專(zhuān)利名稱(chēng)：一種重組表達(dá)可溶性轉(zhuǎn)錄中介體復(fù)合物Med23亞基的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種重組表達(dá)可溶性轉(zhuǎn)錄中介 體復(fù)合物Med23亞基的方法。
背景技術(shù)：
哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄中介體復(fù)合物(Mediator Complex)由30多個(gè)亞基組成，是介于轉(zhuǎn) 錄因子與RNA聚合酶II(Pol II)之間傳遞信息的橋梁。不同的轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與Mediator 的特定亞基相互作用從而調(diào)控基因的表達(dá)。Med23是其中一個(gè)重要亞基，因此對(duì)于Med23的 功能研究是非常重要的。然而Med23的重組表達(dá)非常困難，而從天然來(lái)源中分離蛋白不僅 規(guī)模小，獲得的蛋白量也非常有限，大大限制了其研究和應(yīng)用。 在以往的重組表達(dá)研究中，用一般的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)以及昆蟲(chóng)病毒表達(dá)系統(tǒng)均 難以得到可溶性的Med23蛋白，并且通常原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的蛋白往往缺乏較好的空間構(gòu) 象和基本的糖基化修飾，與天然蛋白相差甚遠(yuǎn)。 因此，本領(lǐng)域有必要進(jìn)行進(jìn)一步的研究，找到表達(dá)可溶性的Med23蛋白的新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可溶性表達(dá)轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供可用于可溶性表達(dá)轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23的一 種重組昆蟲(chóng)桿狀病毒。 在本發(fā)明的第一方面，提供一種表達(dá)可溶性轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23(Flag-轉(zhuǎn) 錄中介體蛋白亞基Med23)的方法，所述方法包括 (1)提供一重組昆蟲(chóng)桿狀病毒，所述的桿狀病毒的基因組中含有一重組表達(dá)盒，所 述的重組表達(dá)盒含有(5' —3' ) :Flag蛋白的編碼序列，轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23編碼 序列； (2)將(1)所述的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，培養(yǎng)感染后的昆蟲(chóng)細(xì)胞，使之 表達(dá)Flag-轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23 ;禾口 (3)分離獲得可溶性Flag-轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23。
在另一優(yōu)選例中，所述的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒如下制備 (A)將Flag蛋白的編碼序列和轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23編碼序列(符合讀框順 序)克隆入桿粒中，獲得重組的桿粒； (B)將(A)獲得的重組的桿粒轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的昆蟲(chóng)細(xì)胞；禾口
(C)收獲重組的桿狀病毒。 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的桿粒為Bacmid桿粒。更優(yōu)選的，所述的Bacmid 來(lái)源于大腸桿菌DH10Bac。 在另一優(yōu)選例中，在步驟(A)中，F(xiàn)lag蛋白的編碼序列和轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基 Med23編碼序列在轉(zhuǎn)座酶的作用下重組入Bacmid桿粒中mini-attTn7位點(diǎn)。更優(yōu)選的，所述的轉(zhuǎn)座酶由大腸桿菌DH10Bac中攜帶的輔助質(zhì)粒(helper)所表達(dá)。 在另一優(yōu)選例中，在步驟(A)中，所述重組的桿粒通過(guò)以下步驟獲得 (a)將Flag蛋白的編碼序列和轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23編碼序列插入穿梭載
體(優(yōu)選的為pFASTBac-HTc載體)的多克隆位點(diǎn)中，獲得插入了 Flag蛋白的編碼序列和
轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23編碼序列的重組載體； (b)將(a)獲得的重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞DHlOBac，獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述轉(zhuǎn) 化的宿主細(xì)胞中含有重組桿粒，所述重組桿粒攜帶Flag蛋白的編碼序列和轉(zhuǎn)錄中介體蛋 白亞基Med23編碼序列；禾口 (c)從所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中提取重組桿粒。 在另一優(yōu)選例中，在步驟(1)中，所述的重組表達(dá)盒中，在Flag蛋白的編碼序列的 5'端，還含有一 His純化標(biāo)簽(優(yōu)選為6XHis標(biāo)簽)編碼序列。 在另一優(yōu)選例中，在步驟(3)中，采用Ni-NTA柱純化Flag-轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基 Med23，獲得第一純化產(chǎn)物。 在另一優(yōu)選例中，還包括對(duì)第一純化產(chǎn)物進(jìn)一步采用帶有抗Flag蛋白的抗體的 瓊脂糖柱純化，獲得第二純化產(chǎn)物，即為純化的Flag-轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23 (純度高 于90% )。 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括(4)將Flag-轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23中 Flag切割去除，獲得轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23。
在另一優(yōu)選例中，所述的昆蟲(chóng)細(xì)胞是Hi5細(xì)胞。 在本發(fā)明的第二方面，提供一種重組昆蟲(chóng)桿狀病毒，所述的桿狀病毒的基因組中 含有一重組表達(dá)盒，所述的重組表達(dá)盒含有(5' — 3' ) :Flag蛋白的編碼序列，轉(zhuǎn)錄中介體 蛋白亞基Med23編碼序列。 在另一優(yōu)選例中，在Flag蛋白的編碼序列的5'端，還含有一 His純化標(biāo)簽編碼序 列。 在另一優(yōu)選例中，所述的重組表達(dá)盒中，5'端還包含一可操作性相連的啟動(dòng)子；3' 端還包含以可操作性相連的終止子。 在另一優(yōu)選例中，所述的桿狀病毒的基因組含有Bacmid DNA，所述BacmidDNA中 含有所述重組表達(dá)盒， 在本發(fā)明的第三方面，提供所述的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒的用途，用于制備可溶性轉(zhuǎn) 錄中介體蛋白亞基Med23。 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。


圖1.表達(dá)純化鑒定Mediator復(fù)合物亞基Med23。 a) —步純化后SDS PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色。同樣的樣品用Med23的抗體做免 疫印跡。 b)兩步純化后銀染示意圖，從箭頭處割膠做質(zhì)譜鑒定。 圖2. GST沉降檢測(cè)重組蛋白的活性，用Hela細(xì)胞核抽提物(a)和一步純化的
4His-flag-Med23 (b)分別和GST-E1A和GST-E1A (H160Y)孵育，WB檢測(cè)發(fā)生沉降的Med23。
圖3.重組表達(dá)的Med23-NTA親和柱沉降可溶的GST-E1A (a)和GST-Elkl (b)。
圖4.用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)His-Flag-Med23的電泳鑒定，可見(jiàn)誘導(dǎo)前后均沒(méi) 有Med23可溶性表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)采用昆蟲(chóng)桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞來(lái) 表達(dá)轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23，并且在轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23編碼序列的5'端加 上一 Flag標(biāo)簽編碼序列，可表達(dá)獲得可溶性的Med23蛋白，該蛋白保留了良好的功能活性 (也即接近于天然的Med23蛋白)。本發(fā)明第一次表達(dá)出了可溶性的Med23蛋白，有效地解 決了現(xiàn)有技術(shù)中難以可溶性表達(dá)Med23蛋白的技術(shù)難題。
轉(zhuǎn)錄中介體復(fù)合物Med23亞基 如本文所用，"轉(zhuǎn)錄中介體復(fù)合物(Mediator Complex)Med23亞基"，"轉(zhuǎn)錄中介體 蛋白亞基Med23"，"Med23蛋白"可互換使用。由于Flag是一段較短的肽，其除了有助于 Med23蛋白的可溶性表達(dá)外，對(duì)于Med23蛋白的功能活性沒(méi)有影響，因此在本發(fā)明的有些部 分中，所述的Med23蛋白也指一種包含了Flag序列的融合蛋白，稱(chēng)為"Flag-轉(zhuǎn)錄中介體蛋 白亞基Med23"或"Flag-Med23"。 哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄中介體復(fù)合物由30多個(gè)亞基組成。Med23蛋白是哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄中介 體復(fù)合物中一種重要的亞基。Med23蛋白是介于轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶II(Poin)之間傳 遞信息的橋梁。 所述的Med23蛋白可以來(lái)源于各種哺乳動(dòng)物，它們具有很高的同源性。作為本發(fā) 明的優(yōu)選方式，所述的Med23蛋白是人源的Med23蛋白。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的Med23蛋白的氨基酸序列可以與GenBank登錄號(hào) 為AAD31729. 1提供的序列基本上相同。所述的Med23基因的核苷酸序列可以與GenBank 登錄號(hào)為AF105332提供的序列的序列基本上相同。
Flag標(biāo)簽 如本文所用，所述的"Flag標(biāo)簽"，"Flag-tag", "Flag蛋白"可互換使用，均是指氨 基酸序列如"DYKDDDDK"的蛋白。 本發(fā)明人在研究中意外發(fā)現(xiàn)，所述的Flag標(biāo)簽有助于Med23蛋白在病毒體系中的 可溶性表達(dá)。 此外，所述的Flag標(biāo)簽對(duì)于Med23蛋白的下游純化也是非常有用的。例如可以采 用抗-Flag抗體來(lái)純化Flag-Med23，所述的抗-Flag抗體是商業(yè)化的，易于獲得。
重組昆蟲(chóng)桿狀病毒 本發(fā)明提供了一種重組的昆蟲(chóng)桿狀病毒，其可用于感染昆蟲(chóng)細(xì)胞而獲得重組 Med23蛋白(Flag-Med23蛋白)。所述的桿狀病毒的基因組中含有一重組表達(dá)盒，所述的重 組表達(dá)盒含有(5' —3' ) :Flag蛋白的編碼序列，轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23編碼序列。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的重組表達(dá)盒中，在Flag蛋白的編碼序列的5'端還 含有一His純化標(biāo)簽(優(yōu)選為6XHis標(biāo)簽)編碼序列。所述的重組表達(dá)盒中，5'端還包含 一可操作性相連的啟動(dòng)子；3'端還包含以可操作性相連的終止子。
本發(fā)明中，所述的Med23蛋白編碼序列、Flag蛋白編碼序列、His標(biāo)簽編碼序列以 及必要的啟動(dòng)子序列、終止子序列等均是操作性相連的。所述的"操作性相連"或"可操作 地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線性DNA序列其 它部分的活性。例如，如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述重組昆蟲(chóng)桿狀病毒通過(guò)以下步驟制備(A)將Flag 蛋白的編碼序列和轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23編碼序列克隆入桿粒中，獲得重組的桿粒； (B)將(A)獲得的重組的桿粒轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的昆蟲(chóng)細(xì)胞；和(C)收獲重組的桿 狀病毒。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的桿粒是Bacmid桿粒。更優(yōu)選的，所述的Bacmid來(lái) 源于大腸桿菌DH10Bac。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的昆蟲(chóng)細(xì)胞選自Hi5昆蟲(chóng)細(xì)胞，sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞， HighFive昆蟲(chóng)細(xì)胞；最優(yōu)選的，所述昆蟲(chóng)細(xì)胞是Hi5昆蟲(chóng)細(xì)胞。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在步驟(A)中，所述重組的桿粒通過(guò)以下步驟獲得(a) 將Flag蛋白的編碼序列和轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23編碼序列插入穿梭載體(優(yōu)選的為 pFASTBac-HTc載體)的多克隆位點(diǎn)中，獲得插入了 Flag蛋白的編碼序列和轉(zhuǎn)錄中介體蛋白 亞基Med23編碼序列的重組載體；(b)將(a)獲得的重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞DH10Bac，獲得 轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中含有重組桿粒，所述重組桿粒攜帶Flag蛋白的編 碼序列和轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23編碼序列；和(c)從所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中提取重組 桿粒。 作為本發(fā)明的更優(yōu)選方式，所述的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒是通過(guò)將目的基因(包括 Flag蛋白的編碼序列和轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23編碼序列)克隆進(jìn)入pFASTBac的多克 隆位點(diǎn)內(nèi)，然后將pFASTBac轉(zhuǎn)化DH10Bac基因工程菌，在轉(zhuǎn)座酶的作用下發(fā)生重組，獲得 桿粒后轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞獲得的。將這種病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞后數(shù)小時(shí)，病毒即可進(jìn)入昆蟲(chóng)細(xì)胞， 開(kāi)始復(fù)制病毒，并且轉(zhuǎn)錄病毒重組區(qū)域中蛋白翻譯區(qū)的核酸序列，在該段序列中含有目的 基因序列。感染約2-4天后表達(dá)具有病毒重組區(qū)域中蛋白翻譯區(qū)所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的蛋 白，該段序列中含有Med23的氨基酸序列。 更優(yōu)選的，所述的蛋白翻譯區(qū)核酸序列的末端還包含編碼純化標(biāo)簽(如Histag) 以及酶切克隆位點(diǎn)的序列，從而便于后續(xù)的克隆以及純化，本領(lǐng)域人員均了解如何在待表 達(dá)的外源基因的兩端設(shè)置純化標(biāo)記以及克隆位點(diǎn)，這種純化標(biāo)記以及克隆位點(diǎn)也可以是表 達(dá)載體自帶的。 本發(fā)明的整合有Med23編碼基因的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒可以穩(wěn)定地傳代，低溫下可 以長(zhǎng)期保存并具有高的滴度。利用該病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞后2-5天可以得到高表達(dá)的Med23 蛋白(Flag-Med23蛋白)。 此外，在所述的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞并表達(dá)Med23蛋白后，還可以通 過(guò)例如密度梯度離心等方法從培養(yǎng)物中回收重組昆蟲(chóng)桿狀病毒，用于下次感染。
表達(dá)和純化可溶性Med23蛋白的方法 本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，采用大腸桿菌(如BL21)原核系統(tǒng)表達(dá)Med23蛋白是無(wú) 法實(shí)現(xiàn)的，Med23蛋白不能很好地溶解；采用真核表達(dá)系統(tǒng)或酵母表達(dá)系統(tǒng)等成本高且也 存在同樣的難溶難題。在經(jīng)過(guò)反復(fù)研究和優(yōu)化后，終于發(fā)現(xiàn)將Med23編碼序列的5'端加上一段Flag標(biāo)簽編碼序列，并采用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)可獲得可溶性的Med23蛋白 (N端帶有一 Flag標(biāo)簽，也稱(chēng)為Flag-Med23蛋白)，且表達(dá)量高，表達(dá)穩(wěn)定，并且蛋白結(jié)構(gòu)、 功能活性均接近于天然蛋白。 因此，本發(fā)明人提供了一種制備可溶性Med23蛋白的方法，該方法包括步驟
(1) 提供一重組昆蟲(chóng)桿狀病毒，所述的桿狀病毒的基因組中含有一重組表達(dá)盒，所述的重 組表達(dá)盒含有(5' —3') :Flag蛋白的編碼序列，轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23編碼序列；
(2) 將(1)所述的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，培養(yǎng)感染后的昆蟲(chóng)細(xì)胞，使之表達(dá) Flag-Med23 ;和(3)分離獲得可溶性Flag-Med23。 在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在Flag-Med23蛋白的氨基端設(shè)置有組氨酸標(biāo)簽(6XHis tag)，以便于蛋白的純化。例如，可以用Ni-NTA柱進(jìn)行純化，用咪唑洗脫獲得目的蛋白。如 果需要，所述的純化標(biāo)簽也可以在純化完成后從蛋白上去除，去除方法是本領(lǐng)域人員熟知 的，例如通過(guò)專(zhuān)一性的蛋白酶實(shí)現(xiàn)切除。對(duì)于某些應(yīng)用，組氨酸標(biāo)簽無(wú)需切除。
在獲得可溶性的Flag-Med23后，如果需要，可以采用本領(lǐng)域已知的方法從純化后 的蛋白上去除Flag，例如通過(guò)專(zhuān)一性的蛋白酶實(shí)現(xiàn)切除。Flag具有內(nèi)在的腸激酶識(shí)別位 點(diǎn)，因此可應(yīng)用腸激酶來(lái)專(zhuān)一性切除Flag。對(duì)于某些應(yīng)用，F(xiàn)lag無(wú)需切除。
可溶性Med23蛋白的應(yīng)用 采用本發(fā)明的方法得到的Med23可溶蛋白可應(yīng)用于藥物的篩選，與其它蛋白相互 作用位點(diǎn)的鑒定，以及對(duì)Med23亞基的結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析?？山Y(jié)合親和柱層析和質(zhì)譜等手段 能發(fā)現(xiàn)新的與靶蛋白相互作用的蛋白質(zhì)。 Med23和Elkl的相互作用偶聯(lián)了脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與基因表 達(dá)網(wǎng)絡(luò)，控制了細(xì)胞的生長(zhǎng)分化，是潛在的藥物靶標(biāo)。為了鑒定Med23和Elkl的相互作用 位點(diǎn)，可以進(jìn)行NMR和Biacore實(shí)驗(yàn)來(lái)分析參與相互作用的殘基，以及進(jìn)行相互作用的動(dòng)力 學(xué)分析。同時(shí)可以用來(lái)進(jìn)行藥物篩選。 可利用所述的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒結(jié)合NTA親和柱，將ES以及Hela細(xì)胞核抽提物 過(guò)柱，跑SDS-PAGE膠分離蛋白，用LTQ儀器質(zhì)譜分析已得到一些有可能與Med23發(fā)生相互 作用的蛋白數(shù)據(jù)。進(jìn)一步的驗(yàn)證正在進(jìn)行中。用該方法能得到一些潛在的可能與Med23有 相互作用的新的核蛋白，為揭示其功能打下了基礎(chǔ)。 可利用所述的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒系統(tǒng)大量表達(dá)純化可溶的Med23亞基，蛋白經(jīng)過(guò)
超濾濃縮等步驟，在合適的條件下得到蛋白質(zhì)晶體，對(duì)晶體進(jìn)行x-射線衍射，從而為詮釋
Med23的結(jié)構(gòu)打下基礎(chǔ)。 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于 (1)首次發(fā)現(xiàn)采用昆蟲(chóng)桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞來(lái)表達(dá)Med23蛋白，并且在Med23編 碼序列的5'端加上一 Flag標(biāo)簽編碼序列，可表達(dá)獲得可溶性的Med23蛋白，其接近于天然 的Med23蛋白，保留了良好的生物活性。 (2)對(duì)于利用桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞來(lái)表達(dá)Med23蛋白的工藝及其純化工藝進(jìn)行 了優(yōu)化，從而可穩(wěn)定且大量地獲得Med23蛋白。 (3)本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)解決了現(xiàn)有技術(shù)中難以可溶性表達(dá)Med23蛋白的技術(shù)難
題，第一次重組表達(dá)出可溶性Med23蛋白，為研究Med23的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。 除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。
實(shí)施例1.用重組昆蟲(chóng)桿狀病毒從昆蟲(chóng)細(xì)胞獲得可溶的人轉(zhuǎn)錄中介體復(fù)合物 Med23亞基蛋白
1.重組病毒 以pcDNA3-f lag-med23基因質(zhì)粒(獲自UCLA， Arnold J. Berk實(shí)驗(yàn) 室)為模板，以上游引物5'AACTCGAGATGCCAGACTACAAGGAC 3'和下游引物 5' GGCTCGAGCTTTCACTGAGTTACTGGTA3'為引物PCR擴(kuò)增獲得含有flag-Med23基因序列的擴(kuò) 增產(chǎn)物，直接插入到pMD-18T載體購(gòu)(購(gòu)自Takara)中，用xhol酶切該重組載體，獲得含有 flag-Med23基因序列的產(chǎn)物。 上述獲得的含有flag-Med23基因的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)Xhol酶切后插入載體 pFastBacHTc (Invitrogen)的XhoI位點(diǎn)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac (Invitrogen)，篩 選得到含有Med23-Bacmid DNA的陽(yáng)性菌株。從陽(yáng)性桿粒菌中抽提獲得Med23-Bacmid DNA， 電泳驗(yàn)證獲得所需的DNA。 將上述獲得的Med23-Bacmid DNA轉(zhuǎn)染貼壁培養(yǎng)昆蟲(chóng)細(xì)胞Hi5 (Tn5)(購(gòu)自 Invitrogen) ， 27"C培養(yǎng)72小時(shí)后，獲得Med23-桿狀病毒(Baculovirus)。
2.可溶性6Xhis-flag-Med23(h-f-Med23)蛋白的產(chǎn)生 上述獲得的Med23-Baculovirus感染昆蟲(chóng)細(xì)胞Hi5，感染后27 °C培養(yǎng)72小 時(shí)。離心收集細(xì)胞，用裂解緩沖液(20mM HEPES-K0H pH7. 9 ;0. 1 % Tritonx-100 ; 5mMP -巰基己醇；10mM PMSF)裂解細(xì)胞。15， 000rpm離心30分鐘。取上清細(xì)胞裂解液上 Ni-NTA (Invitrogen)柱純化，250mM咪唑洗脫，收集洗脫液，作SDS-PAGE和Western Blot 分析鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖la。
3. h-f-Med23蛋白的質(zhì)譜鑒定 用帶抗-flag M2抗體的瓊脂糖樹(shù)脂(Sigma-Aldrich)進(jìn)一步純化上述一步純化 的h-f-Med23蛋白，150ng/ml FLAG肽洗脫h-f-Med23，作SDS-PAGE和銀染。從膠上割取 150KD h-f-Med23蛋白，LTQ儀器質(zhì)譜分析，鑒定為人轉(zhuǎn)錄中介體復(fù)合物Med23亞基，見(jiàn)圖 lb。 實(shí)施例2.鑒定分析利用重組昆蟲(chóng)桿狀病毒體外表達(dá)純化的Med23的功能活性
Med23被報(bào)導(dǎo)能夠分別和腺病毒E1A蛋白和細(xì)胞內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子Elkl發(fā)生相互作 用。因此通過(guò)GST沉降技術(shù)(GST Pull Down)測(cè)定重組Med 23與E1A蛋白或Elkl蛋白的 相互作用情況來(lái)分析重組Med 23的功能活性。以常規(guī)方法從Hela細(xì)胞(ATCC)的細(xì)胞中 抽提的細(xì)胞核抽提物(含有Med23)作為陽(yáng)性對(duì)照。 采用常規(guī)的方法，將E1A蛋白序列(參見(jiàn)GenBank登錄號(hào)AY339865. 1)第 121aa-223aa位的編碼序列連入pGEX_5x_3 (購(gòu)自Amersham Pharmacia公司)的BamHl/ EcoRl位點(diǎn)，獲得重組表達(dá)GST-E1A的表達(dá)載體(該GST-E1A獲自UCLA， Arnold J. Berk實(shí)
8驗(yàn)室)，將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，原核表達(dá)獲得GST-EIA蛋白，IPTG誘導(dǎo)，常規(guī) 方法純化表達(dá)產(chǎn)物獲得GST-EIA蛋白。將純化后的GST-EIA蛋白與瓊脂糖珠(購(gòu)自Sigma) 共孵育，GSH洗脫。獲得GST-EIA珠。 將兩步純化的Med23蛋白溶液孵育GST-EIA珠，E1A CR3能夠和重組Med23發(fā)生 相互作用，而H160Y這個(gè)突變破壞了相互作用所需的鋅指結(jié)構(gòu)，GST-E1A(H160Y)(制備方法 與前述類(lèi)似)不能被重組Med23沉降，見(jiàn)圖2b。因此，重組的可溶Med23和細(xì)胞核抽提物中 的Med23具有相同的結(jié)合E1A的活性，見(jiàn)圖2a。 GST-Elkl構(gòu)建方法人hela細(xì)胞抽取RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，從人cDNA中擴(kuò)增對(duì) 應(yīng)于Elkl蛋白(參見(jiàn)Gene ID :2002 ;mRNA序列見(jiàn)NMJ)Ol 114123. 1))中第307aa-428aa 位序列的編碼序列。連接入pGEX-4t-2 (購(gòu)自AmershamPharmacia公司)中的BamHl/Notl 位點(diǎn)。擴(kuò)增引物上游5' TATGGATCCatctcccagccgcagaagggccgga 3，;下游5' TGGGCGGC CGCtcatggcttctggggccctggggag 3'將上述構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，原核表達(dá) 獲得GST-Elkl蛋白，IPTG誘導(dǎo)，常規(guī)方法純化表達(dá)產(chǎn)物獲得GST-Elkl蛋白。將純化后的 GST-Elkl蛋白與瓊脂糖珠(購(gòu)自Sigma)共孵育，GSH洗脫。獲得GST-Elkl可溶蛋白。
通過(guò)His親和柱純化的His-Flag-Med23重組蛋白來(lái)沉降GST-E1A或者GST-Elkl 融合蛋白。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞外，該重組表達(dá)的Med23能與E1A的CR3結(jié)構(gòu)域相互作用，而E1A 的H160Y突變形式，由于破壞了相互作用所需要的鋅指結(jié)構(gòu)，與Med23的相互作用大大減 弱，見(jiàn)圖3a。同樣的，重組的Med23能和體外用Erk2激酶(購(gòu)自NEB)磷酸化的Elkl相互 作用，而不加Erk2處理的Elkl不能與重組的Med23發(fā)生相互作用，見(jiàn)圖3b。這些結(jié)果證明 了重組表達(dá)的Med23具有與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合活性。
實(shí)施例3.利用原核系統(tǒng)表達(dá)Med23蛋白的研究 如實(shí)施例的方法獲得含有Flag-Med23的基因序列的產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)xhol酶切后插 入PET28(+)載體(Invitrogen)的XhoI位點(diǎn)。測(cè)序正確后，將重組質(zhì)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL-21，加IPTG誘導(dǎo)，菌液用超聲破碎，分別得到上清和沉淀。用抗flag的抗體檢測(cè)。
檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，可見(jiàn)上清中沒(méi)有目標(biāo)蛋白。誘導(dǎo)之后的蛋白全在沉淀里，并 且已經(jīng)發(fā)生降解。用抗Med23的抗體檢測(cè)后得到的結(jié)果類(lèi)似。因此用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表 達(dá)His-Flag-Med23得不到可溶的蛋白。 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范 圍。
權(quán)利要求
一種表達(dá)可溶性轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23的方法，其特征在于，所述方法包括(1)提供一重組昆蟲(chóng)桿狀病毒，所述的桿狀病毒的基因組中含有一重組表達(dá)盒，所述的重組表達(dá)盒按照5’→3’含有Flag蛋白的編碼序列，轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23編碼序列；(2)將(1)所述的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，培養(yǎng)感染后的昆蟲(chóng)細(xì)胞，使之表達(dá)Flag-轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23；和(3)分離獲得可溶性Flag-轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒如下制備(A) 將Flag蛋白的編碼序列和轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23編碼序列克隆入桿粒中，獲得重組的桿粒；(B) 將(A)獲得的重組的桿粒轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的昆蟲(chóng)細(xì)胞；禾口(C) 收獲重組的桿狀病毒。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在步驟(A)中，所述重組的桿粒通過(guò)以下步驟獲得(a) 將Flag蛋白的編碼序列和轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23編碼序列插入穿梭載體的多克隆位點(diǎn)中，獲得插入了Flag蛋白的編碼序列和轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23編碼序列的重組載體；(b) 將(a)獲得的重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞DH10Bac，獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中含有重組桿粒，所述重組桿粒攜帶Flag蛋白的編碼序列和轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23編碼序列；禾口(c) 從所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中提取重組桿粒。
4. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，在步驟(1)中，所述的重組表達(dá)盒中，在Flag蛋白的編碼序列的5'端，還含有一 His純化標(biāo)簽編碼序列。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在步驟(3)中，采用Ni-NTA柱純化Flag-轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23，獲得第一純化產(chǎn)物。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，還包括對(duì)第一純化產(chǎn)物進(jìn)一步采用帶有抗Flag蛋白的抗體的瓊脂糖柱純化，獲得第二純化產(chǎn)物，即為純化的Flag-轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的昆蟲(chóng)細(xì)胞是Hi5細(xì)胞。
8. —種重組昆蟲(chóng)桿狀病毒，其特征在于，所述的桿狀病毒的基因組中含有一重組表達(dá)盒，所述的重組表達(dá)盒按照5' —3'含有Flag蛋白的編碼序列，轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23編碼序列。
9. 如權(quán)利要求8所述的桿狀病毒，其特征在于，在Flag蛋白的編碼序列的5'端，還含有一 His純化標(biāo)簽編碼序列。
10. 權(quán)利要求8或9所述的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒的用途，其特征在于，用于制備可溶性轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組表達(dá)可溶性轉(zhuǎn)錄中介體復(fù)合物Med23亞基的方法所述方法包括(1)提供一重組昆蟲(chóng)桿狀病毒，所述的桿狀病毒的基因組中含有一重組表達(dá)盒，所述的重組表達(dá)盒含有Flag蛋白的編碼序列，轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23編碼序列；(2)將(1)所述的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，培養(yǎng)感染后的昆蟲(chóng)細(xì)胞，使之表達(dá)Flag-轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23；和(3)分離獲得可溶性Flag-轉(zhuǎn)錄中介體蛋白亞基Med23。本發(fā)明第一次表達(dá)出了可溶性Med23蛋白，解決了現(xiàn)有技術(shù)中難以可溶性表達(dá)Med23蛋白的技術(shù)難題。
文檔編號(hào)C12N7/01GK101736006SQ20081020300
公開(kāi)日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2008年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月20日
發(fā)明者楊冠珍, 王綱, 黃燕 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院