專(zhuān)利名稱(chēng)：一種培育無(wú)花植物的基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其培育無(wú)花植物的基因工程方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)和林業(yè)生物技術(shù)植物基因工程領(lǐng)域。特別是一種培育無(wú)花 植物的基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其培育無(wú)花植物的基因工程方法。
背景技術(shù)：
植物在人類(lèi)的生活和生存環(huán)境中發(fā)揮著極為重要的作用，但有些植物開(kāi)花 結(jié)實(shí)的特卓給人類(lèi)帶來(lái)了許多麻煩。如懸鈴木(法國(guó)梧桐)植株高大、樹(shù)冠濃 密，在夏季給人們帶來(lái)了蔭涼，是我國(guó)廣大城鄉(xiāng)十分重要的人行道樹(shù)種。但是 成年的法國(guó)梧桐大量開(kāi)花、結(jié)果，果實(shí)成熟后開(kāi)裂、果毛在空中飛舞，不僅污 染了環(huán)境，而且容易掉入眼睛和被吸入呼吸道，危害人們的身體健康。又如楊 樹(shù)，既是我國(guó)重要的人行道樹(shù)種，也是我國(guó)十分重要的造林速生樹(shù)種，但每年 春夏季節(jié)，楊樹(shù)開(kāi)花所形成的花絮在空中漫天飛舞，同樣容易被人吸入呼吸道 和掉入人的眼睛中，危害健康。在楊樹(shù)造林地區(qū)，每年楊樹(shù)的花絮數(shù)量多，巻 成球狀或者條狀，遇火即燃，常常造成火災(zāi)。又如原產(chǎn)東亞的觀葉園林植物一 一火焰衛(wèi)矛和日本小檗，因?yàn)槿~色美麗而長(zhǎng)期受到人們的喜愛(ài)和栽培，但是它 們旺盛的開(kāi)花結(jié)實(shí)能力使得它們已經(jīng)在美國(guó)和加拿大的野外大量繁殖、抑制了 本地植物的生長(zhǎng)，成為了嚴(yán)重危害當(dāng)?shù)厣锒鄻有缘耐鈦?lái)入侵性物種。另外， 還有一些園林植物開(kāi)花時(shí)產(chǎn)生的花粉可以引起人們的過(guò)敏反應(yīng)，造林樹(shù)種的開(kāi) 花結(jié)實(shí)會(huì)消耗營(yíng)養(yǎng)、影響木材的生長(zhǎng)。因此，對(duì)于花、果實(shí)和種子均沒(méi)有經(jīng)濟(jì) 價(jià)值的經(jīng)濟(jì)植物，防止其開(kāi)花結(jié)實(shí)具有重要意義。
目前對(duì)控制植物不開(kāi)花結(jié)實(shí)或者少開(kāi)花結(jié)實(shí)的研究很少，而且主要集中在懸 鈴木上?？刂茟意從鹃_(kāi)花結(jié)實(shí)的主要措施有
1. 選育少果、無(wú)果品系通過(guò)對(duì)大量的實(shí)生懸鈴木進(jìn)行篩選，曾得到了果 球少的懸鈴木無(wú)性系[1；利用秋水仙素化學(xué)誘變懸鈴木，也曾得到了不開(kāi)花的懸 鈴木[2。
2. 修剪控果通過(guò)修剪已經(jīng)可以開(kāi)花的枝條、促進(jìn)當(dāng)年不能開(kāi)花的次級(jí)枝 條的生長(zhǎng)來(lái)控制懸鈴木的矮化結(jié)果，能有效控制懸鈴木的結(jié)果量[3"。但是修剪 控果的工作量大，并且年年都要不斷地重復(fù)操作，而且不能徹底解決問(wèn)題。3.化學(xué)藥劑處理利用對(duì)植物花果有催熟脫落作用的化學(xué)藥劑(如乙烯利、 脫落酸、赤霉素、石硫合劑、碘化鉀、三氯醋酸等)在開(kāi)花期間噴灑或注射于懸 鈴木上，促進(jìn)花和幼果萎縮、脫落,從而達(dá)到控制懸鈴木果毛污染的目的164、使用 化學(xué)藥劑控制懸鈴木開(kāi)花結(jié)果的方法存在工作量大、除花除果不徹底、容易污 染環(huán)境等缺點(diǎn)。
植物分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展為人們培育不育植物提供了一個(gè)快 速有效的途徑。目前，人們可以利用基因工程技術(shù)可以培育雄性不育或者雌性 不育的植物，這些植物均表現(xiàn)自花授粉不能結(jié)實(shí)。如Mariani等人P'^將煙草的花 藥絨氈層特異表達(dá)基因TA29啟動(dòng)子與RNase基因^mo^相融合，導(dǎo)入煙草和油菜 基因組中，培育出了雄性不育的轉(zhuǎn)基因煙草和油菜；Colombo等[13]用矮牽牛子 房的特異啟動(dòng)子FBP7控制bamase基因表達(dá)，培育出了雌性不育不結(jié)實(shí)的矮牽牛。 但是，雄性不育或者雌性不育基因工程技術(shù)培育出的植物仍然可以開(kāi)花、形成 花粉，不能解決一些植物形成花絮和過(guò)敏花粉的問(wèn)題；而且，雄性不育轉(zhuǎn)基因 植物雖然自花授粉不結(jié)實(shí)，但異花授粉可以結(jié)實(shí)；雌性不育轉(zhuǎn)基因植物雖然自 花授粉和異花授粉均不結(jié)實(shí)，但是它的花粉是可育的，可以傳播給同種非轉(zhuǎn)基 因植物。因此，已有的培育雄性不育和雌性不育植物基因工程技術(shù)不能徹底地 防止植物開(kāi)花、結(jié)實(shí)的問(wèn)題，建立一個(gè)新的、有效的防止植物開(kāi)花結(jié)實(shí)的方法， 對(duì)于培育一些無(wú)花的植物品種具有重要意義。
參見(jiàn)
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出構(gòu)建一種可以導(dǎo)致植物不開(kāi)花的基因表達(dá)載體，該表 達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞后，轉(zhuǎn)基因植物的花原基細(xì)胞自動(dòng)死亡，因而不能形成花 器官，從而達(dá)到植物徹底不開(kāi)花、不結(jié)實(shí)的目的。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的。無(wú)花植物的基因表達(dá)載體構(gòu)建步驟為
(1) 根據(jù)pCAMBIA1305.1質(zhì)粒中農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因的終止子Tnos 序列，設(shè)計(jì)并合成2條引物，Nos-F:5'-ggggtecgatcgttcaaacatttggc-3，(下劃線(xiàn) 部分為Kpn I酶切位點(diǎn))；Nos-R: 5，-ggcttaagacactgatactttaattcccg咖3,(下劃線(xiàn)部 分為EcoR I酶切位點(diǎn))。以pCAMBIA1305.1質(zhì)粒為摸板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增 農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因的終止子Tnos片段?；厥誘nos片段，經(jīng)過(guò)Kpn I和 EcoR I酶切后，連接到pCAMPPNN質(zhì)粒上，得到pCAMPPNN-Nos質(zhì)粒。 pCAMPPNN質(zhì)粒由pCAMBIA1305.1質(zhì)粒改造而來(lái)，原pCAMBIA1305.1質(zhì)粒 上由2x35S啟動(dòng)子控制的潮霉素基因表達(dá)盒被農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因啟動(dòng)子 控制的卡那霉素基因表達(dá)盒所替代；原控制報(bào)告基因gus的35S啟動(dòng)子被農(nóng)桿 菌胭脂堿合成酶基因啟動(dòng)子所替代(

圖1)。
(2) 根據(jù)barnase基因的序列，設(shè)計(jì)并合成2條引物，Bar-F: 5'-ctggfeatggcacaggttatcaacacg-3'(下劃線(xiàn)部分為Kpn I酶切位點(diǎn))；Bar-R: 5'-gtg{eg§ecagacctttacaaaaatcagataa-3'(下劃線(xiàn)部分為Sal I酶切位點(diǎn))。以解淀 粉芽孢桿菌CBaa7/us fl/^/o/z々"e/acfera)基因組DNA為摸板，通過(guò)PCR擴(kuò)增淀粉 芽孢桿菌核糖核酸水解酶基因barnase?；厥誦arnase基因片段，經(jīng)過(guò)Kpn I和EcoR I酶切后，連接到pCAMPPNN-Nos質(zhì)粒(1 )上，得到pCAMPPNN-Bam-Nos質(zhì)粒。
(3) 根據(jù)控制擬南芥C4m^Vfo/w^砍"http://朋")花原基細(xì)胞形成的/"妙基因 上游啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)并合成2條特異引物L(fēng)fy-F: 5，隱aggtcgacgtatataaagatcaacatgaacagg-3，(下劃線(xiàn)部分為Sal I酶切位點(diǎn))；Lfy匿R: 5，-cagtcgacatctatttttctetctctctctatc-3，(下劃線(xiàn)部分為Sal I酶切位點(diǎn))。
(4) 以擬南芥的幼葉為材料，用CTAB法提取擬南芥基因組DNA。
(5) 以擬南芥基因組DNA為摸板，利用引物L(fēng)fy-F和Lfy-R通過(guò)PCR技 術(shù)擴(kuò)增leafy基因的啟動(dòng)子。
(6) 將該片段克隆到pGEM-T載體上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑選單菌落測(cè)序。
(7) 將序列正確的啟動(dòng)子用Sal I切下，并連接到pCAMPPNN-Bam-Nos 質(zhì)粒上，通過(guò)酶切驗(yàn)證，獲得/^#基因啟動(dòng)子連接方向正確的無(wú)花植物表達(dá)載 體pCAMPPNN-P臥-Bam-Nos。
該基因表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意見(jiàn)圖1。
該基因表達(dá)載體可以通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、原生質(zhì)體共培養(yǎng) 等方法導(dǎo)入植物基因組中，實(shí)現(xiàn)對(duì)植物的遺傳轉(zhuǎn)化。以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法為例，
培育一種無(wú)花植物的步驟為
(1) 用凍融法將上述無(wú)花植物表達(dá)載體pCAMPP麗-Plfy-Barn-Nos導(dǎo)入根癌
農(nóng)桿菌EHA105中，獲得基因工程菌株。該基因工程菌株于2008年10月30日 在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCCN0: M20819S，簡(jiǎn)稱(chēng)基因 工程菌M208198。分類(lèi)命名為根癌農(nóng)桿菌3弁/ pPIfy-Barn"Nos (Agrobacterium tumefaciens 3#/ pPif「Baxn-Nos )。
該基因工程菌株菌株的菌學(xué)特性
a、 形態(tài)特性桿狀，大小為(0.6 1.0[jm)x(1.5x3.0Mm)，有莢膜，單個(gè)成對(duì) 排列，不形成芽孢，在含糖培養(yǎng)基上產(chǎn)生黏性菌落。
b、 生理生化特性革蘭氏陰性、好氧，生長(zhǎng)溫度25 28 °C，具有卡那霉 素和利福平抗性。
(2) 在YEP培養(yǎng)基中培養(yǎng)基因工程菌株，直到菌液的光密度值達(dá)到0.5-1.0。
(3) 將欲作無(wú)花培育的植物材料切成小塊，浸泡在根癌農(nóng)桿菌菌液中，保 持30min。
(4) 將植物材料取出，放在無(wú)菌濾紙上，吸干菌液。
(5) 將植物材料轉(zhuǎn)移到添加有乙酰丁香酮的再生培養(yǎng)基上，在光照下培養(yǎng)2-3天。
(6) 將植物材料轉(zhuǎn)移到添加有卡那霉素(kanamycin，抗生素)和羧芐青霉 素(Carbenicillin)或特美亭(timentin,抗生素)的選擇再生培養(yǎng)基上，每2星 期將植物材料轉(zhuǎn)到新鮮的選擇再生培養(yǎng)基上，直到形成不定芽。
(7) 將不定芽切下，接種到含特美亭(timentin，抗生素)的生根培養(yǎng)基上， 誘導(dǎo)不定芽生根，形成完整植株。
(8) 再生植株經(jīng)過(guò)練苗和清洗后，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的鑒定(如GUS染色、 PCR、 Southern blot等)，將轉(zhuǎn)基因植株移栽入土壤中，同時(shí)栽培非轉(zhuǎn)基因植株 作為對(duì)照，常規(guī)栽培和管理，到開(kāi)花時(shí)選擇完全不開(kāi)花的轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明所構(gòu)建的培育無(wú)花植物的基因表達(dá)載體可以用于下列類(lèi)型植物的遺 傳改良，培育無(wú)花的植物新品種
(1) 花和果實(shí)無(wú)觀賞價(jià)值、開(kāi)花與結(jié)實(shí)會(huì)給人類(lèi)帶來(lái)麻煩的園林植物，如 懸鈴木、楊樹(shù)、柳樹(shù)、火焰衛(wèi)矛、日本小檗等。
(2) 花、果實(shí)和種子無(wú)經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物，如茶樹(shù)、竹子和造林樹(shù)種(楊樹(shù)、 松樹(shù)、杉樹(shù)、按樹(shù)、白樺樹(shù)等)。這些植物以收獲葉片或者莖干為目的，開(kāi)花結(jié) 籽會(huì)消耗養(yǎng)分，不利于提高葉片和莖干的產(chǎn)量和質(zhì)量。
附圖及說(shuō)明
圖1為本發(fā)明構(gòu)建培育無(wú)花植物的基因表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖。 圖2移栽70天后正常開(kāi)花的非轉(zhuǎn)基因煙草圖片。
圖3移栽90天后不開(kāi)花的轉(zhuǎn)基因煙草圖片，其主莖和側(cè)枝不形成花芽、不 開(kāi)花。
圖4移栽55天后正常開(kāi)花的非轉(zhuǎn)基因矮牽牛圖片。 圖5移栽150天后不開(kāi)花的轉(zhuǎn)基因矮牽牛圖片。 圖6移栽60天后正常開(kāi)花的非轉(zhuǎn)基因四季海棠圖片。 圖7移栽200天后不開(kāi)花的轉(zhuǎn)基因四季海棠圖片。
在圖1中，T-DNA的左邊界；RB: T-DNA的右邊界；Pnos:農(nóng)桿菌胭脂堿 合成酶基因的啟動(dòng)子；NPTII:新霉素磷酸基轉(zhuǎn)移酶II基因，用于篩選轉(zhuǎn)基因植 株；Tnos:農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因的終止子；GUS: p-葡糖醛酸酶基因，該基 因用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株；Plfy:控制擬南芥花芽原基細(xì)胞形成的leafy基因的啟 動(dòng)子；barnase:淀粉芽孢桿菌核糖核酸水解酶基因，為細(xì)胞毒14基因。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:無(wú)花煙草(M'COft'fl加to6flCW附)的培育
(1) 將上述無(wú)花植物表達(dá)載體pCAMPPNN-PIfy-Barn-Nos導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌 中，獲得基因工程菌株。該基因工程菌株于2008年10月30日在中國(guó)典型培養(yǎng) 物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCCNO: M208198。。
(2) 在YEP培養(yǎng)基中、28 °0和250rpm的搖床上培養(yǎng)基因工程菌株 M208198，直到菌液的光密度值0.D,6oo達(dá)到0.8左右。
(3) 收集基因工程菌菌液30ml，在4。C和5000rpm的離心10min，倒出上 清液，菌體重新懸浮在液體MS培養(yǎng)基中，備用。
(4) 將煙草無(wú)菌苗的葉片切成小塊，放在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中。
(5) 將制備好的基因工程菌菌液倒入放有煙草葉片的培養(yǎng)皿中，混合均勻， 浸潤(rùn)30min。
(6) 將煙草葉片取出，放在無(wú)菌濾紙上，吸干菌液。
(7) 將煙草葉片轉(zhuǎn)移到添加有100nM乙酰丁香酮、2mg/LBA和0.1 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上，在光照下培養(yǎng)2天。光照條件光強(qiáng)1500-20001ux，光 照時(shí)間14h/d。
(8) 2天后，將煙草葉片從共培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到選擇再生培養(yǎng)基上，在光照 下培養(yǎng)，每15天將葉片轉(zhuǎn)到新鮮的選擇再生培養(yǎng)基上，直到形成了不定芽。選 擇再生培養(yǎng)基為添加有2 mg/L BA、 0.1 mg/L NAA、 50 mg/L卡那霉素
(kanamycin)和100mg/L特美亭(timentin)的MS培養(yǎng)基；光照條件光強(qiáng)為 1500-20001ux，光照時(shí)間14h/d。
(9) 將長(zhǎng)l-2cm的不定芽切下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，在光照下培養(yǎng)，直 到不定芽生根、形成完整的植株。生根培養(yǎng)基為添加有1 mg/L IBA、 50mg/L卡 那霉素(kanamycin)和100mg/L特美亭(timentin)的MS培養(yǎng)基；光照條件 光強(qiáng)為1500-20001ux，光照時(shí)間14h/d。
(10) 將生根的植株從三角瓶中取出，洗去瓊脂，用GUS染色法檢測(cè)報(bào)告 基因g^的表達(dá)情況選出轉(zhuǎn)基因植株，并移栽到土壤中，在溫室中栽培，常規(guī)管 理。
(11) 轉(zhuǎn)基因植株移栽后，其形態(tài)和生長(zhǎng)速度與非轉(zhuǎn)基因植株沒(méi)有明顯差 異。10株非轉(zhuǎn)基因煙草植株在移栽后65-75天出現(xiàn)花蕾、隨后開(kāi)花、結(jié)果(圖2)。 在25株轉(zhuǎn)基因煙草植株中，有20株在移栽后68-87天出現(xiàn)花蕾、隨后開(kāi)花；另 外有5株的主莖和側(cè)枝則一直沒(méi)有形成花蕾，因而不開(kāi)花(圖3)。移栽2年后無(wú)花的特性保持不變。
(12)將無(wú)花的轉(zhuǎn)基因植株長(zhǎng)出的側(cè)枝進(jìn)行扦插，所繁殖的植株也均不開(kāi) 花，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株無(wú)花性狀表現(xiàn)穩(wěn)定。
實(shí)施例2無(wú)花矮牽牛(/^mm'a/ij^^")的培育
(1) 在YEP培養(yǎng)基中、28 。C和250rpm的搖床上培養(yǎng)基因工程菌株 M208198,直到菌液的光密度值0.a6oo達(dá)到0.8左右。
(2) 收集基因工程菌菌液30ml，在4。C和5000rpm的離心10min，倒出上 清液，菌體重新懸浮在液體MS培養(yǎng)基中，備用。
(3) 將矮牽牛無(wú)菌組培苗的葉片切成小塊，放在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中。
(4) 將制備好的基因工程菌菌液倒入放有矮牽牛葉片的培養(yǎng)皿中，混合均 勻，浸潤(rùn)30min。
(5) 將矮牽牛葉片取出，放在無(wú)菌濾紙上，吸干菌液。
(6) 將矮牽牛葉片轉(zhuǎn)移到添加有100nM乙酰丁香酮、2 mg/L BA和0.5 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上，在光照下培養(yǎng)3天。光照條件光強(qiáng)1500-20001ux，光 照時(shí)間14h/d。
(7) 3天后，將矮牽牛葉片從共培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到選擇再生培養(yǎng)基上，在光 照下培養(yǎng)，每15天將葉片轉(zhuǎn)到新鮮的選擇再生培養(yǎng)基上，直到形成不定芽。選 擇再生培養(yǎng)基為添加有2 mg/L BA、 0.2 mg/L NAA、 50 mg/L卡那霉素
(kanamycin)和100mg/L特美亭(timentin)的MS培養(yǎng)基；光照條件光強(qiáng) 1500-20001ux，光照時(shí)間14h/d。
(8) 將長(zhǎng)約lcm的不定芽切下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，在光照下培養(yǎng)，直 到不定芽生根、形成完整的植株。生根培養(yǎng)基為添加有l(wèi)mg/LIBA、 50mg/L卡 那霉素(kanamycin)和100mg/L特美亭(timentin)的MS培養(yǎng)基；光照條件 光強(qiáng)為1500-20001ux，光照時(shí)間14h/d。
(9) 將生根的植株從三角瓶中取出，洗去瓊脂，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因GUS 的表達(dá)情況，選出轉(zhuǎn)基因植株，移栽到土壤中，在溫室中栽培，常規(guī)管理。
(10) 轉(zhuǎn)基因植株移栽后，其形態(tài)和生長(zhǎng)速度與非轉(zhuǎn)基因植株沒(méi)有明顯差 異。10株非轉(zhuǎn)基因植株在移栽后43-50內(nèi)出現(xiàn)花蕾，隨后開(kāi)花(圖4)。在32 株轉(zhuǎn)基因植株中，有25株在移栽后40-58天形成了花蕾，并陸續(xù)開(kāi)花，但有7 株的主莖和側(cè)枝在栽培后一直沒(méi)有形成花蕾，完全不開(kāi)花(圖5)，移栽6個(gè)月 后無(wú)花的特性保持不變。
(11) 將無(wú)花的轉(zhuǎn)基因植株長(zhǎng)出的側(cè)枝進(jìn)行扦插，所繁殖的植株也均不開(kāi)花，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株無(wú)花性狀表現(xiàn)穩(wěn)定。
實(shí)施例3無(wú)花四季海棠(5egom'asem/ e^/wera )的培育
(1) 在YEP培養(yǎng)基中、28 'C和250rpm的搖床上培養(yǎng)基因工程菌株 M208198，直到菌液的光密度值0.0.600達(dá)到0.8左右。
(2) 收集基因工程菌菌液30ml,在4。C和5000rpm的離心10min，倒出上 清液，菌體重新懸浮在液體MS培養(yǎng)基中，備用。
(3) 將四季海棠無(wú)菌組培苗的葉片切成小塊，放在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中。
(4) 將制備好的基因工程菌菌液倒入放有四季海棠葉片的培養(yǎng)皿中，混合 均勻，保持30min。
(5) 將四季海棠葉片取出，放在無(wú)菌濾紙上，吸干菌液。
(6) 將四季海棠牛葉片轉(zhuǎn)移到添加有100nM乙酰丁香酮、1 mg/L BA和 0.2mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上，在光照下培養(yǎng)3天。光照條件:光強(qiáng)1500-20001ux， 光照時(shí)間14h/d。
(7) 3天后，將四季海棠葉片從共培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到選擇再生培養(yǎng)基上，在 光照下培養(yǎng)，每15天將葉片轉(zhuǎn)到新鮮的選擇再生培養(yǎng)基上，直到形成不定芽。 選擇再生培養(yǎng)基為添加有1 mg/L BA、 0.2 mg/L NAA、 50 mg/L卡那霉素
(kanamycin)和100mg/L特美亭(timentin)的MS培養(yǎng)基；光照條件光強(qiáng) 1500-20001ux，光照時(shí)間14h/d。
(8) 將長(zhǎng)l-2cm的不定芽切下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，在光照下培養(yǎng)，直 到不定芽生根、形成完整的植株。生根培養(yǎng)基為添加有l(wèi)mg/LIBA、 50mg/L卡 那霉素(kanamycin)和100mg/L特美亭(timentin)的MS培養(yǎng)基；光照條件 光強(qiáng)為1500-20001ux，光照時(shí)間14h/d。
(9) 將生根的植株從三角瓶中取出，洗去瓊脂，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因GUS 的表達(dá)情況，選出轉(zhuǎn)基因植株，移栽到土壤中，在溫室中栽培，常規(guī)管理。
(10) 在移栽過(guò)程中轉(zhuǎn)基因的四季海棠植株的形態(tài)和生長(zhǎng)速度與非轉(zhuǎn)基因 的四季海棠植株無(wú)明顯差異。10株非轉(zhuǎn)基因植株在移栽后40-49天出現(xiàn)花蕾， 隨后開(kāi)花(圖6)。在23株轉(zhuǎn)基因植株中，有19株在移栽后38-55天形成了花 蕾，并陸續(xù)開(kāi)花；有4株的主莖和側(cè)枝在栽培后一直沒(méi)有形成花蕾，表現(xiàn)為完 全不開(kāi)花(圖7)，移栽10個(gè)月后無(wú)花的特性保持不變。
(11) 將無(wú)花的轉(zhuǎn)基因植株長(zhǎng)出的側(cè)枝進(jìn)行扦插，所繁殖的植株也均不開(kāi) 花，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株無(wú)花性狀表現(xiàn)穩(wěn)定。
權(quán)利要求
1、一種培育無(wú)花植物的基因表達(dá)載體，其特征在于構(gòu)建步驟為(1)根據(jù)pCAMBIA1305.1質(zhì)粒中農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因的終止子Tnos序列，設(shè)計(jì)并合成2條引物Nos-F5’-ggggtacccgatcgttcaaacatttggc-3’，Nos-R5’-ggcttaagacactgatactttaattcccg-3’；以pCAMBIA1305.1質(zhì)粒為摸板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因的終止子Tnos片段，回收Tnos片段，經(jīng)過(guò)Kpn I和EcoR I酶切后，連接到pCAMPPNN質(zhì)粒上，得到pCAMPPNN-Nos質(zhì)粒，pCAMPPNN質(zhì)粒由pCAMBIA1305.1質(zhì)粒改造而來(lái)原pCAMBIA1305.1質(zhì)粒上由2x35S啟動(dòng)子控制的潮霉素基因表達(dá)盒被農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因啟動(dòng)子控制的卡那霉素基因表達(dá)盒所替代；原控制報(bào)告基因gus的35S啟動(dòng)子被農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因啟動(dòng)子所替代；(2)根據(jù)barnase基因的序列，設(shè)計(jì)并合成2條引物Bar-F5’-ctggtaccatggcacaggttatcaacacg-3’，Bar-R5’-gtgtcgaccagacctttacaaaaatcagataa-3’；以解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)基因組DNA為摸板，通過(guò)PCR擴(kuò)增淀粉芽孢桿菌核糖核酸水解酶基因barnase，回收barnase基因片段，經(jīng)過(guò)KpnI和EcoR I酶切后，連接到pCAMBIA-Nos質(zhì)粒(1)上，得到pCAMPPNN-Barn-Nos質(zhì)粒；(3)根據(jù)控制擬南芥花原基細(xì)胞形成的leafy基因上游啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)并合成2條特異引物L(fēng)fy-F5’-aggtcgacgtatataaagatcaacatgaacagg-3’，Lfy-R5’-cagtcgacatctatttttctctctctctctatc-3’；(4)以擬南芥(Arabidopsis thaliana)的幼葉為材料，用CTAB法提取擬南芥基因組DNA；(5)以擬南芥基因組DNA為摸板，利用引物L(fēng)fy-F和Lfy-R通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增leafy基因的啟動(dòng)子；(6)將該片段克隆到pGEM-T載體上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑選單菌落測(cè)序；(7)將序列正確的啟動(dòng)子用Sal I切下，并連接到pCAMPPNN-Barn-Nos質(zhì)粒上，通過(guò)酶切驗(yàn)證，獲得leafy基因啟動(dòng)子連接方向正確的無(wú)花植物表達(dá)載體pCAMPPNN-Plfy-Barn-Nos。
2、 一種培育無(wú)花植物的基因工程方法，其特征在于是將所述的無(wú)花植物表達(dá)載體pCAMPPNN-Plfy-Bam-Nos通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，或者是基因槍法， 或者是原生質(zhì)體共培養(yǎng)的方法導(dǎo)入植物基因組中，實(shí)現(xiàn)對(duì)植物的遺傳轉(zhuǎn)化。
3、 一種培育無(wú)花植物的基因工程方法，其特征在于步驟為(1) 將無(wú)花植物表達(dá)載體pCAMPPNN-Plfy-Bam-Nos導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中， 獲得基因工程菌株，該基因工程菌株保藏號(hào)為CCTCCNO: M208198;(2) 在YEP培養(yǎng)基中培養(yǎng)基因工程菌株，直到菌液的光密度值0.0.600達(dá) 到0.5-1.0;(3) 將欲作無(wú)花培育的植物材料(子葉、胚軸心、葉片、莖段、愈傷組織 等)切成小塊，浸泡在根癌農(nóng)桿菌菌液中，保持30min;(4) 將植物材料取出，放在無(wú)菌濾紙上，吸干菌液；(5) 將植物材料轉(zhuǎn)移到添加有乙酰丁香酮的再生培養(yǎng)基上，在光照下培養(yǎng) 2-3天；(6) 將植物材料轉(zhuǎn)移到添加有卡那霉素，或潮霉素和羧芐青霉素，或特美 亭等抗生素的選擇再生培養(yǎng)基上，每2星期將植物材料轉(zhuǎn)到新鮮的選擇再生培 養(yǎng)基上，直到形成不定芽；(7) 將不定芽切下，接種到含特美亭抗生素的生根培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)不定芽 生根，形成完整植株；(8) 再生植株經(jīng)過(guò)練苗和清洗后，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的鑒定(如GUS染色、 PCR等)，將轉(zhuǎn)基因植株移栽入土壤中，同時(shí)栽培非轉(zhuǎn)基因植株作為對(duì)照，常規(guī) 栽培和管理，到開(kāi)花時(shí)選擇完全不開(kāi)花的轉(zhuǎn)基因植株。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種可以導(dǎo)致植物不開(kāi)花的基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法及其培育無(wú)花植物的轉(zhuǎn)基因方法。利用擬南芥控制花芽原基細(xì)胞形成的leafy基因上游啟動(dòng)子序列和淀粉芽孢桿菌核糖核酸水解酶基因barnase構(gòu)建了一個(gè)培育無(wú)花植物的基因表達(dá)載體；將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞后，轉(zhuǎn)基因植株花原基細(xì)胞自動(dòng)死亡，因而不能形成花器官、植株徹底不開(kāi)花、不結(jié)實(shí)。本發(fā)明所構(gòu)建的培育無(wú)花植物的基因表達(dá)載體效果好、性能穩(wěn)定。可以用于改良花和果實(shí)無(wú)觀賞價(jià)值、開(kāi)花結(jié)實(shí)會(huì)給人們帶來(lái)麻煩的園林植物，也可以用于改良花、果實(shí)和種子無(wú)經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物，培育不開(kāi)花、不結(jié)實(shí)的植物品種。
文檔編號(hào)C12N15/55GK101575610SQ20081019753
公開(kāi)日2009年11月11日 申請(qǐng)日期2008年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月5日
發(fā)明者東 葉, 楊之帆, 陳永勤 申請(qǐng)人:湖北大學(xué)