shí)間，A為測(cè)定時(shí)間反應(yīng)體系在405nm波長(zhǎng)處的即時(shí)吸光度值；(2)測(cè)量利用全自動(dòng)生化分析儀采用免疫透射比濁法，測(cè)量血清或血漿樣品中apoAI的水平；(3)計(jì)算PON-1酶活性與apoAI水平的比值將步驟(1)測(cè)量的PON-1酶活性水平值U·mL-1與步驟(2)測(cè)量的apoAI水平mg·dL-1進(jìn)行比較，采用P/A值表示單位HDL顆粒中PON-1的活性值來(lái)反映PON-1的抗氧化；P/A值＝PON-1酶活性/apoAI水平其中PON-1酶活性單位為nmol·min-1·mL-1或U·mL-1；apoAI水平的單位為mg·dL-1。F2008101971958C0000011.tif2.權(quán)利要求1所述的一種P0N-1酶活性在制備治療或預(yù)防冠心病的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測(cè)血樣中的PON-1酶活性的方法及應(yīng)用，其步驟(a)利用對(duì)氧磷作為底物，測(cè)定來(lái)自血清或血漿樣品中對(duì)氧磷酯酶-1(paraoxonase-1，PON-1)的活性；(b)免疫透射比濁法測(cè)量樣品中載脂蛋白AI(apoAI)的水平；(c)計(jì)算PON-1活性與apoAI水平的比值；(d)將所計(jì)算的比值與指示存在或不存在冠心病的至少一種已知指標(biāo)進(jìn)行比較。本發(fā)明通過(guò)反映HDL顆粒中PON-1的相對(duì)活性，特異、敏感地對(duì)冠心病危險(xiǎn)性的存在進(jìn)行評(píng)估。將酶活性的測(cè)定作為制備治療或預(yù)防在冠心病、心肌梗塞等心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用。PON-1是HDL中發(fā)揮主要抗氧化功能的特征性抗氧化酶，其活性的檢測(cè)可以反映HDL抗氧化的功能，從而作為冠心病的危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)的方法和工具。文檔編號(hào)C12Q1/44GK101712979SQ20081019719公開日2010年5月26日申請(qǐng)日期2008年10月8日優(yōu)先權(quán)日2008年10月8日發(fā)明者周赤燕,喻紅,李小明,沈丹,胡漢寧,鄭偉,鄭悅玲申請(qǐng)人:武漢大學(xué)