專利名稱：基于磁珠探針復(fù)合物分離短散在重復(fù)序列的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種從基因組中快速大規(guī)模分離短散在 重復(fù)序列(SINE)的方法。該方法基于磁珠分選系統(tǒng)直接正向分選，將探針綁定 于磁珠，在溶液中與放大的酶切基因組片段庫雜交，直接捕獲大量含有短散在重 復(fù)序列(SINE)的目的片段。
背景技術(shù)：
短散在重復(fù)序列(SINE)是一種長度在50-500bp,廣泛存在于真核生物基 因組中的一種反轉(zhuǎn)座子。它的拷貝數(shù)一般在104-l(f左右，散在或叢生于基因組 的任何部位。典型的SINE由tRNA相關(guān)區(qū)，家族特異區(qū)和尾部區(qū)三部分組成。SINE 被認(rèn)為是用來研究生物類群系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和群體遺傳學(xué)的絕好標(biāo)記。近年來研究 表明，SINE插入到基因的附近，能作為增強(qiáng)子或沉默子調(diào)節(jié)已知基因的表達(dá)。
目前用于分離SINE的方法主要是利用含SINE (短重復(fù)序列)的探針雜交掃 描基因組文庫，分離出含有SINE的克隆。整個過程需要首先構(gòu)建一個基因組文 庫，然后放射性或生物素?zé)晒鈽?biāo)記SINE探針，通過多輪斑點southern雜交的方 法來掃描文庫，篩選出陽性克隆。這種傳統(tǒng)的方法，需要的工作量大，耗時長， 成本高，難操作，效率低。
本發(fā)明利用磁珠篩選系統(tǒng)實現(xiàn)短散在重復(fù)序列(SINE)快速高效的分離，是 一種不同于傳統(tǒng)文庫法的新策略和新方法。近年來，磁珠分離系統(tǒng)被許多研究者 開發(fā)用于分離許多目標(biāo)，如特定細(xì)胞，特定蛋白，微衛(wèi)星的分離等，本發(fā)明設(shè)計 實驗方案將磁珠分離系統(tǒng)首次應(yīng)用于短散在重復(fù)序列(SINE)的分離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是在于提供了一種基 于磁珠探針復(fù)合物分離短散在重復(fù)序列的方法，該方法簡單、高效、快速，縮短 了實驗周期，降低了成本消耗，極大的提高了效率，將磁珠分離系統(tǒng)應(yīng)用到分離 短散在重復(fù)序列(SINE)上。該方法基于磁珠分選系統(tǒng)，能直接從酶切后的基因 組DNA中釣取含有短散在重復(fù)序列(SINE)的片段群。
為實現(xiàn)上述這一目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施
首先需要將含有單拷貝SINE序列的片段生物素標(biāo)記并使其單鏈化，然后將 此生物素標(biāo)記的單鏈探針其綁定到活性磁珠上，在雜交液中與酶切后的基因組 腦A雜交，雜交完成后通過磁鐵架將磁珠保留，目的片段由于與探針形成雙鏈體 被綁定與磁珠上從而得以保留，非目的片段留存在溶液中被丟棄，從而實現(xiàn)了目 的片段群和非目的片段群的分離，最后將磁珠上捕獲的含有SINE的目的片段洗 脫下來，克隆并測序。
本發(fā)明的方法具體包括如下步驟(見附圖l)
A.基因組片段富集庫的制備。第一步酶切基因組DNA。 100微升的酶切體 系中加入約40微克基因組DNA，及20單位的限制性內(nèi)切酶HaeIII，過夜消化 完全酶切。酶切后圖譜如圖2A，基因組DNA被均勻酶切于4KB以下，回收 500bP-2kb片段溶于40微升無菌水中。第二步加接頭。生成接頭的兩條寡聚 核苷酸分別為 A: 5 P 'GGCAGGATCCACTGAATTCGC-3' 和 B: 5' -AGCGAATTCAGTGGATCCTGCC-3'。兩條寡核苷酸在終濃度為10 y M的無菌水中執(zhí) 行如下過程實現(xiàn)兩條鏈的聚合形成接頭95°C 3分鐘，65°C 2分鐘，45°C 2 分鐘，25°C l分鐘，4'C保存。形成的雙鏈接頭一端被磷酸化標(biāo)記另一端有一個 突出的堿基A，這樣能使接頭定向連接到片段上且能阻止第二個接頭的繼續(xù)加 入。100ul連接體系中包含40ul酶切基因組片段(見第一步)，終濃度為2 uM 的雙鏈接頭，終濃度lx連接緩沖液，20單位T4 DNA連接酶，22'C連接過夜。 最后將上述連接液過柱回收溶于150iil無菌水。第三步PCR反應(yīng)富集片段庫。 用oligoB做引物，平行進(jìn)行20個PCR反應(yīng)，每管50微升反應(yīng)體系中加入上 述連接回收產(chǎn)物1微升作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR程序為72°C, 5min; 12個 循環(huán)中95°C 45秒，55°C 45秒，72°C 1分50秒，最后回收溶解于150u L H20
中。
B.磁珠探針復(fù)合物的制備。第一步生物素標(biāo)記探針。將己知短散在重復(fù) 序列(SINE)雙鏈片段的一條鏈一端生物素標(biāo)記{通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò) 增方法實現(xiàn)生物素標(biāo)記DNA探針}，設(shè)計一對引物(A. B)用來PCR擴(kuò)增探針序列， 其中任意一條引物的5末端用生物素標(biāo)記(這一目標(biāo)通過PCR兩條引物中的任意 一條引物的5末端生物素標(biāo)記實現(xiàn))，PCR后回收產(chǎn)物成100 u L H20中，95度變 性10分鐘，然后迅速插入冰中(生成的雙鏈DNA產(chǎn)物中的一條鏈的末端即帶有生 物素標(biāo)記)。第二步探針綁定到磁珠上。上述標(biāo)記的雙鏈副A經(jīng)過變性形成單 鏈，其中生物素標(biāo)記的單鏈綁定到磁珠上，取200微升磁珠(10呢/ml),去掉保 存液，用緩沖液TEN,[IO mM三羥甲基氨基甲垸鹽酸鹽(Tris-HCl) ， lmM乙二 胺四乙酸(EDTA) , 100mM氯化鈉(NaCl) , pH 7. 5]洗滌三次，每次5分鐘，最 后用300yL TEN,懸浮磁珠，然后將上述變性后的生物素標(biāo)記的探針100yL加 入，25'C孵育1小時。
C.目的片段群的捕獲。第一步雜交及洗脫。將磁珠探針復(fù)合物和基因組 片段富集庫于雜交液中雜交，經(jīng)上述步驟B后，單鏈探針被綁定到磁珠上，去掉 磁珠懸浮液，用200u L雜交液(5XSSC， 0. 1% SDS)洗一次，再加入150u L 10 XSSC， 0. 2% SSC和95度變性后的150微升基因組片段庫同時加入懸浮磁珠，55 。C雜交2小時，洗脫過程包括400uL TEN1000 [10 mM三羥甲基氨基甲垸鹽酸 鹽(THs-HCl) , lmM乙二胺四乙酸(EDTA) , 1000mM氯化鈉(NaQ) ， pH 7. 5] 洗滌三次，每次5分鐘，400n L 0. 2*SSC, 0. 1%SDS洗滌三次，每次5分鐘，最 后TEN1000洗一次，10分鐘，95度5分鐘，期間不停吹打懸浮磁珠，分離磁珠(目 的片段由于與磁珠-探針雜交上形成復(fù)合物得以保留，非目的片段被除去)，第二 歩接頭PCR。通過接頭PCR放大捕獲后的片段庫，平行做4個PCR反應(yīng)，上一 步捕獲的片段庫1微升作為模板，15個循環(huán)95°C 45秒，55°C 45秒，72'C 1 分50秒，反應(yīng)完成后回收成30微升水中。第三步克隆及陽性選擇，通過菌液 PCR檢測插入片段大小，測序合適大小的陽性克隆。
本發(fā)明相對于其他傳統(tǒng)分離SINE方法具有如下優(yōu)點和效果
1.相對于傳統(tǒng)的文庫掃描方法，基于磁珠篩選法極大的縮短了實驗周期，降 低了成本消耗，極大的提高了效率并且操作簡便工作量小。傳統(tǒng)的文庫掃描法需
要構(gòu)建一個基因組文庫及后續(xù)多輪文庫克隆斑點southern雜交掃描，本方法能 在一個星期左右得到幾百個陽性克隆包含SINE插入位點， 一次實驗足夠滿足后 續(xù)的研究。另外，本實驗的消耗僅為傳統(tǒng)文庫法的十分之一，并且不需要特別的 實驗平臺和儀器，操作簡單，容易控制，PCR或者克隆等常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)就
是實驗的核心。
2. 基于磁珠雜交方法的雜交過程是在溶液當(dāng)中進(jìn)行的。與傳統(tǒng)方法在固體介質(zhì)尼 龍膜上進(jìn)行，溶液中雜交極大的方便和加速了探針和目標(biāo)序列的雜交，提高了雜
交效率。
3. 最后克隆進(jìn)入載體是一群目的序列，效率通常在50%以上，因此極大的提高了
后續(xù)實驗效率。
4. 通過PCR方法實現(xiàn)生物素標(biāo)記單鏈探針，能有效防止磁珠互相鉸鏈凝結(jié)的發(fā)生。


圖1. 2. 3.基于磁珠探針大規(guī)模分離短散在重復(fù)序列(SINE)的方法流程
示意圖
其中圖1為一種基因組片段富集庫的制備示意圖 其中圖2為一種探針磁珠復(fù)合物的制備示意圖 其中圖3為一種目的片斷群的捕獲示意圖
圖4.該方法流程中一些重要步驟的電泳監(jiān)測。1.酶切基因組DNA。 HaeIII 過夜完全酶切鳙魚基因組DNA，可見被均勻的切至4Kb以下。2. PCR反應(yīng)富集片 段?？梢娡ㄟ^少量PCR循環(huán)放大后的酶切后基因組片段庫，形成均一彌散的條帶， 大部分集中在500-2000bp. 3.接頭PCR。最后捕獲的片段大部分集中在 1000-1500bp左右。
圖5.鰱魚中捕獲的短散在重復(fù)序列(SINE)。這些SINE序列具有典型的結(jié) 構(gòu)由tRNA相關(guān)區(qū)(tRNA-related region),中間的tRNA非相關(guān)區(qū)，和LINE相關(guān)區(qū)(LINE-related region)。每條SINE兩端的正向重復(fù)序列用下劃線標(biāo)記。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖對發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。 實施例l:在鳙魚實例中舉例說明整個過程。
A. 根據(jù)圖1可知，基因組片段富集庫的制備。第一步酶切基因組DNA。
100微升的酶切體系中加入約40微克基因組DNA，及20單位的限制性內(nèi)切酶 HaeIII，過夜消化完全酶切。酶切后圖譜如圖2A，基因組DNA被均勻酶切于4KB 以下，回收500bp-2kb片段溶于40微升無菌水中。第二步加接頭。生成接頭 的兩條寡聚核苷酸分別為A: 5 P WGCAGGATCCACTGAATTCGC-3'和B: 5' -AGCGAATTCAGTGGATCCTGCC-3'。兩條寡核苷酸在終濃度為10 u M的無菌水中執(zhí) 行如下過程實現(xiàn)兩條鏈的聚合形成接頭95°C 3分鐘，65°C 2分鐘，45°C 2 分鐘，25°C l分鐘，4'C保存。形成的雙鏈接頭一端被磷酸化標(biāo)記另一端有一個 突出的堿基A，這樣能使接頭定向連接到片段上且能阻止第二個接頭的繼續(xù)加 入。100y 1連接體系中包含40ul酶切基因組片段(見第一步)，終濃度為2 "M 的雙鏈接頭，終濃度lx連接緩沖液，20單位T4 DNA連接酶，22。C連接過夜。 最后將連接液過柱回收溶于150yl無菌水。第三歩PCR反應(yīng)富集片段庫。用 oligoB做引物，平行進(jìn)行20個PCR反應(yīng)，每管50微升反應(yīng)體系中加入上述連 接回收產(chǎn)物l微升作為模板，其他成分按照標(biāo)準(zhǔn)添加。PCR程序為72'C,5rain; 12 個循環(huán)中95。C 45秒，55°C 45秒，72°C 1分50秒，最后回收溶解于150 y L H20 中。
B. 根據(jù)圖2可知，，探針磁珠復(fù)合物的制備。第一步生物素標(biāo)記探針。設(shè) 計一對引物(A.B)用來PCR擴(kuò)增探針序列，其中任意一條引物的5末端用生物 素標(biāo)記，PCR后回收產(chǎn)物成100uLH20中，95度變性10分鐘，然后迅速插入冰 中。第二步探針綁定到磁珠上。取200微升磁珠(10rag/ml),去掉保存液，用 緩沖液TEN,。。[10 mM三羥甲基氨基甲垸鹽酸鹽(Tris-HCl) , lmM乙二胺四乙酸
(EDTA) ， 100mM氯化鈉(NaCl) , pH 7. 5]洗滌三次，每次5分鐘，最后用300u L TEN,。。懸浮磁珠，然后將上述變性后的生物素標(biāo)記的探針100uL加入，25'C孵育 1小時。
C. 根據(jù)圖目3可知，目的片段群的捕獲。第一步雜交及洗脫。經(jīng)上述步 驟B后，單鏈探針被綁定到磁珠上，去掉磁珠懸浮液，用200uL雜交液(5X
SSC, 0. 1% SDS)洗一次，再加入150 u L IOXSSC， 0. 2% SSC和95度變性后的150 微升基因組片段庫同時加入懸浮磁珠，55'C雜交2小時，洗脫過程包括400uL TEN畫[10mM三羥甲基氨基甲垸鹽酸鹽(Tris-HC1), lmM乙二胺四乙酸(EDTA)， 1000mM氯化鈉(NaCl), pH 7. 5]洗滌三次，每次5分鐘，400 u L 0. 2*SSC， 0. 1%SDS 洗滌三次，每次5分鐘，最后TEN咖。洗一次，IO分鐘，95度5分鐘，期間不停 吹打懸浮磁珠，分離磁珠，第二步接頭PCR。平行做4個PCR反應(yīng)，上一步捕 獲的片段庫1微升作為模板，15個循環(huán)95°C 45秒，55°C 45秒，72°C 1分50 秒，反應(yīng)完成后回收成30微升水中。第三步克隆及陽性選擇，通過菌液PCR 檢測插入片段大小。
權(quán)利要求
1、一種磁珠探針復(fù)合物分離短散在重復(fù)序列的方法，其步驟是(1)基因組片段富集庫的制備酶切基因組后回收片段，T4連接酶加接頭，接頭PCR循環(huán)放大酶切后的基因組片段庫，選用HaeIII作為酶切基因組的限制性內(nèi)切酶，用來生成接頭的兩條引物分別引物為A:5P‘GGCAGGATCCACTGAATTCGC-3’和B:5’-AGCGAATTCAGTGGATCCTGCC-3’，其中引物A的5端磷酸化處理，兩條寡核苷酸在終濃度為10μM的無菌水中執(zhí)行如下過程實現(xiàn)兩條鏈的聚合形成接頭95℃3分鐘，65℃ 2分鐘，45℃ 2分鐘，25℃ 1分鐘，4℃保存，形成的雙鏈接頭一端被磷酸化標(biāo)記另一端有一個堿基A，使接頭定向連接到片段上且阻止第二個接頭的繼續(xù)加入，PCR富集放大酶切后的基因組片段庫的使用的循環(huán)數(shù)為12，并行使用20個PCR反應(yīng)；(2)探針磁珠復(fù)合物的制備通過一條引物端生物素標(biāo)記，通過PCR擴(kuò)增方法實現(xiàn)生物素標(biāo)記DNA探針，變性后將生物素標(biāo)記的單鏈探針綁定到磁珠上，單鏈磁珠探針的制作包括，首先把步驟(1)中兩條引物中的一條引物生物素標(biāo)記，PCR擴(kuò)增探針DNA片段回收產(chǎn)物成100μL H2O中，然后95度變性10分鐘，插入冰中，然后取200微升磁珠10mg/ml，去掉保存液，用緩沖液TEN100TEN10010mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，1mM乙二胺四乙酸，100mM氯化鈉，pH7.5，洗滌三次，每次5分鐘，最后用300μL TEN100懸浮磁珠，將上述變性后的生物素標(biāo)記的探針100μL加入，室溫孵育1小時；(3)目的片斷群的捕獲將磁珠探針復(fù)合物和基因組片段富集庫于雜交液中雜交，經(jīng)上述步驟(2)后，單鏈探針被綁定到磁珠上，去掉磁珠懸浮液，用200μL雜交液洗一次，再加入150μL10×SSC，0.2％SSC和95度變性后的150微升基因組片段庫同時加入懸浮磁珠，55℃雜交2小時，洗脫過程包括400μL TEN100010mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，1mM乙二胺四乙酸，1000mM氯化鈉，pH 7.5，洗滌三次，每次5分鐘，400μL0.2×SSC，0.1％SDS洗滌三次，每次5分鐘，最后TEN1000洗一次，10分鐘，95度5分鐘，期間吹打懸浮磁珠，分離磁珠，接頭PCR，通過接頭PCR捕獲后的片段庫，平行做4個PCR反應(yīng)，捕獲的片段庫1微升作為模板，15個循環(huán)95℃45秒，55℃45秒，72℃1分50秒，反應(yīng)完成后回收成30微升水中，克隆及陽性選擇，通過菌液PCR檢測插入片段大小。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種磁珠探針復(fù)合物分離短散在重復(fù)序列的方法，本發(fā)明包括如下步驟(1)基因組片段富集庫的制備。酶切基因組，回收合適大小片段，T4連接酶加接頭，少量接頭PCR循環(huán)放大酶切后的基因組片段庫；(2)探針磁珠復(fù)合物的制備。通過引物擴(kuò)增方法實現(xiàn)生物素標(biāo)記DNA探針，變性后將生物素標(biāo)記的單鏈探針綁定到磁珠上；(3)目的片斷群的捕獲。將磁珠探針復(fù)合物與基因組文庫雜交，捕獲目的片段并將其分離，克隆及陽性選擇。該方法簡單、高效、快速，縮短了實驗周期，降低了成本消耗，極大的提高了效率，無須特別的實驗設(shè)備。
文檔編號C12N15/10GK101381724SQ20081019731
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日
發(fā)明者何舜平, 童超波 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所