專利名稱：直接的mRNA富集定量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種直接的mRNA富 集定量方法。
背景技術(shù)：
RNA在生物遺傳信息的傳遞上起著重要作用。目前，有許多基于首先進(jìn)行 RNA抽提，然后間接進(jìn)行mRNA定量方法，例如northern印跡、實(shí)時(shí)定量RT -PCR檢測(cè)和DNA芯片等。在現(xiàn)有常規(guī)方案中，雖然northern印跡分析可用于量 化多目標(biāo)基因，但是其靈敏度較低，雜交需要大量的總RNA且檢測(cè)周期長(zhǎng)。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典的mRNA定量法是實(shí)時(shí)定量RT - PCR (Bustin等 Quantitative real-time RT-PCR—a perspective, Journal of Molecular Endocrinology (分子內(nèi)分泌學(xué)雜志)2005年34巻597-601頁(yè))。 該法的特征在于先提取RNA，然后將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再PCR擴(kuò)增定量。 需要至少1個(gè)小時(shí)的反轉(zhuǎn)錄及兩個(gè)小時(shí)PCR擴(kuò)增，總檢測(cè)時(shí)間太長(zhǎng)；存在反轉(zhuǎn) 錄酶非線性轉(zhuǎn)錄，Taq酶非線性放大的傾向，RNA模板易降解，很難自動(dòng)化等難 題。微陣列芯片技術(shù)，可同時(shí)進(jìn)行數(shù)以千計(jì)的基因表達(dá)水平的分析，但是由于 雜交條件非特異而靈敏度相對(duì)較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種直接的mRNA富集定量方 法，不需要進(jìn)行RNA抽提，快速簡(jiǎn)便，易于自動(dòng)化，特異性強(qiáng)，在常規(guī)的實(shí)驗(yàn) 條件下即可完成對(duì)RNA的定量檢測(cè)，可以迅速直接地監(jiān)測(cè)的mRNA水平的變化。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明不需要進(jìn)行RNA抽提，在待檢 測(cè)的菌體或組織破碎后，利用特異性的核酸探針液相雜交保護(hù)特異性的mRNA部 分片段后，用SI和RNAse酶切除去單鏈DNA，未保護(hù)的RNA,過(guò)量的探針和錯(cuò) 配的雜交體，完全配對(duì)的mRNA片段經(jīng)生物素-鏈親和素交互作用被磁珠富集后， 用雙鏈結(jié)合染料直接線性放大定量。
本發(fā)明包括如下步驟-
第一步，探針設(shè)計(jì)利用待檢測(cè)的mRNA序列設(shè)計(jì)和合成互補(bǔ)的DNA或RNA 探針，5'端或3'端用生物素標(biāo)記；
所指的待檢測(cè)的mRNA包括各種生物體基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的核酸產(chǎn)物，包括 t腿，micro腿或s腿等。
第二步，保護(hù)雜交待檢測(cè)的菌體或組織樣品在緩沖液中經(jīng)破碎后，用設(shè) 計(jì)的探針進(jìn)行雜交，同時(shí)保護(hù)待檢測(cè)的mRNA部分片段。
所述的待檢測(cè)的菌體或組織樣品包括細(xì)菌、真菌、植物組織、動(dòng)物組織等。
所述的緩沖液包括各種雜交緩沖液。
第三步，用Sl和RNAse酶切除去單鏈DNA、未保護(hù)的RNA、過(guò)量的探針、 錯(cuò)配的雜交體，留下完全配對(duì)的，帶生物素標(biāo)記的探針和mRNA雜交體。
第四步，用鏈親和素包被的磁珠富集帶生物素標(biāo)記的探針和mRNA雜交體， 同時(shí)去除各種細(xì)胞碎片、蛋白等雜質(zhì)。
所述的鏈親和素包被的磁珠是指用鏈親和素經(jīng)物化處理包被的磁性材料， 包括納米磁性材料。
第五步，用雙鏈結(jié)合染料直接定量mRNA。
所述的雙鏈結(jié)合染料包括各種能與RNA/RNA， DNA/RNA雜交體結(jié)合或附著的 染料。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1)可以迅速直接地監(jiān)測(cè)的mRNA 水平的變化，不需要進(jìn)行RNA抽提；2)結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)性好。避免了 RNA 降解，非線性反轉(zhuǎn)錄，非線性PCR擴(kuò)增帶來(lái)的偏差。3)方法簡(jiǎn)單，易于自動(dòng)化。
本發(fā)明實(shí)施例所使用的熒光假單胞菌M18，已在中國(guó)專利局指定的保藏單 位北京，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)CGMCC NO. 0462，保藏時(shí)間2000.6.27。


圖l為本發(fā)明方法的流程圖。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提 下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍
不限于下述的實(shí)施例。
如以下實(shí)施例按照如圖1所示的流程進(jìn)行實(shí)施。 實(shí)施例1 定量phzC基因的mRNA水平
第一步，根據(jù)GenBank中phzC基因序列(EF491207)， 用Oligo 6. 0設(shè)計(jì) 特異性DNA探針。探針序列為5， -biotin- GACAGCTCGTAGTCGAGCAGCAG CATCTCGTGGCTGGTCCAGACCGGCGAGGCATTCGC 。5' 端用生物素標(biāo)記。利用 Pseudomonas aeruginosa PAOl (AE004091)的基因組序列進(jìn)行BLAST分析其特 異性。
第二步，lmL King' s B培養(yǎng)基液體培養(yǎng)的熒光假單胞菌M18發(fā)酵液經(jīng)8， 000 rpm離心收集菌體。用液氮凍存于-70。 C冰箱。為了避免RNA降解，凍存 菌體需盡快使用。2 mL雜交緩沖液(1XSSC: 4.385 g/L NaCl ， 2.205 g/L trisodium citrate dehydrate, pH 7. 2)和20 ML 2 MM的設(shè)計(jì)探針同時(shí)添加 到凍存的菌體(探針需在菌體化凍之前加入以保護(hù)檢測(cè)mRNA不被RNAse降解)。 在冰浴中用超聲細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行菌體細(xì)胞破碎。94 ° C變性10min后，32 ° C 溫育2小時(shí)。
第三步，加入1000US1酶(Promega， USA) ， lOPgRNase酶(上海生工) 和1 mL SI酶緩沖液。42 ° C溫育4小時(shí)。酶和酶緩沖液加入量可調(diào)整，酶加 入量多，酶解時(shí)間可縮短，酶加入量少，酶解時(shí)間需延長(zhǎng)。
第四步，所有溶液轉(zhuǎn)入裝有鏈親和素包被的磁珠(Promega， USA)(使用 前用lmL 1XSSC清洗三次)的離心管中。若溶液體積大于離心管體積，可分次 加入。輕輕混勻10分鐘后，利用磁鐵，用IXSSC清洗磁珠三次。
第五步，最后用94叱IX SSC重懸磁珠，加入6 SYBR Green I (捷 瑞生物工程(上海)有限公司)，用熒光測(cè)定儀(Fluoroskan Ascent FL， Thermo Fisher Scientific Inc. USA)，在485 nm和527 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行熒光強(qiáng)度定 量。測(cè)定結(jié)果為1. 115。因?yàn)橐粋€(gè)鏈親和素分子可高度親和結(jié)合4個(gè)生物素分子， 若需提高測(cè)定值，可增加檢測(cè)樣品量，不過(guò)酶解時(shí)間需延長(zhǎng)。
實(shí)施例2 定量gacA基因的mRNA水平
第一步，根據(jù)GenBank中g(shù)acA基因序列(NC—002516)， 用Oligo 6. 0設(shè)
計(jì)特異性DNA探針。探針序列為5， -biotin-AGTTCCAGCACCATCAGTGGCAGACGC TTCTCCTAGGCAAGGGGTGGGCGGAGTACGTC。 5 ， 端用生物素標(biāo)記。利用Pseudomonas aeruginosa PAOl (AE004091)的基因組序列進(jìn)行BLAST分析其特異性。
第二步，lmL King' s B培養(yǎng)基液體培養(yǎng)的熒光假單胞菌M18發(fā)酵液經(jīng)8， 000 rpm離心收集菌體。用液氮凍存于-70。 C冰箱。為了避免RNA降解，凍存 菌體需盡快使用。2 mL雜交緩沖液(1XSSC: 4.385 g/L NaCl， 2.205 g/L trisodium citrate dehydrate, pH 7. 2)和20 ML 2幽的設(shè)計(jì)探針同時(shí)添加 到凍存的菌體(探針需在菌體化凍之前加入以保護(hù)檢測(cè)mRNA不被RNAse降解)。 在冰浴中用超聲細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行菌體細(xì)胞破碎。94° C變性10min后，32° C 溫育2小時(shí)。
第三步，加入1000US1酶(Promega， USA) ， 10 Pg RNase酶(上海生工) 和1 mL Sl酶緩沖液。42 ° C溫育4小時(shí)。酶和酶緩沖液加入量可調(diào)整，酶加 入量多，酶解時(shí)間可縮短，酶加入量少，酶解時(shí)間需延長(zhǎng)。
第四步，所有溶液轉(zhuǎn)入裝有鏈親和素包被的磁珠(Promega， USA)(使用 前用lmL 1XSSC清洗三次)的離心管中。若溶液體積大于離心管體積，可分次 加入。輕輕混勻10分鐘后，利用磁鐵，用1XSSC清洗磁珠三次。
第五步，最后用94叱IX SSC重懸磁珠，加入6 uL SYBR Green I (捷 瑞生物工程(上海)有限公司)，用熒光測(cè)定儀(Fluoroskan Ascent FL， Thermo Fisher Scientific Inc. USA)，在485 nm和527 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行熒光強(qiáng)度定 量。測(cè)定結(jié)果為0. 823。因?yàn)橐粋€(gè)鏈親和素分子可髙度親和結(jié)合4個(gè)生物素分子， 若需提高測(cè)定值，可增加檢測(cè)樣品量，不過(guò)酶解時(shí)間需延長(zhǎng)。
實(shí)施例3 定量rsmX基因的mRNA水平
第一步，根據(jù)GenBank中rsmX基因序列(DQ137846)， 用Oligo 6. 0設(shè)計(jì) 特異性DNA探針。探針序列為5， -biotin- GATCAGGGAAGGTCGACCATTAGCAC GGATGCTGCAGACAGGMGTCATGATGGTCTTG 。5，端用生物素標(biāo)記。 利用 Pseudomonas aeruginosa PA01 (AE004091)的基因組序列進(jìn)行BLAST分析其特 異性。
第二步，lmL King' s B培養(yǎng)基液體培養(yǎng)的熒光假單胞菌M18發(fā)酵液經(jīng)8，
000 rpm離心收集菌體。用液氮凍存于-70° C冰箱。為了避免RNA降解,凍存 菌體需盡快使用。2 mL雜交緩沖液(1XSSC: 4.385 g/L NaCl， 2.205 g/L trisodium citrate dehydrate, pH 7. 2)和20 ML 2 MM的設(shè)計(jì)探針同時(shí)添加 到凍存的菌體(探針需在菌體化凍之前加入以保護(hù)檢測(cè)mRNA不被RNAse降解)。 在冰浴中用超聲細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行菌體細(xì)胞破碎。94° C變性10min后，32° C 溫育2小時(shí)。
第三步，加入1000US1酶(Promega， USA) ， 10PgRNase酶(上海生工) 和1 mL Sl酶緩沖液。42 ° C溫育4小時(shí)。酶和酶緩沖液加入量可調(diào)整，酶加 入量多，酶解時(shí)間可縮短，酶加入量少，酶解時(shí)間需延長(zhǎng)。
第四步，所有溶液轉(zhuǎn)入裝有鏈親和素包被的磁珠(Promega， USA)(使用 前用lmL 1XSSC清洗三次)的離心管中。若溶液體積大于離心管體積，可分次 加入。輕輕混勻10分鐘后，利用磁鐵，用1XSSC清洗磁珠三次。
第五步，最后用94叱IX SSC重懸磁珠，加入6 u L SYBR Green I (捷 瑞生物工程(上海)有限公司)，用熒光測(cè)定儀(Fluoroskan Ascent FL， Thermo Fisher Scientific Inc. USA),在485 nm和527 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行熒光強(qiáng)度定 量。測(cè)定結(jié)果為1. 079。因?yàn)橐粋€(gè)鏈親和素分子可高度親和結(jié)合4個(gè)生物素分子， 若需提高測(cè)定值，可增加檢測(cè)樣品量，不過(guò)酶解時(shí)間需延長(zhǎng)。
實(shí)施例4定量qscR基因的mRNA水平
第一步，根據(jù)GenBank中qscR基因序列(AF516903)， 用Oligo 6. 0設(shè)計(jì) 特異性 DNA 探針。探針序列為 5' -biotin-MTGGCGMGACTTCCAGGAGMCCGTTTCTTCTGGGAGGMGCGCTGCATCACGGCAT。 5' 端用 生物素標(biāo)記。利用Pseudomonas aeruginosa PA01 (AE004091)的基因組序列 進(jìn)行BLAST分析其特異性。
第二步，lmL King' s B培養(yǎng)基液體培養(yǎng)的熒光假單胞菌M18發(fā)酵液經(jīng)8， 000 rpm離心收集菌體。用液氮凍存于-70。 C冰箱。為了避免RNA降解，凍存 菌體需盡快使用。2 mL雜交緩沖液(IXSSC: 4.385 g/L NaCl， 2.205 g/L trisodium citrate dehydrate, pH 7. 2)和20 ML 2 MM的設(shè)計(jì)探針同時(shí)添加 到凍存的菌體(探針需在菌體化凍之前加入以保護(hù)檢測(cè)mRNA不被RNAse降解)。
在冰浴中用超聲細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行菌體細(xì)胞破碎。94° C變性10min后，32° C 溫育2小時(shí)。
第三步，加入1000US1酶(Promega， USA) ， lO^gRNase酶(上海生工) 和1 mL Sl酶緩沖液。42 ° C溫育4小時(shí)。酶和酶緩沖液加入量可調(diào)整，酶加 入量多，酶解時(shí)間可縮短，酶加入量少，酶解時(shí)間需延長(zhǎng)。
第四步，所有溶液轉(zhuǎn)入裝有鏈親和素包被的磁珠(Promega， USA)(使用 前用lmL 1XSSC清洗三次)的離心管中。若溶液體積大于離心管體積，可分次 加入。輕輕混勻10分鐘后，利用磁鐵，用1XSSC清洗磁珠三次。
第五步，最后用94 ^ IX SSC重懸磁珠，加入6 u L SYBR Green I (捷 瑞生物工程(上海)有限公司)，用熒光測(cè)定儀(Fluoroskan Ascent FL， Thermo Fisher Scientific Inc. USA),在485 nm和527 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行熒光強(qiáng)度定 量。測(cè)定結(jié)果為0. 952。因?yàn)橐粋€(gè)鏈親和素分子可高度親和結(jié)合4個(gè)生物素分子， 若需提高測(cè)定值，可增加檢測(cè)樣品量，不過(guò)酶解時(shí)間需延長(zhǎng)。
實(shí)施例5定量rsmA基因的mRNA水平
第一步，根據(jù)GenBank中rsmA基因序列(AY730556)， 用Oligo 6. 0設(shè)計(jì) 特異性 DNA 探針。探針序列為 5' -biotin-AGACCCTGATGGTAGGTGACGACGTCACCGTGACGGTACTGGGTGTCAAAGGGMCCAG。 5' 端用 生物素標(biāo)記。利用Pseudomonas aeruginosa PA01 (AE004091)的基因組序列 進(jìn)行BLAST分析其特異性。
第二步，lmL King' s B培養(yǎng)基液體培養(yǎng)的熒光假單胞菌M18發(fā)酵液經(jīng)8， 000 rpm離心收集菌體。用液氮凍存于-70° C冰箱。為了避免RNA降解，凍存 菌體需盡快使用。2 mL雜交緩沖液(IXSSC: 4.385 g/L NaCl ， 2.205 g/L trisodium citrate dehydrate, pH 7. 2)和20叱2 HM的設(shè)計(jì)探針同時(shí)添力卩 到凍存的菌體(探針需在菌體化凍之前加入以保護(hù)檢測(cè)mRNA不被RNAse降解)。 在冰浴中用超聲細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行菌體細(xì)胞破碎。94° C變性10min后，32° C 溫育2小時(shí)。
第三步，加入1000US1酶(Promega, USA) ， 10 RNase酶(上海生工) 和1 mL SI酶緩沖液。42 ° C溫育4小時(shí)。酶和酶緩沖液加入量可調(diào)整，酶加
入量多，酶解時(shí)間可縮短，酶加入量少，酶解時(shí)間需延長(zhǎng)。
第四步，所有溶液轉(zhuǎn)入裝有鏈親和素包被的磁珠(Promega， USA)(使用 前用lmL 1XSSC清洗三次)的離心管中。若溶液體積大于離心管體積，可分次 加入。輕輕混勻10分鐘后，利用磁鐵，用1XSSC清洗磁珠三次。
第五步，最后用94叱IX SSC重懸磁珠，加入6 uL SYBR Green I (捷 瑞生物工程(上海)有限公司)，用熒光測(cè)定儀(Fluoroskan Ascent FL， Thermo Fisher Scientific Inc. USA),在485 nm和527 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行熒光強(qiáng)度定 量。測(cè)定結(jié)果為2.385。
由上述實(shí)施例可以看出，本發(fā)明的實(shí)施不需要進(jìn)行RNA抽提，快速簡(jiǎn)便， 易于自動(dòng)化，特異性強(qiáng)，在常規(guī)的實(shí)驗(yàn)條件下即可完成對(duì)RNA的定量檢測(cè)，而 且避免了RNA降解，非線性反轉(zhuǎn)錄，非線性PCR擴(kuò)增帶來(lái)的偏差。
權(quán)利要求
1. 一種直接的mRNA富集定量方法，其特征在于，包括如下步驟第一步，探針設(shè)計(jì)利用待檢測(cè)的mRNA序列設(shè)計(jì)和合成互補(bǔ)的DNA或RNA探針，5’端或3’端用生物素標(biāo)記；第二步，保護(hù)雜交待檢測(cè)的菌體或組織樣品在緩沖液中經(jīng)破碎后，用設(shè)計(jì)的探針進(jìn)行雜交，同時(shí)保護(hù)待檢測(cè)的mRNA部分片段；第三步，用S1和RNAse酶切除去單鏈DNA、未保護(hù)的RNA、過(guò)量的探針、錯(cuò)配的雜交體，留下完全配對(duì)的，帶生物素標(biāo)記的探針和mRNA雜交體；第四步，用鏈親和素包被的磁珠富集帶生物素標(biāo)記的探針和mRNA雜交體，同時(shí)去除各種細(xì)胞碎片、蛋白雜質(zhì)；第五步，用雙鏈結(jié)合染料直接定量mRNA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的直接的mRNA富集定量方法，其特征是，所述的 待檢測(cè)的mRNA包括各種生物體基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的核酸產(chǎn)物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的直接的mRNA富集定量方法，其特征是，所述的 待檢測(cè)的菌體或組織樣品包括細(xì)菌、真菌、植物組織、動(dòng)物組織。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的直接的mRNA富集定量方法，其特征是，所述的 緩沖液包括各種雜交緩沖液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的直接的mRNA富集定量方法，其特征是，所述的 鏈親和素包被的磁珠是指用鏈親和素經(jīng)物化處理包被的磁性材料，包括納米磁 性材料。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的直接的mRNA富集定量方法，其特征是，所述的 雙鏈結(jié)合染料包括各種能與RNA/RNA， DNA/RNA雜交體結(jié)合或附著的染料。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的直接的mRNA富集定量方法，不需要進(jìn)行RNA抽提，在待檢測(cè)的菌體或組織破碎后，利用特異性的核酸探針液相雜交保護(hù)特異性的mRNA部分片段后，用S1和RNAse酶切除去單鏈DNA，未保護(hù)的RNA，過(guò)量的探針和錯(cuò)配的雜交體，完全配對(duì)的mRNA片段經(jīng)生物素-鏈親和素交互作用被磁珠富集后，用雙鏈結(jié)合染料直接線性放大定量。本發(fā)明不需要進(jìn)行RNA抽提，快速簡(jiǎn)便，易于自動(dòng)化，特異性強(qiáng)，在常規(guī)的實(shí)驗(yàn)條件下即可完成對(duì)RNA的定量檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101392295SQ20081020230
公開(kāi)日2009年3月25日 申請(qǐng)日期2008年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日
發(fā)明者任慧娟, 朱紅亮, 李榮秀, 董德賢, 許煜泉 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)