專利名稱：木霉磷脂酶a2及表達(dá)該酶的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及木霉磷脂酶A2和表達(dá)該酶的基因。同時(shí)提供了獲得該酶的高效原 核表達(dá)和親和標(biāo)簽純化方法、構(gòu)建該基因缺失木霉突變子防治玉米彎胞葉斑病的方 法。本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
磷脂是具有親水性和疏水性的一類兼性分子，是構(gòu)成細(xì)胞生物膜的主要成分。
磷脂酶是可以將磷脂水解為各種磷脂酸和氨基醇的酶，根據(jù)磷脂酶對磷脂水解部位 的不同可將磷脂酶分為4類磷脂酶A1、 A2、 C、 D。其中磷脂酶A2 (PLA2)特異 水解磷脂sn — 2位的酯鍵，產(chǎn)生游離脂肪酸和溶血磷脂，這兩個(gè)都是細(xì)胞重要的信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，PLA2對激素、生長因子和有關(guān)激動(dòng)劑起反應(yīng)，參 與細(xì)胞的抗氧化反應(yīng)。PLA2可被異三聚體G蛋白、受體酪氨酸激酶、分裂原激活的 蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶C(PKC)等調(diào)控。
PLA2在真菌侵染寄主中的營養(yǎng)獲得，組織侵染，調(diào)控寄主內(nèi)在的免疫反應(yīng)起 著重要的作用。與哺乳動(dòng)物系統(tǒng)相比，目前為止在真菌中僅有兩個(gè)PLA2基因獲得 克隆(Kohler GA. , et al. 2006. Phospholipase A2 and phospholiapse B activities in fungi. BBA， 1761: 1391-1399.)。木霉是重要的植物生防菌，它主要通過重 寄生，誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗病性發(fā)揮生防作用，目前還未在木霉中克隆到PLA2基因， 更未開展利用克隆基因來調(diào)節(jié)木霉增強(qiáng)誘導(dǎo)植物抗病性的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種木霉磷脂酶A2及表達(dá)該酶 的基因，同時(shí)提供一種獲得該酶的高效的原核表達(dá)和親和標(biāo)簽純化方法，構(gòu)建該基 因缺失突變子，并應(yīng)用于植物抗病性研究。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明利用REMI技術(shù)通過標(biāo)簽定位，質(zhì)粒搶救從木霉中得 到一個(gè)類似人PLA2的基因，原核表達(dá)確認(rèn)的PLA2活性，為研究PLA2的功能研究 和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明提供了全新的木霉磷脂酶A2，表達(dá)木霉磷脂酶A2 (PLA2)的基因，構(gòu) 建高效的原核表達(dá)純化體系，構(gòu)建了該基因缺失突變子，并使用這種突變子增強(qiáng)對 玉米彎胞葉斑病的抗性。
本發(fā)明提供了一種木霉磷脂酶A2，它具有SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列。 本發(fā)明還提供了一種表達(dá)本發(fā)明的木霉磷脂酶A2的基因，該基因是以下(a) 或(b)的核苷酸序列
(a)是SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；或
(b)在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下能與(a)所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交的核苷酸 序列，且該核苷酸序列表達(dá)具有磷脂酶A2活性的蛋白。
本發(fā)明提供了一種高效原核表達(dá)純化木霉磷脂酶A2的方法，包括
a. 使用SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列構(gòu)建原核表達(dá)載體；
b. 使用大腸桿菌表達(dá)構(gòu)建的載體；
c. 親和標(biāo)簽柱純化表達(dá)的酶。
本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建木霉磷脂酶A2的基因缺失突變子防治玉米對彎胞葉 斑病的方法，包括
a. 使用SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列構(gòu)建基因缺失突變子載體；
b. 將構(gòu)建的缺失突變子載體轉(zhuǎn)化進(jìn)木霉原生質(zhì)體；
c. Southern確認(rèn)木霉原生質(zhì)體產(chǎn)生同源重組；將缺失突變子單胞分離，硅膠
保存；
d. 將保存的缺失突變子接種玉米，誘導(dǎo)玉米彎胞葉斑病抗性。
本發(fā)明具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和重要的科學(xué)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。本發(fā)明首次在 絲狀真菌中獲得了木霉磷脂酶A2，克隆了表達(dá)該酶的基因，開啟了研究該類基因在 真菌中功能的先河；提供的獲得該酶的高效方法為生產(chǎn)酶制劑提供了可能，該酶所 具有的酯酶和磷脂酶A2雙功能預(yù)示該酶在工業(yè)催化上有良好的應(yīng)用價(jià)值；該基因 缺失突變子防治玉米彎胞葉斑病的作用為防治玉米彎胞葉斑病的提供了新的應(yīng)用， 可大大減輕玉米彎胞葉斑病病害損失，提高玉米產(chǎn)量。
具體實(shí)施例方式
以下通過具體的實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例不構(gòu)成 對本發(fā)明的限定。
本發(fā)明提供的一種木霉磷脂酶A2具有SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列。 本發(fā)明提供的一種表達(dá)本發(fā)明的木霉磷脂酶A2的基因，是以下(a)或(b)的 核苷酸序列
(a)是SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；或
(b)在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下能與(a)所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交的核苷酸 序列，且該核苷酸序列表達(dá)具有磷脂酶A2活性的蛋白。
本發(fā)明所述的"嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件"是指在所屬領(lǐng)域中已知的低離子強(qiáng)度和高溫的 條件。通常，在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，探針將雜交到核酸的復(fù)合混合物中的其目標(biāo)子序 列上，但并不雜交到復(fù)合混合物中的其它序列上。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是序列依賴性的并 且在不同環(huán)境中將有所不同。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件通常被選擇為低于特異序列在規(guī)定離子 強(qiáng)度PH下的熱熔點(diǎn)(Tm)約5 — 10'C。 Tm為在平衡狀態(tài)下50%與目標(biāo)互補(bǔ)的探針 雜交到目標(biāo)序列時(shí)所處的溫度(在指定離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條 件可為以下條件其中在pH 7.0到8.3下鹽濃度低于約l.OM鈉離子濃度，通常為 約0. 01到1. OM鈉離子濃度(或其它鹽)，并且溫度對于短探針(包括(但不限于) 10到50個(gè)核苷酸)而言為至少約3(TC，而對于長探針(包括(但不限于)大于50 個(gè)核苷酸)而言為至少約6(TC。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件也可通過加入諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑 來實(shí)現(xiàn)。對于選擇性或特異性雜交而言，正信號(hào)可為至少兩倍的背景雜交，視情況
為io倍背景雜交。
——禾中例示性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條《?？扇缦率褂肁mershamGene Images Alkphos Direct Labeling and Detection System kit (Amersham， USA).以不小于55。C溫度雜交過 夜，不小于55'C進(jìn)行第一次洗膜。其余操作參照試劑盒說明書。
實(shí)施例l高效原核表達(dá)純化木霉磷脂酶A2的方法
用引物PET-EcoRl (5 TCCGAATTCTTAAATCTCCTGCCAGCCG)和PET-BamHl (5 'CGC GGATCCATGATTGGCGCTTCAGAGC)從木霉7Wc/ oAr/^. Ao加'Ag77反轉(zhuǎn)錄的cDNA的模 板中擴(kuò)增磷脂酶A2基因的cDNA。膠回收后，用BamHl和EcoRl雙酶切后插入同樣 酶切的PET30a(Nevogen)載體中。轉(zhuǎn)化Rossete (Nevogen)感受態(tài)，挑選陽性菌落， 測序驗(yàn)證讀碼框正確。用牙簽挑菌落接入50 ug/ml濃度Kna, 34ug/ml的5ml LB試 管，37°C， 200轉(zhuǎn)/分鐘，過夜培養(yǎng)。第二天以l: 100比例接入同樣抗生素濃度的 200mlLB的1升三角瓶中，3小時(shí)后加入IPTG至終濃度lmM IPTG, 37。C誘導(dǎo)4h (此 時(shí)上清中蛋白最多)。4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，超聲波70%最大功率，破碎20 分鐘。10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，上清即得到所要的具有活性的粗蛋白酶。His 一tag純化根據(jù)購買的試劑盒說明書(業(yè)力)操作。
實(shí)施例2 利用表達(dá)木霉磷脂酶A2的基因構(gòu)建缺失突變子防治玉米彎胞葉斑病的 方法
設(shè)計(jì)引物PAF1 (5 'ATGCAAATGCACAGCATCTC)和PAF2 (5 'AGCTTATCGATACCGTCGACCT CGAGGACGGCGATGTTGTTGAAGGT) ， PAF3(5 'GGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAATCTCACGG CTGCTCAACA)和PAF4(5 'GGGAAAATCGACGCAGAGAC)擴(kuò)增基因的上游和下游各約1Kb的 序列，同時(shí)利用引物hyg 1 (5 ' CCTCGAGGTCGACGGTATC )和hyg2 (5 ' AAAGGGAACAAM GCTGGAG)擴(kuò)增潮霉素基因，將三個(gè)片段利用融合PCR的方法得到一個(gè)含有中間為 潮霉素基因兩側(cè)為上下游序列的融合片段。制備木霉原生質(zhì)體，方法如下接入lml 107包子/ml到液體馬鈴薯培養(yǎng)基中(1升PDB: 20g葡萄糖，200克土豆；)，28°C， 180轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)24小時(shí)，三層擦鏡紙過濾，三倍體積無菌水沖洗后，稱lg菌 絲到無菌50毫升離心管中，加入2倍體積質(zhì)量比的15mg/毫升崩潰酶，28 °C ， 100 轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)3小時(shí).鏡檢有大量原生質(zhì)產(chǎn)生后。將得到的原生質(zhì)體過三層擦鏡紙， 用冰冷的O. 7摩爾的NaCl沖洗至45ml。 4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，加冰冷無菌的 IO毫升STC(I摩爾山梨醇，50 mM氯化鈣，50毫摩爾Tris-Cl, PH8. 0)重懸沉淀， 4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘。重復(fù)一至兩次。最后用STC定容到106原生質(zhì)體/毫升。 分裝到150微升到每個(gè)50毫升離心管中，取10ul純化的將上面得到的融合片段與 分裝在每管的原生質(zhì)體混合，冰浴20分鐘，然后滴加40。/。PEG(聚乙二醇)每管L5 毫升，冰浴20分鐘。室溫放置10分鐘。加5毫升STC， 4000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘 后加入3毫升的再生培養(yǎng)基(每升含2.8 g (NH4)2S04, 0.6 g Urea, 4 g K3P04， 40 g Glucose, 100 g Sucrose, 0.6 g CaCl2， 0.2 g MgSO4'10H2O, 0.01 g FeS04.7H20, 0.0018 g ZnS04'7H20， 0.0032 gMnS04'H20, 0.004 gCoCl2'6H20)。室溫放置過夜后與12毫 升的固體載體培養(yǎng)基混勻到平板。凝固后，上面再鋪一層300微克/毫升的潮霉素 (Merk)O. 7%的水瓊脂。28°。避光培養(yǎng)，三四天后挑選長出來的菌落，接到200ug/ml 潮霉素PDA平板上，培養(yǎng)l一2天。重復(fù)此過程3次，然后轉(zhuǎn)入不含潮霉素的PDA 平板上，培養(yǎng)1 —2天，重復(fù)此過程6次。然后再轉(zhuǎn)移到含有200微克/毫升潮霉素 PDA平板上。如果還能生長的菌落，說明是遺傳穩(wěn)定的菌落，接入PDA上，提DNA。 用引物hyg 3 (5 'TCGTTTACCCAGAATGCACA )和PAF5(5 'GAATATTCGCCGTGGAGAGG) PCR 篩選后，如果有l(wèi)kb條帶出現(xiàn)的菌落，再用Southern (Amersham)確認(rèn)。將得到的 基因缺失突變子用無菌的5%脫脂奶粉洗下孢子，硅膠粒一2(TC保存。
在PDA平板上培養(yǎng)基因缺失突變子7天，無菌水洗下孢子調(diào)整到107孢子/1111。 在溫室中25'C，用1: 1的山土和有機(jī)肥配制的土壤種植玉米黃早四，待生長到四 葉期。將孢子懸液灌根玉米幼苗，每株5毫升。兩天后，噴強(qiáng)玉米彎孢強(qiáng)致病菌CX-3 107孢子/毫升，每盆毫升，葉部噴施。保濕24小時(shí)，4天后調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算病 情指數(shù)，同時(shí)以原始菌株作為對照，與野生菌株的處理相比，玉米葉片彎孢病情指 數(shù)可降低20. 8%。
SEQ ID NO :1
VTLPQGHGWQEI
SEQ ID NO:2
GTCACTCTGCCTCAAGGCCACGGCTGGCAGGAGATTTAA
權(quán)利要求
1、一種木霉磷脂酶A2，其特征在于具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
2、 一種表達(dá)權(quán)利要求1所述的木霉磷脂酶A2的基因，其特征在于該基因是以 下(a)或(b)的核苷酸序列(a) 是SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；或(b) 在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下能與(a)所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交的核苷 酸序列，且該核苷酸序列表達(dá)具有磷脂酶A2活性的蛋白。
3、 一種原核表達(dá)純化權(quán)利要求1所述木霉磷脂酶A2的方法，包括a. 使用SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列構(gòu)建原核表達(dá)載體；b. 使用大腸桿菌表達(dá)構(gòu)建的載體；c. 親和標(biāo)簽柱純化表達(dá)的酶。
4、 一種利用表達(dá)木霉磷脂酶A2的基因構(gòu)建缺失突變子防治玉米彎胞葉斑病的 方法，其特征在于包括a. 使用SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列構(gòu)建基因缺失突變子載體；b. 將構(gòu)建的缺失突變子載體轉(zhuǎn)化進(jìn)木霉原生質(zhì)體；c. Southern確認(rèn)木霉原生質(zhì)體產(chǎn)生同源重組；將缺失突變子單胞分離，硅膠保存；d. 將保存的缺失突變子接種玉米，防治玉米彎胞葉斑病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種木霉磷脂酶A2及表達(dá)該酶的基因，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一個(gè)木霉磷脂酶A2(PLA2)氨基酸和核苷酸序列，構(gòu)建了該酶高效的原核表達(dá)，純化體系；構(gòu)建了該基因缺失突變體，并使用其防治玉米彎胞葉斑病，取得良好的防治效果。本發(fā)明首次在絲狀真菌中獲得了木霉磷脂酶A2，克隆了表達(dá)該酶的基因，提供的獲得該酶的高效方法為生產(chǎn)酶制劑提供了可能，該酶所具有的酯酶和磷脂酶A2雙功能預(yù)示該酶在工業(yè)催化上有良好的應(yīng)用價(jià)值；該基因缺失突變子防治玉米彎胞葉斑病的作用為防治玉米彎胞葉斑病的提供了新的應(yīng)用，可大大減輕玉米彎胞葉斑病病害，提高玉米產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12N15/55GK101386844SQ20081020193
公開日2009年3月18日 申請日期2008年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月30日
發(fā)明者劉力行, 兵 王, 捷 陳 申請人:上海交通大學(xué)