專利名稱：預(yù)示區(qū)分家養(yǎng)和野生雙峰駝dna微衛(wèi)星的標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的標(biāo)記方法，特別涉及一種預(yù)示區(qū)分家養(yǎng)和野 生雙峰鴕DNA微衛(wèi)星的標(biāo)記方法。
背景技術(shù)：
微衛(wèi)星稱為簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple Sequence R印eats， SSRs)或短串聯(lián)重復(fù)(STRs) 或短串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性(Short Tandem R印eat Polymorphism, STRP)或簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多 態(tài)性(Simple Sequence Length Polymorphism, SSLP)等，是指以少數(shù)幾個(gè)核苷酸為 單位的多次串聯(lián)重復(fù)DNA序列(多為1 6個(gè)核苷酸)，其長(zhǎng)度一般為200bp左右 (Beckraann等，《Gen,ics〉〉 ， 1992， 12巻，281—288頁(yè))。微衛(wèi)星DNA串聯(lián)重復(fù)分 布于畜禽的整個(gè)基因組，重復(fù)次數(shù)為10 60次不等，其位點(diǎn)由微衛(wèi)星及其兩側(cè)的側(cè) 翼序列構(gòu)成。微衛(wèi)星標(biāo)記具有以下的特點(diǎn)；1、分布廣泛、數(shù)量多。微衛(wèi)星廣泛分布 于真核生物基因組中，例如豬基因組中存在著約65， 000-100， 000拷貝的二核苷酸 重復(fù)單位AC/TG,平均每隔30-50kb就有一個(gè)。2、多態(tài)性較高。在不同的個(gè)體中， 微衛(wèi)星重復(fù)單位數(shù)目的變異非常大，由此而造成了高度的長(zhǎng)度多態(tài)性，并使其具有較 多的遺傳信息。3、等位基因與基因型檢測(cè)方法簡(jiǎn)便。4、共顯性標(biāo)記。微衛(wèi)星標(biāo)記遵 循孟德?tīng)栠z傳法則，呈共顯性遺傳，因此能很好地區(qū)分純合子與雜合子；5、微衛(wèi)星 引物具有通用性。微衛(wèi)星側(cè)翼序列的保守性，使得從一個(gè)物種獲得的引物可以應(yīng)用于 相關(guān)的分類群體。6、中性標(biāo)記。在多數(shù)情況下，微衛(wèi)星標(biāo)記沒(méi)有任何表型效應(yīng)，因 而不存在對(duì)研究對(duì)象個(gè)體的有害或次級(jí)效應(yīng)， 一般不會(huì)受到選擇。正是微衛(wèi)星具有上 述優(yōu)點(diǎn)，目前己被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物種群遺傳學(xué)的研究中。
駱駝屬于哺乳動(dòng)物偶蹄目(Artiodactyla)、胼足亞目(Tylopoda)、駱駝科 (Camelidae)。駱鴕分為2個(gè)屬，即Camelus禾口Lama， Camelus有二個(gè)種，即單峰馬它 (Camelus Dromedaries, Dromedary camel， One-humped camel, 也稱阿拉伯馬它)禾口 雙峰馬它(Camelus Bactrianus， Bactrian camel, Two-humped camel)0
目前世界上約有1800萬(wàn)峰駱駝，其中1600萬(wàn)峰單峰鴕，200萬(wàn)峰雙峰駝。單峰駝主要分布于北非、東非、印度亞大陸及阿拉伯半島的沙漠或干旱地區(qū)，而雙峰駝大部 分分布在亞洲及周邊較為涼爽的地區(qū)，如中國(guó)、蒙古國(guó)、哈薩克斯坦、印度北部及俄 羅斯。中國(guó)和蒙古國(guó)是世界上雙峰駱駝主要產(chǎn)地，中國(guó)約有駱鴕20.5萬(wàn)峰左右，主要 分布在內(nèi)蒙古、新疆、青海、甘肅、寧夏等省區(qū)約110萬(wàn)平方公里的干旱荒漠草原上。 蒙古國(guó)有雙峰駝38萬(wàn)峰，主要分布在南戈壁省、東戈壁省、中戈壁省、戈壁阿爾泰省、 巴彥洪戈?duì)柺?、前抗?ài)省。雙峰鴕是一個(gè)古老物種，也是荒漠戈壁地區(qū)人民重要的生 活和生產(chǎn)資料。由于自然和社會(huì)因素的變化和影響，目前家養(yǎng)雙峰鴕數(shù)量急劇下降， 尤其是野生雙峰駝瀕于滅絕的境地。現(xiàn)存野生雙峰鴕是世界上僅存的真駝屬野生種， 它的同族兄弟是野單峰駝，早已在數(shù)百年前滅絕，由于人類活動(dòng)的破壞干擾和自然環(huán) 境的不斷惡化，野駱鴕數(shù)量急劇減少，現(xiàn)已被列入中國(guó)一類保護(hù)動(dòng)物和世界瀕危物種 紅皮書(shū)。據(jù)中外科學(xué)家們調(diào)査，20世紀(jì)80年代初全球約有2500-3000峰野駱鴕，目 前僅存1000峰左右，比大熊貓的數(shù)量還少，其中中國(guó)大約有700-800峰，其余200-300 峰在蒙古國(guó)境內(nèi)。
關(guān)于雙峰鴕的研究更多地圍繞其生態(tài)保護(hù)、解剖結(jié)構(gòu)和產(chǎn)品特性方面，對(duì)其遺傳 基礎(chǔ)和進(jìn)化分類，特別是從分子遺傳和分子進(jìn)化方面的研究相對(duì)較少。目前對(duì)雙峰鴕 進(jìn)化問(wèn)題， 一種解釋認(rèn)為家養(yǎng)駱鴕是從現(xiàn)存野駱鴕進(jìn)化而來(lái)，兩者十分密切的遺傳關(guān) 系； 一種解釋認(rèn)為現(xiàn)存野駱駝是分歧于家養(yǎng)駱鴕，是家養(yǎng)駱駝管理不善跑到野外所形 成。目前關(guān)于駱駝DNA微衛(wèi)星研究較少，獲得的駱駝微衛(wèi)星數(shù)量也非常有限，因此開(kāi) 發(fā)和利用微衛(wèi)星標(biāo)記，對(duì)于解決開(kāi)展雙峰駝分子遺傳和分子進(jìn)化等研究工作是一項(xiàng)十 分重要技術(shù)問(wèn)題和迫切任務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種預(yù)示區(qū)分家養(yǎng)和野生雙峰 駝DNA微衛(wèi)星的標(biāo)記方法。使得本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，能從基因組分子水平上區(qū)分家養(yǎng) 雙峰駝和野生雙峰駝，為雙峰駝遺傳和進(jìn)化研究，特別是野生雙峰駝的鑒定和保護(hù)， 提供了重要的手段和方法。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明包括以下步驟
(1) 采集雙峰駝耳部組織樣品，根據(jù)常規(guī)酚/氯仿法提取基因組DNA。
(2) 根據(jù)已有雙峰駝微衛(wèi)星標(biāo)記設(shè)計(jì)16對(duì)PCR弓|物，具體見(jiàn)表1 。表l. 16對(duì)用于雙峰駝微衛(wèi)星座位擴(kuò)增的PCR引物
微衛(wèi)星標(biāo)記名稱引物序列擴(kuò)增片段長(zhǎng)度(bp)
CMS 9F: TGCTTTAGACGACTTTTACTTTAC R: ATTTCACTTTCTTCATACTTGTGAT233-256
CMS 13F: TAGCCTGACTCTATCCATTTCTC R: ATTATTTGGAATTCAACTGTAAGG248-265
CMS 16F: ATTTTGCAATTTGTTCGTTCTTTC R: GGAGTTTATTTGCTTCCAACACTT183—193
CMS 18F: GAACGACCCTTGAAGACGAA R: AGCAGCTGGTnTAGGTCCA157—186
CMS 36F: AAATTACTGAATTCCCCCCCTA R: GTTACAACGCTCTCATTCATC139~143
CMS 121F: CAAGAGAACTGGTGAGGATTTTC R: AGTTGATAAAAATACAGCTGGAAAG151—159
VOLP08F: CCATTCACCCCATCTCTC R: TCGCCAGTGACCTTATTTAGA142-172
VOLP 10F: CTTTCTCCTTTCCTCCCTACT R: CGTCCACTTCCTTCATTTC232-260
VOLP-67F: TTAGAGGGTCTATCCAGTTTC R: TGGACCTAAAAGAGTGGAG142-172
LCA65F: TTTTTCCCCTGTGGTTGAAT R: AACTCAGCTGTTGTCAGGGG165-191
YWLL08F: ATCAAGTTTGAGGTGCTTTCC R: CCATGGCATTGTGTTGAAGAC135-177
YWLL36F: AGTCTTGGTGTGGTGGTAGAA R: TGCCAGGTAACTGACAGTGAT148-166
YWLL38F: GGCCTAAATCCTACTAGAC R: CCTCTCACTCTTGTTCTCCTC174-178
YWLL59F: TGTGCAGGAGTTAGGTGTA R: CCATGTCTCTGAAGCTCTGGA96-136
CMS 17F: TATAAAGGATCACTGCCTTC R: AAAATGAACCTCCATAAAGTTAG14" 49
CMS 50F: TTTATAGTCAGAGAGAGTGCTG R: TGTAGGGTTCATTGTAACA154~183
(3) 利用設(shè)計(jì)的16對(duì)引物對(duì)雙峰鴕基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
(4) 使用8X非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物的長(zhǎng)度進(jìn)行基因型分類；
(5) 比較不同微衛(wèi)星標(biāo)記基因型在家養(yǎng)雙峰鴕和野生雙峰鴕的分布，定特異基因型。本實(shí)驗(yàn)從16對(duì)引物中得到3對(duì)引物，它們是V0LP 10、 YWLL 36和YWLL 38， 其擴(kuò)增產(chǎn)物在家養(yǎng)雙峰蛇和野生雙峰鴕中呈現(xiàn)特異基因型(見(jiàn)附圖l)。
雙峰鴕微衛(wèi)星標(biāo)記設(shè)計(jì)3對(duì)HJK引物如下
V0LP—10 F: CTTTCTCCTTTCCTCCCTACT， R: CGTCCACTTCCTTCATTTC; YWLL 36 F: AGTCTTGGTGTGGTGGTAGAA， R: TGCCAGGTAACTGACAGTGAT; YWLL 38 F: GGCCTAAATCCTACTAGAC， R: CCTCTCACTCTTGTTCTCCTC。 F:家養(yǎng)雙峰鴕，R:野生雙峰駝。
(6)對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記引物VOLP 10、 YWLL 36和YWLL 38PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和 測(cè)序。比較特異基因型和非特異基因型間DNA序列，在微衛(wèi)星位點(diǎn)V0LP 10上家養(yǎng) 雙峰駝比野生雙峰駝少13個(gè)(AC)重復(fù)序列；在微衛(wèi)星位點(diǎn)YWLL 36上家養(yǎng)雙峰駝比 野生雙峰駝少2個(gè)(GT)重復(fù)序列；在微衛(wèi)星位點(diǎn)YWLL 38上家養(yǎng)雙峰鴕比野生雙峰 駝多5個(gè)(GA)和1個(gè)(GT)重復(fù)序列。
1 TCGTCCACTTCCTTCATTTCTMGMTCTGMGMGTTATCATCTGAMCMGGCTTCCT 1 TCGTCCACTTCCTTCATTTCTMGMTCTGMGAAGTTATCATCTGAAACMGGCTTCCT 6丄 rmTmTTTCCTTTCTCTTTATTCCMAAGAGAGMGGCCTTGAMAGACTAGAGACC
iiimiiiimmiiiiiiiiiiimuiiimiimiiiiiimmmii
61 TTTTTTTTnTCCTTTCTCTTTATTCCMAAGAGAGMGGCCTTGAMAGACTAGAGACC 121 CTAGGATTTGGGGTTACTTGTTTACGATCATCMGACACACACACACACACACACACACA
Nimiiiiiiiiimmmiiiimiiimiiiiiiiimiiiiiiiiiii
121 CTAGGATTTGGGGTTACTTGTTTACGATCATCMGACACACACACACACACACACACACA 181CACACACACA..........................MGAGMAGAGMATTTGTGACAG
181 CACACACACACACACACACACACACACACACACACMAGAGAAAGAGMATTTGTGACAG 215 TAGGGAGGMAGGAGAAAGA
241 TAGGGAGGAAAGGAGAAAGA YWLL 36
1 TTGCCAGGTMCTGACAGTGATACATCTTATTCAGGTTTGCCTAGnTTMCTGTATTCG
1 TTGCCAGGTMCTGACAGTGATACATCTTATTCAGGTTTGCCTAGTTTTMCTGTATTCG
V0LP 1061 TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT.... TTGTGTGTGTTTAGTTCTG
61 TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTGTGTGTGTTTAGTTCTG
117 TGCMTTTTACAACATTTGTMATACATGTTTCTACCACCACACCMGACTA
121 TGCMTTTTACMCATTTGTAAATACATGTTTCTACCACCACACCMGACTA YWLL 38
1 TGGCCTAMTCCTACTAGACATGGCCTGAGGCTTGCTACTAGATTTTTTTTCCCCTTAGG
1 TGGCCTMATCCTACTAGACATGGCCTGAGGCTTGCTACTAGATTTTmrCCCCTTAGG
61 MAAGGTTTTCTAGTTAAMGAAMGCTTGTTTAGTGTGTGCACGTGTGTATTTGTGTGT
61 MAAGGTTTTCTAGTTMMGMMGCTTGTTTAGTGTGTGCACGTGTGTATTTGTGTGT
121 GTGTGTGTGTGTGTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGGGAGAGATTGAGGAGMCA
121GTGTGTGTGTGT............GAGAGAGAGAGAGAGAGGGAGAGATTGAGGAGMCA
181 AGAGTGAGAGGA
UNIIIIIIII
169 AGAGTGAGAGGA (上家養(yǎng)雙峰鴕；下野生雙峰駝)
本發(fā)明根據(jù)已有雙峰鴕微衛(wèi)星標(biāo)記設(shè)計(jì)合成16對(duì)PCR引物，用這些引物對(duì)中國(guó) 3個(gè)省、蒙古國(guó)7個(gè)省252峰家養(yǎng)雙峰鴕和野雙峰駝基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物用變 性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并基因型。不同基因型在家養(yǎng)雙峰駝和野雙峰駝中分布 的統(tǒng)計(jì)分析顯示，3個(gè)微衛(wèi)星座位(V0LP 10、 YWLL 36禾n YWLL 38)在家養(yǎng)雙峰鴕和 野雙峰駝存在特異等位基因，其中特異片段出現(xiàn)概率分別為100%、 80%和70%， 平均概率為83.33%，特別是微衛(wèi)星位點(diǎn)VOLP IO上出現(xiàn)的概率為100%。 PCR產(chǎn)物 測(cè)序比較結(jié)果顯示，在微衛(wèi)星位點(diǎn)V0LP10上家養(yǎng)雙峰駝比野生雙峰駝少13個(gè)(AC) 重復(fù)序列；在微衛(wèi)星位點(diǎn)YWLL 36上家養(yǎng)雙峰鴕比野生雙峰駝少2個(gè)(GT)重復(fù)序列； 在微衛(wèi)星位點(diǎn)YWLL 38上家養(yǎng)雙峰駝比野生雙峰鴕多5個(gè)(GA)和1個(gè)(GT)重復(fù)序列。 本發(fā)明的區(qū)分家養(yǎng)雙峰鴕和野生雙峰駝的DNA微衛(wèi)星標(biāo)記方法，操作簡(jiǎn)單，能從基 因組分子水平上區(qū)分家養(yǎng)雙峰駝和野生雙峰駝，為雙峰駝遺傳和進(jìn)化研究，特別是
7野生雙峰鴕的鑒定和保護(hù)，提供了重要的手段和方法。


圖1家養(yǎng)和野生雙峰鴕中的特異基因型的聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳圖 其中野生雙峰鴕V0LP 10: Al A2 A3; WLL 36: Bl B2 B3; YWLL 38: Cl C2
C3。家養(yǎng)雙峰鴕V0LP-10: A4 A5 A6; YWLL 36: B4 B5 B6; YWLL 38: C4 C5 C6。
雜交駝V0LP 10: Zl; YWLL 36: Z2。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為
前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。
如圖1所示，本實(shí)施例包括步驟如下 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
實(shí)驗(yàn)共采集中國(guó)3個(gè)省(內(nèi)蒙古自治區(qū)、新疆自治區(qū)、甘肅省)6個(gè)地區(qū)(內(nèi)蒙古
阿拉善左旗、內(nèi)蒙古蘇尼特左旗、內(nèi)蒙古額納旗、新疆博樂(lè)州、新疆巴州、甘肅省酒
泉地區(qū))、蒙古國(guó)7個(gè)省(科布多省、前抗愛(ài)省、南戈壁省、巴彥洪戈?duì)柺　⒏瓯诎?泰省、前戈壁省和中戈壁省)，共計(jì)6個(gè)品種(阿拉善駝、蘇尼特駝、新疆駝、蒙古駝、 蒙古棕鴕、戈壁紅駝)252峰雙峰駝耳樣(其中含5峰蒙古野駱駝)。
2微衛(wèi)星引物
實(shí)驗(yàn)在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上選取了 16對(duì)引物(Evdotchenko D et al. ， 2003. Molecular Ecology Notes, 3， 431 -434; 0breque V et al. ， 1998. Anim Genet, 29, 461-2; Penedo M C T et al., 1999. Animal Genetics, 30， 161-168; Boulevard etal. ， 1996, Animal Genetics, 27， 285-294)用于微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)。具體見(jiàn)表1。
3. PCR反應(yīng)和電泳檢測(cè)
PCR反應(yīng)體系為25 u 1 ，含基因組DNA 100 ng， 10 X buffer 2. 5 u 1 (含Mg, ， 2. 5mM dNTP Mix 2uL， Taq酶1U、 10 pmol上、下游引物各l y L,補(bǔ)充超純水到25 y L。
反應(yīng)條件98'C預(yù)變性5 min; 95。C變性30 see, 55 65°C退火30 sec(因座 位而異)，72。C延伸45 sec， 35個(gè)循環(huán)；72。C后延伸10 min; 4。C終止反應(yīng)。
聚丙烯酰胺凝膠電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在8X的非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電 泳分離后，在ABI377遺傳分析儀(Pekrni Elmerinc)掃描分析。4.特異等位基因統(tǒng)計(jì)分析
初步基因型分析顯示，3對(duì)引物(V0LP 10、 YWLL 36和YWLL 38)在家駝和野 鴕存在特異等位基因。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)其等位基因頻率、雜合度、多態(tài)信息含量等統(tǒng) 計(jì)量進(jìn)行了分析(表2)。
表2、 3個(gè)具有特異等位基因片段的微衛(wèi)星位點(diǎn)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表
微衛(wèi)星~~~~重復(fù)序列 等位基ii S~~觀測(cè)等位~有效等位
因頻率 雜合度雜合度
由表2可見(jiàn)，微衛(wèi)星座位VOLP 10、 YWLL 36和YWLL 38在家養(yǎng)雙峰駝和野生雙峰 駝中，特異片段出現(xiàn)概率分別為100%、 80%和70%，平均概率為83.33%，特別是 微衛(wèi)星位點(diǎn)VOLP 10上出現(xiàn)的概率為100%。因此，用此方法區(qū)分家養(yǎng)雙峰駝和野生 雙峰駝操作簡(jiǎn)單有效，正確率高，將對(duì)保護(hù)野生雙峰鴕起著積極有效的作用。 5.測(cè)序比較
特異位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1X的瓊脂糖凝膠電泳分離后，在紫外操作儀下，將 特異片段切取回收。特異片段回收用DNA的瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。將 回收產(chǎn)物與經(jīng)Sma I限制性內(nèi)切酶酶切并平端化的質(zhì)粒，與PMD18-T載體片段連接， 16°C12 h連接。常規(guī)方法轉(zhuǎn)化E'coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，再于含50 u g/ml氨芐青霉 素，200 mg/mL IPTG及20 mg/mL X-gal的LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜，挑取數(shù)個(gè)白色菌落，煮 沸法提取質(zhì)粒,酶切和PCR鑒定獲得具有大小相符的插入片段的重組子。選取經(jīng)鑒定 的陽(yáng)性重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。
微衛(wèi)星座位VOLP 10、 YWLL 36和YWLL 38 PCR產(chǎn)物測(cè)序比較結(jié)果如下(上家養(yǎng) 雙峰駝；下野生雙峰鴕) VOLP 10
9
(CA)1738. 0%0.6546
(CA)30100%0.0000
(GT)2467, 8%0,4016
(GT)2680%0.2000
(GT)10(GA)1735.8%0,7590
(GT)9(GA)1270%0.6000
0.7647 9 4.2219
0.0000 1 1.0000
0.3974 3 1.6572
0.3778 3 1.5152
0.7359 6 3,7651
0.5111 3 1.8519
VOLP 10 YWLL 36 YWLL 38
它它它它它它
馬馬馬馬馬馬
家野家野家野61
61
121
121
181 CACACACACA..........................AAGAGAAAGAGAAATTTGTGACAG
181
215 TAGGGAGGAAAGGAGAAAGA
241 TAGGGAGGAAAGGAGAAAGA YWLL36
1
61 TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT....TTGTGTGTGTTTAGTTCTG
61
117
121
YWLL38
1
61
61
121
121 GTGTGTGTGTGT............GAGAGAGAGAGAGAGAGGGAGAGATTGAGGAGAACA
181 AGAGTGAGAGGA
169 AGAGTGAGAGGA
10結(jié)果顯示，在微衛(wèi)星位點(diǎn)VOLP 10上家養(yǎng)雙峰駝比野生雙峰駝少13個(gè)(AC)重 復(fù)序列；在微衛(wèi)星位點(diǎn)YWLL36上家養(yǎng)雙峰鴕比野生雙峰鴕少2個(gè)(GT)重復(fù)序列； 在微衛(wèi)星位點(diǎn)YWLL 38上家養(yǎng)雙峰鴕比野生雙峰鴕多5個(gè)(GA)和1個(gè)(GT)重復(fù)序列。本發(fā)明涉及的基因序列表如下 <110>上海交通大學(xué)
<120>預(yù)示可以區(qū)分家養(yǎng)雙峰鴕和野生雙峰駝的DNA微衛(wèi)星標(biāo)記方法
<140> 200810201918.7
<141>2008—10—20
<160> 3
<210>1
<211>260
<212>DNA
<213>野生雙峰鴕(CamelusFerussp.)
<220>
<221> allele
<222>(190)...(217)
<400> 1
tcgtccactt ccttcatttc taagaatctg aagaagttat catctgaaac aaggcttcct 60 ll隱Ul tcctttctct ttattccaaa agagagaagg ccttgaaaag actagagacc 120 ctaggatttg gggttacttg tttacgatca tcaagacaca cacacacaca cacacacaca 180 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacaaaga gaaagagaaa tttgtgacag 240 tagggaggaa aggagaaaga 260
<210>2 <211>172 <212> DNA
<213>野生雙峰鴕(CamelusFerussp.)
々20>
<221> allele
<222> (97)... (201)
<400> 2
12ttgccaggta actgacagtg atacatctta ttcaggtttg cctagtttta actgtattcg 60 t卿卿g t卿卿g tgtgt卿g t卿卿g tttgt鵬g tttagttctg 120 tgcaatttta caacatttgt aaatacatgt ttctaccacc acaccaagac ta 172
<210>3
<211>180
<212>DNA
々13>野生雙峰鴕(CamelusFerussp.)
<220>
<221> allele
<222> (132)... (145)
<400>3
tggcctaaat cctactagac atggcctgag gcttgctact agattttttt tccccttagg 60 aaaaggtttt ctagttaaaa gaaaagcttg tttagtgtgt gcacgtgtgt atttgtgtgt 120 gtgtgtgtgt gtgagagaga gagagagagg gagagattga ggagaacaag agtgagagga 180
權(quán)利要求
1、一種預(yù)示區(qū)分家養(yǎng)和野生雙峰駝DNA微衛(wèi)星的標(biāo)記方法，其特征在于，包括如下步驟(1)采集雙峰駝耳部組織樣品，根據(jù)常規(guī)酚/氯仿法提取基因組DNA；(2)根據(jù)已有雙峰駝微衛(wèi)星標(biāo)記設(shè)計(jì)16對(duì)PCR引物；(3)利用設(shè)計(jì)的16對(duì)引物對(duì)雙峰駝基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(4)使用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度進(jìn)行基因型分類；(5)比較不同微衛(wèi)星標(biāo)記基因型在家養(yǎng)雙峰駝和野生雙峰駝的分布，定特異基因型；(6)對(duì)特異等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)示區(qū)分家養(yǎng)和野生雙峰駝DNA微衛(wèi)星的標(biāo)記方法， 其特征是，所述的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，是指利用設(shè)計(jì)的16對(duì)引物對(duì)雙峰鴕基因組DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的特異性DNA片段。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)示區(qū)分家養(yǎng)和野生雙峰駝DNA微衛(wèi)星的標(biāo)記方法， 其特征是，通過(guò)測(cè)序比較特異基因型和非特異基因型間DNA序列，在微衛(wèi)星位點(diǎn)VOLP 10上家養(yǎng)雙峰鴕比野生雙峰鴕少13個(gè)(AC)重復(fù)序列。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)示區(qū)分家養(yǎng)和野生雙峰駝DNA微衛(wèi)星的標(biāo)記方法， 其特征是，通過(guò)測(cè)序比較特異基因型和非特異基因型間DNA序列，在微衛(wèi)星位點(diǎn)YWLL 36上家養(yǎng)雙峰鴕比野生雙峰駝少2個(gè)(GT)重復(fù)序列。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)示區(qū)分家養(yǎng)和野生雙峰駝DNA微衛(wèi)星的標(biāo)記方法， 其特征是，通過(guò)測(cè)序比較特異基因型和非特異基因型間DNA序列，在微衛(wèi)星位點(diǎn)YWLL 38上家養(yǎng)雙峰駝比野生雙峰駝多5個(gè)(GA)和1個(gè)(GT)重復(fù)序列。
全文摘要
本發(fā)明是一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的預(yù)示區(qū)分家養(yǎng)和野生雙峰駝DNA微衛(wèi)星的標(biāo)記方法，步驟為采集雙峰駝耳部組織樣品，根據(jù)常規(guī)酚/氯仿法提取基因組DNA；利用設(shè)計(jì)的16對(duì)引物對(duì)雙峰駝基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；使用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，根據(jù)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度進(jìn)行基因型分類；比較不同微衛(wèi)星標(biāo)記基因型在雙峰駝的分布，結(jié)果顯示3個(gè)微衛(wèi)星座位(VOLP-10、YWLL 36和YWLL 38)在家養(yǎng)雙峰駝和野雙峰駝間存在特異等位基因；對(duì)特異等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，能從基因組分子水平上區(qū)分家養(yǎng)雙峰駝和野生雙峰駝，為雙峰駝遺傳和進(jìn)化研究，特別是野生雙峰駝的鑒定和保護(hù)，提供了重要的手段和方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101445830SQ200810201918
公開(kāi)日2009年6月3日 申請(qǐng)日期2008年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月30日
發(fā)明者和 孟, 高宏巍 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)