專利名稱：：一種頻率可控的gc特異性dna誘變方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基閑工程領(lǐng)域，具體涉及一種人工誘變基因方法，與體外分子進(jìn)化有關(guān)。
背景技術(shù)：
：體外分子進(jìn)化技術(shù)即在實(shí)驗(yàn)室模擬自然進(jìn)化的過程，人為的引入突變和重組，構(gòu)建出多樣性突變文庫，配合適當(dāng)?shù)倪x擇壓，在短時(shí)間內(nèi)定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶。通過該技術(shù)，人們可以賦予天然酶不同的特性，使之更適合工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的要求，如高活性、耐高溫高壓、極端pH等。對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行誘變，構(gòu)建突變體庫是該技術(shù)關(guān)鍵的一步。目前誘變的方法主要是易錯(cuò)PCR(error-pronePCR)，該方法基于TaqDNA聚合酶的低保真度或用M^+取代Mg^使酶保真度降低的特性，或使用堿基類似物在PCR過程中導(dǎo)致錯(cuò)配摻入錯(cuò)誤的堿基，這些方法突變頻率都局限在一個(gè)較低的范圍內(nèi)，且突變頻率不易控制，突變譜主要傾向于AT向GC轉(zhuǎn)換，這就大大限制了酶分子誘變的多樣性和隨機(jī)性，特別想得到在結(jié)構(gòu)上發(fā)生較大變化的高活性酶或具有新功能的酶，往往需要多輪誘變。對(duì)于GC含量較高的基因(如來源于高等動(dòng)植物、霉菌、鏈霉菌)，上述方法更是不適用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提出一種頻率可控的GC特異性DNA誘變方法，即利用化學(xué)誘變劑對(duì)苯二酚和亞硫酸氫納(NaHS03)將單鏈DNA分子中未被甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，結(jié)合PCR方法，建立起一種頻率可控GC特異誘變方法，以解決目前酶體外定向進(jìn)化方法中由于基W(特別是小片段和富含GC的基R)誘變頻率低使應(yīng)用受限的問題。通過該方法，可以將DNA分子中的GC堿基轉(zhuǎn)換為AT，從而使富含GC的基因中GC含量降低，突變頻率更高。并且根據(jù)不同需要，可以控制反應(yīng)條件，得到不同突變頻率的DNA分子。本發(fā)明通過以下方案實(shí)施通過用對(duì)苯二酚和亞硫酸氫納處理基因片段，使其中的部分C脫氨基成U，得到含dUMP的雜合DNA分子；以該DNA分子為模板，進(jìn)行PCR;使其中的U跟A配對(duì)，并使DNA分子中原來G的位置被A取代；在接下來的擴(kuò)增中，A又跟T配對(duì)，使原來DNA中的C就被誘變成為T。從而使基因中的GC變?yōu)锳T(如圖6所示)。本發(fā)明的詳細(xì)步驟包括1.對(duì)待誘變的基因片段用亞硫酸氫鈉進(jìn)行修飾1)先通過PCR擴(kuò)增得到需要突變的基因片段，并用DNA回收kit得到純化的片段2)將約5嗎純化的DNA片段于1.5mL離心管中用雙蒸水稀釋至50(_tL;3)加5.5nL新鮮配制的3MNaOH，42'C水浴30min;4)加30^新鮮配制的lOmM對(duì)苯二酚(氫醌)至上述水浴后混合液中(溶液變成淡黃色)；5)加520nL新鮮配制的3.6M亞硫酸氫鈉(pH5.0)至上述水浴后溶液中，輕柔顛倒混勻溶液；6)加200nL礦物油，防止水分蒸發(fā)，限制氧化，離心管外裹以鋁箔紙，5(TC避光水浴不同時(shí)間。2.用PromegaWizardCleanupDNA純化回收系統(tǒng)(購自Promega公司，貨號(hào)A7280)回收修飾過的DNA1)將移液器槍頭伸入礦物油層下，先輕輕加壓使其中一小段石蠟油排出，然后吸取混合液至一潔凈1.5mL離心管中。2)向混合液中加lmLPromega'sWizardDNAClean-upresin，輕柔顛倒混勻，使DNA充分與樹脂結(jié)合；3)將2mL注射器針筒與試劑盒提供的回收小柱緊密連接后，將上述混合物用移液器移至針筒內(nèi)，用2mL的離心管放置小柱下接收廢液。加針?biāo)?，輕輕加壓，將液體擠出，此時(shí)可見小柱內(nèi)有白色的樹脂沉積。4)將注射器與小柱分離后拔出針?biāo)?，再將針筒與小柱連接，向針筒內(nèi)加入lmL80X的異丙醇，插入針?biāo)?輕輕加壓，將異丙醇擠出。重復(fù)一次，此為洗滌步驟。5)將注射器與小柱分離，將小柱置于潔凈1.5mL潔凈離心管上，離心12000rpm,lmin，以甩去殘余異丙醇成分，使樹脂干燥。6)將小柱取下置于另一潔凈1.5mL離心管上，加50nL預(yù)熱好的雙蒸水，室溫放置2min。7)離心12000rpm，lmin，此為洗脫步驟,此時(shí)離心管內(nèi)液體即為洗脫的修飾后DNA溶液，終體積為50&。8)加5.5pL新鮮配制的3MNaOH，室溫放置15min。9)加33nL10M乙酸銨，以中和NaOH，使溶液pH至7.0左右。10)力口4pL10mg/mL糖原，作為沉淀指示劑；11)加27(HiL無水乙醇，置于-20'C,沉淀1小時(shí)。12)12000rpm離心，10min,倒去上清液，收集沉淀。13)力B500(iL70。/。乙醇，輕柔傾斜離心管，旋轉(zhuǎn)一圈，再次離心，4'Cl2000rpm,5min。離心后倒掉上清，再加同量乙醇，同樣再做一遍。此為洗滌步驟，共2次。14)倒掉上清，室溫干燥至沉淀由不透明變?yōu)榘胪该骰蛲该鲿r(shí)，加入30nL雙蒸水，溶解沉淀，所得為修飾后DNA溶液。3.以修飾后DNA為模板，進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系如下10xPCR緩沖液(購自Qiagen公司，Cat.No.201203)5pL修飾后的模板DNA5pLdNTP(10nM)1mL正向引物(10nM，根據(jù)目標(biāo)分子設(shè)計(jì))lpL反向引物(10^M，根據(jù)目標(biāo)分子設(shè)計(jì))l^LTaqDNA聚合酶(購自Qiagen公司，Cat.No.201203'2.5U/|iL)l^L加雙蒸水至50nL反應(yīng)程序?yàn)?4。C預(yù)熱3分鐘，94。C40秒，40°C40秒，72°C1分鐘'IO個(gè)循環(huán)。如果擴(kuò)增效果不好，也可嘗試將程序改為94。C預(yù)熱3分鐘，94。C35秒，30°C+0.5'C/cycle40秒，72'C1分鐘，15個(gè)循環(huán)。此處模板DNA濃度較低，所以需要至少加5^L。因?yàn)槟０錎NA被突變，可能導(dǎo)致與引物配對(duì)情況不好，所以需要降低退火溫度使其更容易退火結(jié)合。具體延伸時(shí)間可根據(jù)基因大小調(diào)節(jié)。通過這一步驟，所得到的PCR產(chǎn)物即為部分GC被AT取代的突變DNA分子。4.構(gòu)建突變表達(dá)文庫純化PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。DNA純化過程采用Qiagen公司試劑盒(QIAEXIIGelextractionkit,Cat.NoJ0021)進(jìn)行。純化過程為用刀片在紫外燈下取出PCR產(chǎn)物譜帶，放入1.5mL離心管，加入3倍體積的3MNal，置55"C保溫10分鐘使瓊脂糖凝膠完全溶解，將混合物加至純化柱，將柱放入2mL離心管，以8000rpm離心30秒，棄去流出液，加750&緩沖液PE洗柱，以12000rpm離心1分鐘，棄去流出液，加50pL預(yù)熱的雙蒸水，以12000rpm離心2分鐘，收集DNA流出液即為純化的DNA溶液。DNA片段和載體酶切PCR產(chǎn)物和所需表達(dá)載體用限制性內(nèi)切酶雙酶解，酶解反應(yīng)(50nL)含有5|iL10x雙酶切緩沖液，30pLPCR產(chǎn)物或表達(dá)載體質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶各2pL，加水至終體積為50nL,在37°C下保溫8-10小時(shí)。酶解產(chǎn)物純化按Qiagen公司PCR純化試劑盒(QIAquickPCRpurificationkit，Cat.No.28104)及操作程序進(jìn)行。具體過程是取150nLPB緩沖液(購自Qiagen公司)，與50^iL酶解產(chǎn)物混合，上純化柱，以12000rpm離心1分鐘，棄去流出液，再加750&PE緩沖液(購自Qiagen公司)，用12000rpm離心1分鐘，棄去流出液，最后，加50pL預(yù)熱雙蒸水，12000rpm離心l分鐘，收集酶解的DNA片段和載體。連接20nL連接反應(yīng)含有10x連接緩沖(購自takara公司)，2pL雙酶切的載體，8pL酶切PCR產(chǎn)物，lpLT4DNA連接酶(購自takara公司)，加水至終體積20nL,16。C水浴5-8小時(shí)。轉(zhuǎn)化取10pL連接混合物與100|iL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a(購自NewEnglandBiolabs公司)混合，冰浴放置30分鐘，42'C熱激90秒，加800nL液體LB培養(yǎng)基(其中含1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，1%NaCl,pH7.0),37'C溫育1小時(shí)。涂布含100ng/mL氨芐青霉素固體LB培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，1%NaCl，1.5%瓊脂粉，pH7.0)平皿，37卩培養(yǎng)12小時(shí)，獲得突變表達(dá)文庫的轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明的積極效果是DNA的突變頻率可最高至5%左右，且可根據(jù)不同的需耍選擇不同的誘變時(shí)間，達(dá)到不同的突變頻率。其中卯。/。以上突變是GC向AT的轉(zhuǎn)換，尤其使用于GC含量高的基因。該方法可用于體外分子進(jìn)化技術(shù)。序列表SEQIDNO:1是本發(fā)明實(shí)施例所用的解淀粉芽孢桿菌甘露聚糖酶基因的核苷酸和氨基酸序列圖1:是本發(fā)明中對(duì)甘露聚糖酶基因不同誘變條件導(dǎo)致的突變核苷酸序列比對(duì)結(jié)果圖2:是本發(fā)明中對(duì)甘露聚糖酶基因不同誘變條件導(dǎo)致的突變氨基酸序列比對(duì)結(jié)果圖3:亞硫酸氫鈉處理時(shí)間與DNA中GC堿基突變頻率的關(guān)系圖4:亞硫酸氫鈉處理時(shí)間與DNA總突變頻率的關(guān)系圖5:亞硫酸氫鈉處理時(shí)間與氨基酸突變頻率的關(guān)系圖6:是本發(fā)明方法導(dǎo)致GC向AT轉(zhuǎn)換的原理圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1利用本發(fā)明方法對(duì)解淀粉芽孢桿菌(5ac///za，/o/,Xadera)的甘露聚糖酶(mannanase)基因進(jìn)行不同時(shí)間誘變的結(jié)果以從解淀粉芽孢桿菌克隆的甘露聚糖酶(具體序列見序列表SEQIDNO:l所示)作為目標(biāo)，用本發(fā)明方法進(jìn)行誘變，并對(duì)突變頻率和結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)歸納，得出誘變頻率與亞硫酸氫鈉修飾條件的規(guī)律。具體操作如下1.純化的甘露聚糖酶基因片段的制備以甘露聚糖酶克隆載體pGEX-man為模板，PCR擴(kuò)增得到甘露聚糖酶基因片段。PCR反應(yīng)體系為10xPCR緩沖液(購自Qiagen公司，Cat.No.201203)5pLpGEX-manlpLdNTP(10nM)lpL正向引物(10nM，5'-GCCGGATCCATGCTTAAAAAGTTAGCAGTCTG)lpL反向引物OO)xM，5'-CAGCTCGAGTTTTGAACGGTAACAATATGCC)lpLTaqDNA聚合酶(購自Qiagen公司，Cat.No.201203,2.5U/nL)lpL加雙蒸水至50pL擴(kuò)增條件為94'C3分鐘；94'C40秒；53'C30秒；72。Cl分鐘；30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物純化按Qiagen公司PCR純化試劑盒(QIAquickPCRpurificationkit,Cat.No.28104)及操作程序進(jìn)行。具體過程是取600nLPB緩沖液(購自Qiagen公司)，與200pL酶解產(chǎn)物混合，上純化柱，以12000rpm離心1分鐘，棄去流出液，再加750^iLPE緩沖液(購自Qiagen公司)，用12000rpm離心1分鐘，棄去流出液，最后，加150nL預(yù)熱雙蒸水，用12000rpm離心1分鐘，所得即為純的甘露聚糖酶基因片段。DNA濃度測(cè)定取純化后的DNA10nL，用雙蒸水稀釋至lmL，在260nm條件下測(cè)光吸收，得到OD260為0.4480，用公式DNA(mg/mL)二50xOD260x稀釋倍數(shù)/1000計(jì)算得到DNA濃度為2.24mg/mL。2.甘露聚糖酶基因的亞硫酸氫鈉修飾取2.5nL純化好的甘露聚糖酶基因片段，按前述方法步驟進(jìn)行修飾和純化。亞硫酸氫鈉處理時(shí)間分別為1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、16小時(shí)5個(gè)梯度。3.對(duì)修飾后的基因進(jìn)行擴(kuò)增誘變PCR體系如下10xPCR緩沖液(購自Qiagen公司，Cat.No.201203)5pL修飾后的模板DNA5nLdNTP(10|iM)叫正向引物(10pM，5，-GCCGGATCCATGCTTAAAAAGTTAGCAGTCTG)lpL反向引物(10|aM，5，-CAGCTCGAGTTTTGAACGGTAACAATATGCC)lpLTaqDNA聚合酶(購自Qiagen公司，Cat.No.201203,2.5U/^L)l(iL加雙蒸水至50nL反應(yīng)程序?yàn)?4'C預(yù)熱3分鐘，94-C40秒，40'C40秒，72°C1分鐘，IO個(gè)循環(huán)。4.甘露聚糖酶基因突變體庫的構(gòu)建純化PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。DNA純化過程采用Qiagen公司試劑盒(Q1AEXIIGelextractionkit,Cat.No.20021)進(jìn)行。純化過程為用刀片在紫外燈下取出PCR產(chǎn)物譜帶，放入1.5mL離心管，加入3倍體積的3MNal，置55。C保溫IO分鐘使瓊脂糖凝膠完全溶解，將混合物加至純化柱，將柱放入2mL離心管，以8000卬m離心30秒，棄去流出液，加750pL緩沖液PE洗柱，以12000rpm離心1分鐘，棄去流出液，加50nL預(yù)熱的雙蒸水，以12000rpm離心2分鐘，收集DNA流出液即為純化的DNA溶液。DNA片段和載體酶切PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pGEX-6p-l(購自通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GEHealthcare))用限制性內(nèi)切酶5a附HI和Wol(購自takara公司)雙酶切，酶切體系(50nL)含有5pL10xKbuffer(購自takara公司)，30nLPCR產(chǎn)物或質(zhì)粒pGEX-6p-l，限制性內(nèi)切酶各2^,加水至終體積為50^L，在37。C下保溫8-10小時(shí)。酶解產(chǎn)物純化按Qiagen公司PCR純化試劑盒(QIAquickPCRpurificationkit,Cat.No.28104)及操作程序進(jìn)行。具體過程是取150nLPB緩沖液(購自Qiagen公司)，與50pL酶解產(chǎn)物混合，上純化柱，以12000rpm離心1分鐘，棄去流出液，再加750pLPE緩沖液(購自Qiagen公司)，用12000rpm離心1分鐘，棄去流出液，最后加50nL預(yù)熱雙蒸水，12000rpm離心1分鐘，收集酶切的DNA片段和載體。連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a(購自NewEnglandBiolabs公司)，所長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子即為甘露聚糖酶突變株。5.突變子的序列分析轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒制備從5種梯度的隨機(jī)突變文庫中各挑取10個(gè)轉(zhuǎn)化子接種到含10(Vg/mL氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，l%NaCl，pH7.0)中37'C培養(yǎng)過夜，取1.5mL菌液于滅菌離心管中，12000ipm離心lmin,棄上清液，收集菌體。加入100nLSolutionI(50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0),RNaseA100jxg/mL)充分混勻，然后加入200iaLSolutionII(0.2MNaOH,1%SDS)輕輕混勻，室溫靜置3-5min，最后加入150pLSolutionIII(3M醋酸鉀，5M冰醋酸)快速混勻，12000rpm離心5分鐘，收集上清；加入等體積的酚氯仿異戊醇(25:24:1)，混勻，室溫放置5-10min，12000rpm離心5min;再次收集上清，加2/3倍體積的異丙醇混勻后12000rpm離心5分鐘沉淀DNA;棄上清，沉淀用70°/0乙醇洗l次；置于室溫干燥后，溶于50nL雙蒸水中，置-2(TC保存?zhèn)溆?。序列分析以pGEX載體5'通用引物(GGCAAGCCACGTTTGGTG)為測(cè)序引物，以突變的重組質(zhì)粒為模板，由北京華大生物公司測(cè)序。核苷酸和翻譯后的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果如圖1和2。可以看到隨著亞硫酸氫鈉修飾時(shí)間的加長(zhǎng)，突變率逐漸增加。每條序列統(tǒng)計(jì)930個(gè)堿基，每個(gè)梯度統(tǒng)計(jì)10條共93000個(gè)堿基，具體修飾時(shí)間與DNA中GC突變率、總突變率及氨基酸突變率的關(guān)系見表1和圖3，4，5所示。表1亞硫酸氫鈉處理時(shí)間與DNA突變頻率統(tǒng)計(jì)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例2用本發(fā)明方法對(duì)TEM-1型p-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行誘變改變其底物特異性p-內(nèi)酰胺酶是一類能特異水解p-內(nèi)酰胺類抗生素如青霉素、頭孢菌素等的酶。TEM-1型)3-內(nèi)酰胺酶是第一個(gè)被人們認(rèn)識(shí)的p-內(nèi)酰胺酶，也是革蘭陰性菌中最常見的p-內(nèi)酰胺酶，是細(xì)菌耐p-內(nèi)酰胺類抗生素最原始的機(jī)制之一。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的具有氨芐青霉素抗性的載體中所用的幾乎都是TEM-1型p-內(nèi)酰胺酶基因。對(duì)氨芐青霉素和其他第一代頭孢菌素敏感，但對(duì)第三代頭孢菌素如頭孢他啶、頭孢噻肟等沒有水解作用。為了驗(yàn)證本發(fā)明方法的可行性與實(shí)用性，我們選擇來自pGEX系列載體上的TEM-1型p-內(nèi)酰胺酶基因ted乍為目標(biāo)，用本發(fā)明方法進(jìn)行體外誘變，以期改變其底物特異性，從中篩選具有水解頭孢他啶活性的突變酶。1.a/fl基因及其啟動(dòng)子序列的克隆PCR擴(kuò)增pGEX-6p-l上的W"基因及其啟動(dòng)子序列pcr體系如下10xPCR緩沖液(購自Qiagen公司，Cat.No.201203)5pL模板質(zhì)粒pGEX-6p-l(購自通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GEHealthcare))lpLdNTP(10(iM)1HL正向引物(10nM,5，-GACGGATCCCAGTCACGTAGCGATAG)lpL反向引物(10nM,5，-GACAAGCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGG)l^LTaqDNA聚合酶(購自Qiagen公司，Cat.No.201203,2.5U/tiL)l^L加雙蒸水至50mL反應(yīng)程序?yàn)?4'C預(yù)熱3分鐘，94'C40秒，53。C40秒，72。C1分鐘，30個(gè)循環(huán)。純化PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。DNA純化過程采用Qiagen公司試劑盒(QIAEXIIGelextractionkit,Cat,No.20021)進(jìn)行。純化過程為用刀片在紫外燈下取出PCR產(chǎn)物譜帶，放入1.5mL離心管，加入3倍體積的3MNal，置55。C保溫10分鐘使瓊脂糖凝膠完全溶解，將混合物加至純化柱，將柱放入2mL離心管，以8000rpm離心30秒，棄去流出液；加750pL緩沖液PE洗柱，以12000rpm離心1分鐘，棄去流出液，加50^L預(yù)熱的雙蒸水，以12000rpm離心2分鐘，收集DNA流出液即為純化的DNA溶液。DNA片段和載體酶切PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET28a(購自Novagen公司)用限制性內(nèi)切酶5awHI和(購自takara公司)雙酶切，酶切反應(yīng)(50pL)含有5pL10xKbuffer(購自takara公司)，30pLPCR產(chǎn)物或質(zhì)粒pET28a，限制性內(nèi)切酶各2nL，加水至終體積為50^，在3TC下保溫8-10小時(shí)。將雙酶切后的載體和片段純化后連接，轉(zhuǎn)化，涂布含100ng/mL氨芐青霉素LB平板'經(jīng)質(zhì)粒抽提驗(yàn)證后得到正確克隆。2.Mi基因的突變體庫的構(gòu)建對(duì)上輪擴(kuò)出的Wa基因片段前述方法進(jìn)行，用亞硫酸氫鈉處理2小時(shí)，純化后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆至制備好的載體pET28a上，轉(zhuǎn)化涂布至含有2pg/mL的頭孢他啶的LB培養(yǎng)基(1。/。胰蛋白胨，0.5%酵母粉，l%NaCI，1.5%瓊脂粉，pH7.0)平皿，能在頭孢他啶平皿上生長(zhǎng)出來的即為能水解頭孢他啶的突變的p-內(nèi)酰胺酶。3.突變的6to基因序列分析以pET28a載體通用的T7Terminator引物(GCTAGTTATTGCTCAGCGG)為測(cè)序引物，以突變的重組質(zhì)粒為模板，由北京華大生物公司測(cè)序。突變株的核苷酸和氨基酸突變情況見表2。可以看到突變中絕大部分是GC向AT突變，與預(yù)期情況相符。表2突變的W"基因序列分析突變株氨基酸突變核苷酸突變MlR164CC484TM2D179NG114A,G529AM3E104K，L162FG304A,C478TM4E147K，D179N,G218ET408C，G433A,G495A,G529A，G606A，G627AM5D179NG529AM6R164HG417A,G485A,C678T,M7R164H，G196NG485A,G580A,G581A，注紅色表示無義突變，沒有引起氨基酸突變。_序列表〈110〉華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120〉一種頻率可控的GC特異性DNA誘變方法<130〉<141〉2008-11-10<160〉2<170〉Patentlnversion3.1<210〉1<211〉腦〈212〉DNA<213〉解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)<220〉<221〉gene<222〉(l)..(腦)<223〉<220><221〉CDS<222〉(1)..(1083)<223>〈400〉1atgcttaaaaagttagcagtctgtctgtctateattttattaetcate48MetLeuLysLysLeuAlaValCysLeuSerlielieLeuLeuLeulie151015teagccgcccgtccgatateggetcacaccgtttaccctgtcaatccc96SerAlaAlaArgProlieSerAlaHisThrValTyrProValAsnPro202530satgcccsgcsgscgaceia肌gscgtcatg幼ctggctggcgcatttg144AsnAlaGinGinThrThrLysAspValMetAsnTrpLeuAlaHisLeu354045cccaaccgtteagaaaacagggtcatgtecggtgcattcggcgggtac192ProAsnArgSerGluAsnArgValMetSerGlyAlaPheGlyGlyTyr505560agegatgtcacettttea3tgax;ggaggaaaaccgcttgaaeiaacgcg240SerAspValThrPheSerMetThrGluGluAsnArgLeuLysAsnAla65707580acgggacagtctcccgccatetacggctgtgattatgggagagggtgg288ThrGlyGinSerProAlalieTyrGlyCysAspTyrGlyArgGlyTrp859095ctggaaac8teggatateaccgattctategactacagetgcaacage336LeuGluThrSerAsplieThrAspSerlieAspTyrSerCysAsnSer100105110ageetcatttegtactggaaaageggcggcetccctcaggtcagectg384SerLeulieSerTyrTrpLysSerGlyGlyLeuProGinValSerLeu115120125catetcgcaaatccggcctttccateaggacactataaaacggccatt432HisLeuAlaAsnProAlaPheProSerGlyHisTyrLysThrAlalie130135140tea肌cagecagtataaaaatatectgaaccctteaactgttg肪gga480SerAsnSerGinTyrLysAsnlieLeuAsnProSerThrValGluGly145150155160eggeggcttgaggccttgetcageaaaategccgacggccttactcag528ArgArgLeuGluAlaLeuLeuSerLyslieAlaAspGlyLeuThrGin165170175ctgaaaaatcaaggcgtcaccgttctgttcaggccgctgcatgagatg576LeuLysAsnGinGlyValThrValLeuPheArgProLeuHisGluMet180185190sacggtgaatggttctggtgggggctgacsggctacaax;c肌aaagac624AsnGlyGluTrpPheTrpTrpGlyLeuThrGlyTyrAsnGinLysAsp195200205actgagagaatetegctgtacaaagagctttacaagaagatataccgc672ThrGluArglieSerLeuTyrLysGluLeuTyrLysLyslieTyrArg210215220t3tatgaceigagacaaga_ggattgga^taatcttttgtgggtgtetteg720TyrMetThrGluThrArgGlyLeuAspAsnLeuLeuTrpValTyrSer225230235240cctgatgccaacagagacttcaaaacagacttctacccaggcteatct768ProAspAlaAsnArgAspPheLysThrAspPheTyrProGlySerSer245250255tatgtggatattaccggactggatgettacttcaccgacccgtatgcg816TyrValAsplieThrGlyLeuAspAlaTyrPheThrAspProTyrAla260265270atateaggctatgatgaaatgctgtctctgaaaaaaccgtttgccttt864lieSerGlyTyrAspGluMetLeuSerLeuLysLysProPheAlaPhe275.280285gccgagaccggtccgtecggtaatateggaagetttgattacgetgtt912AlaGluThrGlyProSerGlyAsnlieGlySerPheAspTyrAlaVal290295300tttateaatgcgateaggcaaaagtatcccgagacaacctactttttg960PhelieAsnAlalieArgGinLysTyrProGluThrThrTyrPheLeu305310315320seatgggatgasc肪ttaageccggcagccaatc肪ggcgcgcaaage1008ThrTrpAspGluGinLeuSerProAlaAlaAsnGinGlyAlaGinSer325330335ctttatc犯aacagetggacgctg肪caagggcgaaatgtggaatggc1056LeuTyrGinAsnSerTrpThrLeuAsnLysGlyGluMetTrpAsnGly340345350ggaaccttgacgccgategcggaataa1083GlyThrLeuThrProlieAlaGlu355360〈210〉2<211>360<212>PRT〈213〉解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)<400>2MetLeuLysLysLeuAlaValCysLeuSerlielieLeuLeuLeulie151015SerAlaAlaArgProlieSerAlaHisThrValTyrProValAsnPro202530AsnAlaGinGinThrThrLysAspValMetAsnTrpLeuAlaHisLeuGin35ProAsnArgSerGluAsn50A印ValThrPheAsp40ValMetSerGlySer65ThrGlyGinSerLeuGluThrSer100SerArg55MetThrGluGluLeu45PheGlyGlyTyrSer70AlalieTyrGlyCysA印TyrGlyArgAsn75AspAla60ArgLeuLysProAlalieTyrGlyCys8590AsplieThrAspSerlieAspTyrSerAsnAla80GlyTrp95AsnSerSerlieAspTyrSerCys105110TyrTrpLysSerGlyGlyLeuProGinValSerLeuSerUulieSerTyrTrpLysSerGlyGlyLeuProGin115120125AlaAsnProAlaPheProSerGlyHisTyrLysThrAlalieHisLeuAlaAsnProAlaPheProSerGlyHisTyr130135140SerAsnSerGinTyrLysAsnlieLeuAsnProSerThrValGluGly145ArgArgLeuGlu150AlaLeuLeuSerLys165GlyValThrValLeuLysAsnGin180AsnGlyGluTrpPheTrpTrp195ArglieSerLeu155160lieAlaAspGlyLeuThrGin170175PheArgProLeuHisGluMetThrGlu210TyrMetThrGluThr225ProAspAlaAsnLeu185GlyLeuThrGlyTyr200LysGluLeuTyrTyr215ArgGlyLeuAspAsn230AspPheLysThrHis190AsnGinLysAsp205LyslieTyrArgArg245TyrValAsplieThrGlyLeuAsp260TyrAspGluMetLys220LeuLeuTrpValTyr235PheTyrProGlylieSerGly275ThrGlyProSerAsp250AlaTyrPheThrAsp265SerLeuLysLysSer255TyrSer240SerAlaAlaGlu290PhelieAsnAlalie305ThrTrpAspGluLeu280GlyAsnlieGlySer295GinLysTyrProPro270PheAlaPheArg310LeuSerProAlaPro285PheAspTyrAlaVal300ThrThrTyrPheGin325LeuTyrGinAsnSerTrpThrLeu340ThrProlieAlaAsn345Glu315AlaAsnGinGlyAlaGin330335LysGlyGluMetTrpAsn350Leu320SerGlyGlyThrLeu355Glu360權(quán)利要求1、一種頻率可控的GC特異性DNA誘變方法，其特征在于，包括以下步驟用氫氧化鈉使純化的DNA變性，加入化學(xué)誘變劑對(duì)苯二酚和亞硫酸氫納使其中的C脫氨基變成U，再通過PCR方法，使U與A配對(duì)，導(dǎo)致DNA中的GC向AT轉(zhuǎn)換，從而達(dá)到誘變效果。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，加入化學(xué)誘變劑處理過程中，需加入礦物油防止氧化。3、權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，PCR過程中，退火溫度需要適當(dāng)降低。全文摘要本發(fā)明屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種頻率可控的GC特異性DNA誘變方法。先用氫氧化鈉將待誘變基因變性為單鏈，再用對(duì)苯二酚和亞硫酸氫鈉處理，使DNA鏈中的C脫氨基成為U；以修飾過的DNA為模板，PCR擴(kuò)增使U跟A配對(duì)，后續(xù)擴(kuò)增中，A繼續(xù)與T配對(duì)，從而使原始DNA鏈中的GC向AT方向轉(zhuǎn)換，獲得突變DNA分子；將突變的DNA分子裝載到表達(dá)載體，即可構(gòu)建成DNA分子突變文庫。隨著亞硫酸氫鈉處理時(shí)間的延長(zhǎng)，DNA的最終突變頻率也逐漸增大，最終可得突變頻率達(dá)5％左右的DNA，從而克服一些常規(guī)隨機(jī)誘變方法中誘變頻率過低的問題。本發(fā)明是針對(duì)DNA分子中的GC堿基，GC突變占總突變率的90％以上，尤其適用于富含GC基因的誘變。本發(fā)明可用于DNA分子體外改良。文檔編號(hào)C12N15/10GK101402953SQ20081019756公開日2009年4月8日申請(qǐng)日期2008年11月10日優(yōu)先權(quán)日2008年11月10日發(fā)明者劉子鐸,林擁軍,柳鵬福,洪玉枝申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)