專利名稱：：基于基因置換技術(shù)的活菌內(nèi)標的制備方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及的是一種生物
技術(shù)領域：
的方法，具體地說是一種可廣泛運用于熒光定量的基于基因置換技術(shù)的活菌內(nèi)標的制備方法。
背景技術(shù)：
：熒光定量PCR(real-timequantitativepolymerasechainreaction的縮寫)，是指熒光定量聚合酶鏈式反應。熒光定量PCR技術(shù)是在普通PCR技術(shù)基礎上發(fā)展起來的一種核酸定量技術(shù)，它是在普通的PCR系統(tǒng)中加人一種與目標片段序列互補的雙標記熒光探針，該探針的5'端標記熒光報告基團，3'端標記熒光淬滅基團，當探針完整時，由于淬滅基團的作用，報告基團不能產(chǎn)生熒光；在PCR擴增中由于Taq酶的5'_3'外切酶的活性將探針酶切降解，使得熒光報告基團分離，淬滅基團對其淬滅作用解除，報告基團即可發(fā)出熒光信號，即每擴增一條DNA鏈就有一個熒光分子形成，經(jīng)特定的熒光分析儀測定相應的熒光強度，能夠?qū)CR擴增的每一循環(huán)進行觀察，然后與所建立的標準曲線進行比較，即可推算出目標片段的起始量。熒光定量PCR技術(shù)與以前的以終點法進行定量的普通PCR技術(shù)相比具有很大的優(yōu)勢。首先，它不僅操作簡便、快速高效，而且具有很高的靈敏性、重復性和特異性。其次，由于是在封閉的體系中完成擴增并進行實時測定，大大降低了污染的可能性并且無須在擴增后進行染膠、照膠等操作。目前它作為一個極有效的實驗技術(shù)，已被廣泛地應用于分子生物學研究的各個領域。但是熒光定量PCR方法在不同的實驗室或檢測部門所檢測的目的基因和操作流程有一定的差異，沒有形成統(tǒng)一標準，得到的檢測結(jié)果也不盡相同。近年來的研究表明，增菌培養(yǎng)過程中抑制目標菌生長的成分、目標菌的收集效率和DNA提取過程目標菌的損失及殘留的PCR抑制成分都會影響熒光定量PCR的最終檢測結(jié)果，導致假陰性現(xiàn)象的發(fā)生。盡管熒光定量PCR方法在不斷的改進和完善，卻不能有效地阻止試驗過程中假陰性結(jié)果的發(fā)生。為了解決熒光定量PCR方法中普遍存在的假陰性問題，近幾年在熒光定量PCR擴增體系中引入了擴增內(nèi)標。其主要原理是在熒光定量PCR中使用與目的基因相似的擴增內(nèi)標，它的兩端引物結(jié)合序列與目的基因完全一致，但具有不同的探針結(jié)合序列，使之不能與目的基因的探針結(jié)合，只能與內(nèi)標探針結(jié)合。于是，在含內(nèi)標的熒光定量PCR體系中有兩種DNA模板——目的基因片段和擴增內(nèi)標；一對引物，該對引物既能與目標基因片段結(jié)合，也與擴增內(nèi)標結(jié)合；兩條探針——目標基因探針和擴增內(nèi)標探針，分別結(jié)合目標基因片段和擴增內(nèi)標。在擴增內(nèi)標與目標片斷的共同擴增中如果存在抑制現(xiàn)象，擴增內(nèi)標的PCR擴增也將被抑制，從而達到指示PCR反應假陰性的目的。制備IAC(擴增內(nèi)標)的方法有很多，根據(jù)不同的實驗目的和要求采用不同的制備方法。一般采用分子克隆技術(shù)，將一段人工構(gòu)建的序列插入到質(zhì)粒中。這段人工序列是利用克隆技術(shù)將目標序列的PCR產(chǎn)物通過插入、刪除或者替換等手段處理后制備的。由于目前的擴增內(nèi)標均是構(gòu)建在質(zhì)粒上然后直接添加到PCR反應體系中，無法象普通細菌一樣添加到增菌培養(yǎng)液中與目標菌一起經(jīng)歷增菌培養(yǎng)、菌體收集、DNA提取及PCR擴增全過程，因此僅僅只能指示PCR擴增過程中的抑制成分，而無法監(jiān)測增菌培養(yǎng)過程中影響目標菌生長的抑制因子、目標菌的收集效率和DNA提取過程中的目標菌損失率，這些都將在很大程度上影響最終的PCR檢測結(jié)果，從而大大限制了它的廣泛應用和相應技術(shù)標準化的進程。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索中發(fā)現(xiàn)，基因置換技術(shù)的出現(xiàn)和完善使得外源基因片段整合到細菌染色體上，如ThomasonL，CourtDL.Re固bineering:geneticengineeringinbacteriausinghomologousrecombination.CurrProtocMolBiol.2007Ch即terl:Unit1.16(ThomasonL，CourtDL，同源重組技術(shù)在細菌基因工程中的應用。分子生物學試驗手冊，2007第一章第1.16節(jié))。這使得內(nèi)標序列不僅可以構(gòu)建在質(zhì)粒上還可以通過基因置換技術(shù)插入到細菌染色體中，成為帶有內(nèi)標序列的活菌內(nèi)標，該活菌內(nèi)標可以和目標菌一起共同經(jīng)歷增菌培養(yǎng)、菌體收集、DNA提取和PCR擴增的全過程。到目前為止還沒有關(guān)于活菌內(nèi)標運用于微生物PCR檢測的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種基于基因置換技術(shù)的活菌內(nèi)標的制備方法。本發(fā)明利用基因置換的方法，將一段內(nèi)標序列通過與單核細胞增生李斯特菌CMCC54002hly基因雙交換整合到單核細胞增生李斯特菌染色體上，制備單核細胞增生李斯特活菌內(nèi)標，通過將活菌內(nèi)標添加到待檢樣品中與野生單核細胞增生李斯特菌共同經(jīng)歷增菌培養(yǎng)、菌體收集、DNA提取和PCR擴增的全過程，實現(xiàn)單核細胞增生李斯特菌檢測過程中假陰性現(xiàn)象的全程監(jiān)控。本發(fā)明將所設計的活菌內(nèi)標具有與目標菌相似的生長速度、DNA提取效率及PCR擴增效率，該活菌內(nèi)標添加到待檢樣品中，有助于全程指示檢測過程中的假陰性現(xiàn)象，提高檢測結(jié)果的準確率，為滿足臨床和檢疫執(zhí)法過程中所急需的對致病微生物調(diào)査和檢測提供有效可靠的技術(shù)手段。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)本發(fā)明包括步驟如下(1)上下游同源重組序列、擴增內(nèi)標序列和卡那霉素抗性基因序列的選擇和相應酶切位點的設計；其中同源重組序列，是指在基因置換過程中與目標基因發(fā)生雙交換的DNA序列。所述的目標基因，是指單核細胞增生李斯特菌hly基因。(2)含上下游同源序列、內(nèi)標序列和卡那霉素抗性基因的同源重組質(zhì)粒沐SV7-UIKD的制備；(3)同源重組質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)單核細胞增生李斯特菌及相應電轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)了供體性狀的受體細胞轉(zhuǎn)化子的篩選；(4)發(fā)生基因置換的單核細胞增生李斯特活菌內(nèi)標的篩選；(5)基于基因置換技術(shù)的活菌內(nèi)標制備方法的驗證，通過在待檢測樣品中添加活菌內(nèi)標與目標菌共同經(jīng)歷增菌培養(yǎng)、菌體收集、DNA提取和PCR擴增來驗證所制備的擴增內(nèi)標制備方法。所述的同源重組質(zhì)粒，是指包含上下游同源序列、內(nèi)標序列和卡那霉素抗性基因序列的溫敏型質(zhì)粒，當溫度高于37'C時該質(zhì)粒不能在宿主菌中復制，從而介導基因置換現(xiàn)象的發(fā)生。所述的基因置換，是指應用DNA同源重組原理，在上下游同源重組序列之間插入抗性基因做篩選標記，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入微生物中，通過同源序列的雙交換,將抗性基因和目的基因置換到染色體上，并通過突變株的抗性進行篩選，從而得到整合有外源片段的突變菌株。所述的擴增內(nèi)標序列是人工設計的，具有與目標擴增序列相同的長度和GC含量，在確保與目標片斷擴增效率一致性的同時與其它致病微生物基因組序列非同源。所述的感受態(tài)單核細胞增生李斯特菌，是指單核細胞增生李斯特菌細胞經(jīng)過一些特殊方法的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，從而能夠容納許多包含外源DNA的載體分子通過的生理狀態(tài)。所述的電轉(zhuǎn)化，是指利用瞬間高壓在感受態(tài)細胞上打孔，從而便于外源片段從孔洞中進入到細胞內(nèi)的技術(shù)。所述的活菌內(nèi)標，是指通過基因置換技術(shù)人工設計制備的含有擴增內(nèi)標序列的突變菌株，具有與目標菌相似的生長速度、菌體收集效率、DNA提取效率及PCR擴增效率。其用途是全程顯示致病微生物定量PCR檢測中的假陰性現(xiàn)象，提高熒光定量PCR檢測結(jié)果的準確率。所述的假陰性，是指熒光定量PCR反應受到了增菌培養(yǎng)、菌體收集和DNA提取中的菌體損失及存在的抑制劑的影響而沒有發(fā)生反應，或者是由于操作人員的操作失誤導致結(jié)果呈現(xiàn)陰性。所述的步驟4中的篩選，是指在4rc和氯霉素存在的條件下連續(xù)傳代含同源重組質(zhì)粒的單核細胞增生李斯特菌轉(zhuǎn)化子，涂氯霉素抗性平板挑選發(fā)生單交換的菌株；在3(TC和不含抗生素的條件下連續(xù)傳代挑選的單交換菌株，涂無抗平板，再將無抗平板上的菌落轉(zhuǎn)接到卡那霉素抗性平板和氯霉素抗性平板，挑選卡那霉素抗性平板上長，氯霉素抗性平板上不長的疑似發(fā)生基因置換的菌落并進行PCR驗證。所述的步驟5中的評價，是指分別采集牛奶、雞肉和熏肉樣品(無菌取樣)，每份樣品10g放入滅菌勻漿杯中加88ml改良單核細胞增生李斯特菌增菌培養(yǎng)液(UVM)充分勻漿，分別接入單核細胞增生李斯特菌CMCC54002菌液(103CFU/ml)lml和相同濃度活菌內(nèi)標菌株菌液(103CFU/ml)lml;然后與純培養(yǎng)的含活菌內(nèi)標的單核細胞增生李斯特菌陽性對照一起在37'C的搖床(150r/min)中增菌培養(yǎng)，并且分別增菌Oh、3h和6h后抽提菌體DNA作為熒光定量PCR模板，進行熒光定量PCR檢測，同時，以無菌水代替DNA模板作空白對照。本發(fā)明的活菌內(nèi)標是添加到待測樣品的增菌培養(yǎng)液中，該活菌內(nèi)標與目標菌共同經(jīng)歷增菌培養(yǎng)、菌體收集、DNA提取和PCR擴增的全過程，并通過熒光定量PCR擴增過程中不同熒光染料標記的T叫Man探針進行結(jié)果分析，實現(xiàn)對目標菌檢測過程中假陰性現(xiàn)象的全程監(jiān)控。該方法能夠指示目標菌從最初增菌培養(yǎng)、菌體收集、DNA提取到最終PCR擴增的整個檢測過程中存在的抑制成分，避免了由這些抑制成分所導致的假陰性現(xiàn)象的發(fā)生，從而大大提高了微生物熒光定量PCR檢測的準確率。本發(fā)明涉及單核細胞增生李斯特菌，利用基因置換的方法，將一段內(nèi)標序列通過與單核細胞增生李斯特菌CMCC54002hly基因雙交換整合到單核細胞增生李斯特菌染色體上，制備單核細胞增生李斯特活菌內(nèi)標(Listeriamonocytogenes-IAC)，通過將活菌內(nèi)標添加到待檢樣品中與野生單核細胞增生李斯特菌共同經(jīng)歷增菌培養(yǎng)、菌體收集、DNA提取和PCR擴增的全過程，實現(xiàn)單核細胞增生李斯特菌檢測過程中假陰性現(xiàn)象的全程監(jiān)控。該活菌內(nèi)標(Listeriamonocytogenes-IAC)于2008年5月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCM208075。圖1活菌內(nèi)標制備步驟圖例；圖中步驟l:亞克隆質(zhì)粒pSK-UID的制備；步驟2:亞克隆質(zhì)粒pSK-UIKD的制備；步驟3:同源重組質(zhì)粒pKSV7-UIKD的制備；步驟4:同源重組質(zhì)粒與目標基因的雙交換；步驟5:基因置換菌株(活菌內(nèi)標)的篩選。圖2同源重組質(zhì)粒沐SV7-UIKD酶切驗證結(jié)果示意圖；圖中電泳泳道l:質(zhì)粒pKSV7-UIKD;電泳泳道2:BamHI單酶切；電泳泳道3:BamHI、KpnI雙酶切；電泳泳道4:BamHI、SalI雙酶切；M:DNA分子量標準。圖3基因置換菌株篩選結(jié)果示意圖；圖中箭頭所示在無抗生素平板及卡那霉素抗性平板上生長而在氯霉素抗性平板上不生長的菌株即為疑是基因置換菌株。具體實施方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但保護范圍不限于下述的實施例。實施例一、同源重組片段和相應酶切位點的設計1.上游同源序列(UHF)的選擇和酶切位點的設計針對單核細胞增生李斯特菌的hly基因及其上游片段序列特征，設計上游同源序列擴增引物及相應酶切位點(KpnI、SalI):上游同源序列擴增引物(Hlyku-s/Hlyku-a)Hlyku-s:5，-CTTGGTACCCGATGTACCGTATTCCTG_3，Hlyku-a:5，-ATTGTCGACGGGTTTCACTCTCCTTCT-3，(a)上游同源序列的序列特征*長度551堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線形(b)分子類型DNA(C)最初來源單核細胞增生李斯特菌(d)序列描述SEQIDNO.1ACCC2.下游同源序列(UDF)的選擇和酶切位點的設計針對單核細胞增生李斯特菌的hly基因及其下游片段序列特征，設計下游同源序列擴增引物及相應酶切位點(EcoRI、PstI):下游同源序列擴增引物(Hlykd-s/Hlykd-a)Hlykd-s:5,_CTTGAATTCAATAAAACCGCTTAACAC-3，Hlykd-a:5，-TAACTGCAGTCAAGTAACCACCAGAAC-3，(a)下游同源序列的序列特征*長度565堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線形(b)分子類型DNA(C)最初來源單核細胞增生李斯特菌(d)序列描述SEQIDNO.2GTTCTGGTGGTTACTTGA3.內(nèi)標序列(syntheticsequence)的選擇和酶切位點的設計針對單核細胞增生李斯特菌的hly基因特征設計相應內(nèi)標序列及酶切位點(SalI、EcoRI):(a)擴增內(nèi)標序列的序列特征*長度144堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線形(b)分子類型DNA(C)最初來源人工合成(d)序列描述SEQIDNO.3ATTACTATTTG4.卡那霉素抗性基因序列(Kan-R)的選擇和酶切位點的設計根據(jù)質(zhì)粒pPIC9K上卡那霉素抗性基因序列特征設計擴增引物及相應酶切位點(EcoRI、EcoRI):卡那霉素抗性基因序列擴增引物(Kan-s/Kan-a)Kan-s:5，-GGGGAATTCGGGGGGGAAAGCCACGTTG-3，Kan-a:5，-GGGGAATTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTG_3，(a)卡那霉素抗性基因序列的序列特征*長度1209堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線形(b)分子類型DNA(C)最初來源質(zhì)粒pPIC9K(d)序列描述SEQIDNO.4TCAGGCCTGGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCA二、同源重組質(zhì)粒沐SV7-UIKD制備1.亞克隆質(zhì)粒pSK-UIKD的制備根據(jù)上游同源序列、下游同源序列、擴增內(nèi)標序列和卡那霉素抗性基因序列各自酶切位點依次通過酶切酶連反應連接到質(zhì)粒pSK上，制備亞克隆質(zhì)粒pSK-UIKD(如圖1步驟1、2所示)2.同源重組質(zhì)粒沐SV7-UIKD的制備將亞克隆質(zhì)粒pSK-UIKD用KpnI和BamHI雙酶切，酶切片段經(jīng)凝膠電泳回收后與相應的經(jīng)過KpnI和BamHI雙酶切的質(zhì)粒pKSV7進行酶連反應，制備同源重組質(zhì)粒沐SV7-UIKD。(如圖1步驟3所示)3.同源重組質(zhì)粒pKSV7-UIKD的酶切驗證將同源重組質(zhì)粒pKSV7-UIKD分別用BamHI單酶切、BamHI和KpnI雙酶切、BamHI和SalI雙酶切，經(jīng)凝膠電泳分析電泳條帶大小與試驗設計相符，證明成功制備了同源重組質(zhì)粒沐SV7-UIKD(如圖2所示)。三、同源重組質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化及相應轉(zhuǎn)化子的篩選1.感受態(tài)單核細胞增生李斯特菌的制備取過夜培養(yǎng)的單核細胞增生李斯特菌lml加入到100mlBHI(含0.5M蔗糖)培養(yǎng)液中培養(yǎng)4.5小時；加入100ul10mg/ml青霉素G，繼續(xù)培養(yǎng)2小時；離心并用HEPES(含O.5M蔗糖)洗滌兩次；用5mlHEPES重懸菌體，并加入15ul50mg/ml溶菌酶于37。C溫育20分鐘；離心并用HEPES洗滌兩次，最后用lmlHEPES重懸菌體并分裝到離心管保存。2.同源重組質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選將同源重組質(zhì)粒加到單核細胞增生李斯特菌感受態(tài)細胞中，輕輕混勻后加入到電轉(zhuǎn)杯中，以1KV、5ms進行電擊，完畢后馬上加入lmlBHI(含0.5M蔗糖)培養(yǎng)液，冰上放置30分鐘；轉(zhuǎn)到離心管中，3(TC靜置1小時；將菌液涂布到含氯霉素的BHI平板上，3(TC培養(yǎng)兩天；挑選平板上的菌落進行PCR驗證，得到所需的轉(zhuǎn)化子。四、基因交換菌株的篩選(如圖1步驟4、5所示)1.單交換菌株的篩選將陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到含氯霉素的BHI培養(yǎng)液中，接種量為l:1000，4rC溫和振蕩培養(yǎng)并連續(xù)傳代6次;將第6代細菌培養(yǎng)物涂布到含氯霉素的BHI平板上，4rC過夜培養(yǎng)，挑取平板上生長的單菌落進行PCR驗證，得到所需的單交換菌株。2.雙交換菌株的篩選將單交換菌株接種到不含抗生素的BHI培養(yǎng)液中，30'C培養(yǎng)并連續(xù)傳代4次，將第4次細菌培養(yǎng)物涂布到無抗BHI平板上，37t:過夜培養(yǎng)，挑選單個菌落分別點種到含卡那霉素的BHI平板和含氯霉素的BHI平板上，3(TC培養(yǎng)過夜，在卡那霉素平板上生長而在氯霉素平板上不能生長的菌落即為可能的基因置換菌株(如圖3所示)，經(jīng)過進一步的PCR驗證得到所需的基因交換菌株。五、基于基因置換技術(shù)的活菌內(nèi)標制備方法的驗證1.熒光定量PCR引物及探針熒光定量PCR引物(hlyF/hlyR)hlyF:5，-CATGGCACCACCAGCATC_3'hlyR:5，_CATCCGCGTGTTTCTTTTCG-3，單核細胞增生李斯特菌檢測探針5，-FAM-CCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCA-ECLIPCE-3'活菌內(nèi)標檢測探針5'-HEX-ATAGGAGCACTCGCCGCCCACATC-ECLIPCE-3'2.熒光定量PCR反應條件的建立確定的反應體系如下10XbufferIXMgC12溶液5mMdNTP300nM.上下游引物各200nMExTaqHS聚合酶1.25U探針__100nM(probe-W)或300nM(probe-1)目標片段或擴增內(nèi)標lwl_補無菌水至25ulPCR循環(huán)參數(shù)為45個循環(huán)，每個循環(huán)的程序包括95。C變性5s，退火延伸溫度65。C，時間為20s，循環(huán)結(jié)束后降溫至4。C，結(jié)束所有操作程序。3.基于基因置換技術(shù)的活菌內(nèi)標制備方法的驗證(1)取含103CFU數(shù)量級的內(nèi)標菌液lml接種到98mlUVM改良李斯特菌增菌液中，然后將含103CFU數(shù)量級的單核細胞增生李斯特菌CMCC54002菌液lml接入其中，在37。C的搖床中增菌培養(yǎng)，分別增菌0h、3h和6h，以此作為陽性對昭."、、，(2)分別采集牛奶、雞肉和熏肉作為人工污染樣品，將其放入滅菌的勻漿杯中，加88mlUVM改良李斯特菌增菌液，充分勻漿。取含103CFU數(shù)量級的內(nèi)標菌液和單核細胞增生李斯特菌菌液各lml接種到該勻漿中，在37'C的搖床中增菌培養(yǎng)，分別增菌0h、3h和6h;(3)將增菌液轉(zhuǎn)入100ml離心管，3,000rpm離心5min，沉淀培養(yǎng)物中的食品殘渣，取上清8，000rpm離心10min收集菌體；(4)無菌水重懸菌體，抽提菌體DNA作為熒光定量PCR模板，進行熒光定量PCR檢測，同時，以無菌水代替DNA模板作空白對照，根據(jù)野生菌和內(nèi)標菌的擴增結(jié)果來對內(nèi)標菌指示假陰性的能力進行驗證(結(jié)果如表l一表4)。表1人工污染試驗陽性對照結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2人工污染牛奶樣品檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表3人工污染雞肉樣品檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表4人工污染腌肉樣品檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>根據(jù)熒光定量PCR檢測后所得結(jié)果表明(見表l一表4):陽性對照和牛奶樣品中野生菌和活菌內(nèi)標不經(jīng)過增菌培養(yǎng)即可檢出，雞肉樣品經(jīng)增菌3h后野生菌和活菌內(nèi)標方可檢出，而腌肉樣品要經(jīng)增菌6h后野生菌和活菌內(nèi)標才可檢出。這說明本研究制備的活菌內(nèi)標能很好指示出不同樣品在整個檢測過程中的出現(xiàn)的假陰性現(xiàn)象，而這些假陰性現(xiàn)象的產(chǎn)生不僅僅是由于PCR的無效擴增，還包括增菌過程中抑制細菌生長的成分、菌體收集及DNA提取過程中的菌體損失等，這些都是傳統(tǒng)擴增內(nèi)標無法參與的過程。因此，本實施例可廣泛運用于熒光定量PCR活菌內(nèi)標的設計，所設計的活菌內(nèi)標與待檢樣品中的微生物共同經(jīng)歷增菌培養(yǎng)、菌體收集、DNA提取和PCR擴增的全過程，實現(xiàn)對微生物檢測過程中假陰性現(xiàn)象的全程監(jiān)控。該方法有助于檢測時顯示假陰性現(xiàn)象的存在，提高檢測結(jié)果的準確性，為滿足臨床和檢疫執(zhí)法過程中所急需的對致病微生物調(diào)査和檢測提供有效可靠的技術(shù)手段。權(quán)利要求1、一種基于基因置換技術(shù)的活菌內(nèi)標的制備方法，其特征在于，包括步驟如下(1)上下游在基因置換過程中與單核細胞增生李斯特菌hly目標基因發(fā)生雙交換DNA的同源重組序列、擴增內(nèi)標序列和卡那霉素抗性基因序列的選擇和相應酶切位點的設計；(2)含上下游同源序列、內(nèi)標序列和卡那霉素抗性基因的同源重組質(zhì)粒pKSV7-UIKD的制備；(3)同源重組質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)單核細胞增生李斯特菌及相應電轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)了供體性狀的受體細胞轉(zhuǎn)化子的篩選；(4)發(fā)生基因置換的單核細胞增生李斯特活菌內(nèi)標的篩選；(5)通過在待檢測樣品中添加活菌內(nèi)標與目標菌共同經(jīng)歷增菌培養(yǎng)、菌體收集、DNA提取和PCR擴增來驗證所制備的擴增內(nèi)標。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的基于基因置換技術(shù)的活菌內(nèi)標的制備方法，其特征是，所述的基因置換，是指應用DNA同源重組原理，在上下游同源重組序列之間插入抗性基因做篩選標記，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入微生物中，通過同源序列的雙交換，將抗性基因和目的基因置換到染色體上，并通過突變株的抗性進行篩選，從而得到整合有外源片段的突變菌株。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的基于基因置換技術(shù)的活菌內(nèi)標的制備方法，其特征是，所述的同源重組質(zhì)粒，是指包含上下游同源序列、內(nèi)標序列和卡那霉素抗性基因序列的溫敏型質(zhì)粒，當溫度高于37'C時該質(zhì)粒不能在宿主菌中復制，從而介導基因置換現(xiàn)象的發(fā)生。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的基于基因置換技術(shù)的活菌內(nèi)標的制備方法，其特征是，所述的擴增內(nèi)標序列是人工設計的，具有與目標擴增序列相同的長度和GC含量，在確保與目標片斷擴增效率一致性的同時與其它致病微生物基因組序列非同源。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的基于基因置換技術(shù)的活菌內(nèi)標的制備方法，其特征是，所述的感受態(tài)單核細胞增生李斯特菌，是指單核細胞增生李斯特菌細胞經(jīng)過一些特殊方法的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，從而能夠容納許多包含外源DNA的載體分子通過的生理狀態(tài)。6、根據(jù)權(quán)利要求l所述的基于基因置換技術(shù)的活菌內(nèi)標的制備方法，其特征是，所述的電轉(zhuǎn)化，是指利用瞬間高壓在感受態(tài)細胞上打孔，從而便于外源片段從孔洞中進入到細胞內(nèi)的技術(shù)。7、根據(jù)權(quán)利要求l所述的基于基因置換技術(shù)的活菌內(nèi)標的制備方法，其特征是，所述的活菌內(nèi)標，是指通過基因置換技術(shù)人工設計制備的含有擴增內(nèi)標序列的突變菌株，具有與目標菌相似的生長速度、菌體收集效率、DNA提取效率及PCR擴增效率。8、根據(jù)權(quán)利要求l所述的基于基因置換技術(shù)的活菌內(nèi)標的制備方法，其特征是，所述的步驟4中的篩選，是指在4rc和氯霉素存在的條件下連續(xù)傳代含同源重組質(zhì)粒的單核細胞增生李斯特菌轉(zhuǎn)化子，涂氯霉素抗性平板挑選發(fā)生單交換的菌株；在3crc和不含抗生素的條件下連續(xù)傳代挑選的單交換菌株，涂無抗平板，再將無抗平板上的菌落轉(zhuǎn)接到卡那霉素抗性平板和氯霉素抗性平板，挑選卡那霉素抗性平板上長，氯霉素抗性平板上不長的疑似發(fā)生基因置換的菌落并進行PCR驗證。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于基因置換技術(shù)的活菌內(nèi)標的制備方法，其特征是，所述的步驟5中的評價，是指分別采集牛奶、雞肉和熏肉無菌取樣樣品，每份樣品10g放入滅菌勻漿杯中加88ml改良單核細胞增生李斯特菌增菌培養(yǎng)液充分勻漿，分別接入單核細胞增生李斯特菌CMCC54002103CFU/ml菌液lml和相同濃度活菌內(nèi)標菌株103CFU/ml菌液lml;然后與純培養(yǎng)的含活菌內(nèi)標的單核細胞增生李斯特菌陽性對照一起在37'C、150r/min的搖床中增菌培養(yǎng)，并且分別增菌0h、3h和6h后抽提菌體DNA作為熒光定量PCR模板，進行熒光定量PCR檢測，同時，以無菌水代替DNA模板作空白對照。全文摘要本發(fā)明是一種生物
技術(shù)領域：
的基于基因置換技術(shù)的活菌內(nèi)標的制備方法。包括(1)上下游在基因置換過程中與目標基因發(fā)生雙交換DNA的同源重組序列、擴增內(nèi)標序列和卡那霉素抗性基因序列的選擇和相應酶切位點的設計；(2)含上下游同源序列、內(nèi)標序列和卡那霉素抗性基因的同源重組質(zhì)粒pKSV7-UIKD的制備；(3)同源重組質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)單核細胞增生李斯特菌及相應電轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)了供體性狀的受體細胞轉(zhuǎn)化子的篩選；(4)發(fā)生基因置換的單核細胞增生李斯特活菌內(nèi)標的篩選；(5)通過在待檢測樣品中添加活菌內(nèi)標等來驗證所制備的擴增內(nèi)標。本發(fā)明避免了由這些抑制成分所導致的假陰性現(xiàn)象的發(fā)生，從而大大提高了微生物熒光定量PCR檢測的準確率。文檔編號C12Q1/04GK101397587SQ20081020229公開日2009年4月1日申請日期2008年11月6日優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日發(fā)明者史賢明,張忠明,施春雷,朱欣娜,飛龍申請人:上海交通大學