專利名稱：環(huán)介導恒溫擴增檢測米氏凱倫藻的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及赤潮生物米氏凱倫藻的檢測。
背景技術：
米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)能產生溶血性(hemolytic)毒素和魚毒 (ichthyotoxins)，能夠溶解魚類細胞，破壞魚鰓組織結構，使魚類無法正常呼吸而窒息死 亡。由米氏凱倫藻引起的赤潮在墨西哥灣、新西蘭、韓國、蘇格蘭、澳大利亞、日本海域都有 發(fā)生，2002-2005年在中國福建浙江沿海引發(fā)多次赤嘲，對漁業(yè)造成巨大經濟損失，研究米 氏凱倫藻赤潮，進行赤潮的預測預報，對于減少水產養(yǎng)殖業(yè)損失，保護海洋生態(tài)環(huán)境，有著 重要的實際意義。 對赤潮進行預測首要問題是對引起赤潮的藻類進行檢測，傳統(tǒng)的藻類鑒定是通過 形態(tài)學的觀察來劃分的，從色素，色素體，貯藏物質等的差別來辨別不同種的藻類細胞，這 是一件費時費力的事，而且不同的種屬差別很細微，非長期從事該工作的專業(yè)人員難以勝 任這項工作，并且環(huán)境對藻類的形態(tài)有很大的影響，鑒定到種存在的困難較多。
目前，利用分子生物學手段檢測微藻的方法日漸成熟，這些方法從分子水平解 決了某些從形態(tài)上難以區(qū)分的藻類分類和鑒定問題。自從聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)發(fā)明以來，這種技術就被應用到諸多領域。許多學者通過微藻某些基 因片段擴增能夠對藻類進行鑒定，例如通過對核糖體rDNA序列分析，核糖體間隔區(qū)(ITS) 的PCR擴增和測序，從而完成對微藻類的種類鑒定，然而這種方法對儀器要求較高，而且所 需時間長，一個檢測反應需要3小時左右。熒光原位雜交也是近年來微藻鑒定的檢測手段， 有學者利用核糖體大亞基(LSU)分子探針對墨西哥灣短凱倫藻進行了鑒定，但是這種技術 實驗材料費用較高。實時熒光定量PCR檢測也是近年來微藻檢測一個方向，這種方法非常
靈敏，所需時間也不長(大約一個多小時)，但是所需的實驗儀器(熒光定量PCR儀)價格
曰蟲 卬貝0 2000年，日本學者Notomi等開發(fā)了一種恒溫核酸擴增方法，即環(huán)介導等溫擴增反 應(Loop-mediated isothermal amplif icatiom， LAMP)，其特點是針對耙基因的6個區(qū)域 設計4種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件下保溫幾 十分鐘，即可完成核酸擴增反應。此反應不需要模板的熱變性、長時間溫度循環(huán)、繁瑣的電 泳、紫外觀察等過程，而且結果判定簡單，既可以利用儀器檢測或肉眼觀察核酸擴增過程中 產生的焦磷酸鎂沉淀判定，也可以采用肉眼觀察反應液的顏色變化來迅速判定。與以上的 檢測方法相比，LAMP雖然需要引物多，實驗條件需要摸索，但只要在優(yōu)化好實驗條件的前提 下，因其操作簡單快速、對儀器要求不高、特異性強、擴增效率高、結果判定簡單等優(yōu)點適合 快速鑒定和現場檢測。這種技術已廣泛應用到病原菌檢測方面，取得理想的檢測效果。

發(fā)明內容
本發(fā)明需要解決的技術問題是提供一種針對赤潮生物米氏凱倫藻的檢測方法。
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本發(fā)明的技術方案首先提取微藻基因組DNA，以其為模板進行PCR擴增，PCR擴增
后對產物進行測序，其特征是針對米氏凱倫藻核糖體間隔區(qū)的6個區(qū)域設計4條特異性引
物，根據LAMP產物產生白色焦磷酸鎂沉淀或根據LAMP產物與SYBR Green I反應呈現綠色
判斷為米氏凱倫藻，所述的4條特異性引物序列如下 弓|物Primer 序列Sequence(5， _3，)F3 CTGTCATCTTGTCATGTGC ;B3 CTAACTTCATGTCATGGAAGG ;FIP(Flc+F2) TTCAATGCATCAGGGGCAGG-GCAACTGACAGCAGTGTG ;BIP(Blc+B2) ACACCTTGTGCTTTGTGTGT-TGAAGTGGCAGACAGGAG ; 2個內引物FIP和BIP的濃度均為1.6iiM，兩個外引物F3和B3的濃度均為
0. 2線MgS04濃度為6mM， dNTP濃度為0. 6mM， Betaine濃度為0. 6M，反應溫度為63°C ，反
應時間60min。 本發(fā)明針對米氏凱倫藻核糖體間隔區(qū)的6個區(qū)域設計了 4條特異性引物，利用這 組引物成功檢測到米氏凱倫藻基因組，對米氏凱倫藻進行了 LAMP擴增，得到了擴增產物， 同時以其他8種藻類(環(huán)狀異帽藻、微小亞歷山大藻、塔瑪亞歷山大藻、鏈狀亞歷山大藻、利 瑪原甲藻、卡氏前溝藻、角毛藻、赤潮異灣藻)為陰性對照實驗，只有米氏凱倫藻為特異擴 增，其他藻類呈現陰性反應。另外，對擴增終產物進一步進行酶切分析，并與以外引物F3和 B3為引物PCR擴增的片段相比較，均與預期結果相吻合，說明所設計引物為米氏凱倫藻的 特異性引物。本發(fā)明采用2種判斷方法，一種是根據有無LAMP產物產生的白色焦磷酸鎂沉 淀，另一種是LAMP產物與SYBR Green I反應是否呈現綠色，判斷簡單快速，可應用到現場 檢測，在赤潮的預測預報中發(fā)揮作用。


附圖表示的是LAMP引物設計示意圖(箭頭方向指示的是引物延伸方向，方框內的 序列是HcoI酶識別位點)。
具體實施例方式
首先提取微藻基因組DNA，以其為模板進行PCR擴增，以核糖體DNA轉錄單元 內間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer, ITS)為目標基因序列，擴增引物為LH2 : 5' AGGTGAACCTGCGGAAGGATC 3'和D1am : 5' CCTGCAGTCGACA (TG)ATGCTTAA(AG)TTCAGC(AG) GG 3'。 PCR擴增后對產物進行測序，對測定序列進行Blast分析，利用CLUSTAL X軟件 與其他藻類的相應序列進行比對后，找到轉錄單元內間隔區(qū)ITS1和ITS2，分別以ITS1 和ITS2區(qū)為耙序列設計引物，由在線軟件PrimerExplorerV4(http:〃primerexplorer. jp/el卿4. 0. 0/index. html)設計引物(見附圖)。反應體系為25uL，包括2. 5uL 10 Xbuffer (內含2mM of MgS04)，內引物FIP和BIP的濃度均為1. 6 ii M，夕卜弓l物F3禾口 B3 的濃度均為0. 2 ii M， 6mM MgS04， 0. 6mM dNTP， 0. 6M Betaine (Sigma—Alodrich)，反應 益度為 63"C，反應時間60min。
LAMP產物特異性驗證 可用2種方法檢測擴增片段的特異性，(1)利用米氏凱倫藻的1對外引物F3和B3進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳后觀察，擴增產物條帶在DNA分子量標準的250bp處，與 預期249bp片段相符；(2)利用Ncol限制性內切酶酶切LAMP產物，酶切反應溫度37"C，溫 浴過夜，電泳后酶切片段為2條帶，位于DNA分子量標準的lOObp和200bp之間，與預期得 到137bp和112bp兩條帶相符。
LAMP產物檢測方法 反應后的LAMP產物，取2uL于1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)觀察， 可見梯狀條帶出現；由于LAMP反應產生白色焦磷酸鎂沉淀，可肉眼直接觀察，在本方法中 陽性反應管內可見到大量白色沉淀產生；加100XSYBR Green I 2 y L于反應管中，陽性反
應管呈現綠色，而陰性反應管內顏色不變。
陰性對照實驗 本發(fā)明以環(huán)狀異巾冒藻(Heterocapsa circularisquama)，赤潮異灣 藻(Heterosigma akahiwo)， 卡氏前溝藻(Amphidinium carterae)，禾U瑪原甲藻 (Prorocentrum lima)，角毛藻(Chaetocerossp)，微小亞歷山大藻(Alexandrium mi皿tum)，鏈狀亞歷山大藻(Alexandriumcatenella)，塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)的基因組DNA為模板進行陰性對照實驗，經瓊脂糖凝膠電泳可見米氏凱倫藻呈 現梯狀條帶，其他微藻沒有擴增條帶。
權利要求
環(huán)介導恒溫擴增檢測米氏凱倫藻的方法，首先提取微藻基因組DNA，以其為模板進行PCR擴增，PCR擴增后對產物進行測序并比對，其特征是針對米氏凱倫藻核糖體間隔區(qū)的6個區(qū)域設計4條特異性引物，根據LAMP產物產生白色焦磷酸鎂沉淀或LAMP產物與SYBRGreen I反應呈現綠色判斷為米氏凱倫藻，所述的4條特異性引物序列如下引物Primer序列Sequence(5’-3’)F3CTGTCATCTTGTCATGTGC；B3CTAACTTCATGTCATGGAAGG；FIP(F1c+F2) TTCAATGCATCAGGGGCAGG-GCAACTGACAGCAGTGTG；BIP(B1c+B2) ACACCTTGTGCTTTGTGTGT-TGAAGTGGCAGACAGGAG；內引物FIP和BIP的濃度均為1.6μM，外引物F3和B3的濃度均為0.2μM，6mM MgSO4，0.6mM dNTP，0.6M Betaine，反應溫度為63℃，反應時間60min。
全文摘要
環(huán)介導恒溫擴增檢測米氏凱倫藻的方法，涉及米氏凱倫藻檢測，本發(fā)明取微藻DNA進行PCR擴增，測序，其目的是對米氏凱倫藻設計4條特異性引物，4條引物序列如下引物Primer 序列Sequence(5’-3’)F3 CTGTCATCTTGTCATGTGC；B3 CTAACTTCATGTCATGGAAGG；FIP(Flc+F2) TTCAATGCATCAGGGGCAGG-GCAACTGACAGCAGTGTG；BIP(Blc+B2) ACACCTTGTGCTTTGTGTGT-TGAAGTGGCAGACAGGAG。
文檔編號C12Q1/68GK101736079SQ20081020251
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月10日 優(yōu)先權日2008年11月10日
發(fā)明者張鳳英, 徐兆禮, 馬凌波 申請人:中國水產科學研究院東海水產研究所