專利名稱：：人類原癌基因kras的檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
臨床分子診斷技術(shù)，尤其涉及一種人類原癌基因KRAS的檢測方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)有檢測人類原癌基因KRAS的技術(shù)分為2類，一類是采用酶聯(lián)免疫的方法檢測kras基因的表達(dá)水平，而非基因突變水平，表達(dá)水平僅能提供mRNA水平的參考數(shù)據(jù)，而并非DNA水平，并且表達(dá)水平僅和腫瘤發(fā)生相關(guān)，和化療藥物療效無關(guān)。第二類也是采用檢測DNA水平的基因突變，但是采用芯片雜交技術(shù)(寡核苷酸雜交檢測技術(shù)，即利用相關(guān)突變的寡核苷酸與受檢對象DNA進(jìn)行雜交來確定突變類型)。該專利號為200480043145(韓國專利)，對實(shí)驗(yàn)條件要求高，結(jié)果不穩(wěn)定，準(zhǔn)確度不夠高，因此不利于臨床標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用。而且芯片雜交的方法只能檢測已知的突變，不能夠?qū)ξ粗蛔冞M(jìn)行篩查。因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種準(zhǔn)確度高，結(jié)果穩(wěn)定，可以同時(shí)篩查kras基因突變，且便于臨床操作和標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用的KRAS基因突變的檢測方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種準(zhǔn)確度高，結(jié)果穩(wěn)定，便于臨床操作和標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用的KRAS基因突變的檢測方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測KRAS基因突變的試劑盒。本發(fā)明采用標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程和方法將測序應(yīng)用于人類KRAS基因突變的檢測，創(chuàng)新性的一次性進(jìn)行2-4個(gè)外顯子的擴(kuò)增反應(yīng)。發(fā)明人擴(kuò)增并測序的外顯子是2，3，4，5外顯子，其中KRAS第一外顯子由于不編碼蛋白質(zhì)的氨基酸，因此一般的研究或檢測均不包含，無檢測意義。我們采用標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)分析方法，使得該應(yīng)用能夠?qū)崿F(xiàn)于臨床，為臨床遺傳分子診斷和臨床消化道化療藥物使用指導(dǎo)提供解決方案。為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種KRAS基因突變的檢測方法，包括步驟(a)抽提樣品中的DNA，用特異性引物在特定的擴(kuò)增條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(b)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，與正常KRAS基因比較，是否存在基因突變。上述樣品選自血液、組織或其他體液。樣品可以是制作好的石蠟標(biāo)本或病理切片或細(xì)胞。上述KRAS基因突變的檢測方法，所述步驟(a)中同時(shí)用2對以上針對KRAS基因不同外顯子的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所述特異性引物含有15-30個(gè)核苷酸，優(yōu)選20-27個(gè)核苷酸。上述特異性引物選自下組中的2對以上(包括2對)(a)SEQIDNO:5禾PSEQIDNO:6;(b)SEQIDNO:7和SEQIDNO:8;(c)SEQIDNO:9禾PSEQIDNO:10;(d)SEQIDNO:11禾口SEQIDNO:12。上述步驟(a)中同時(shí)用3對或4對針對KRAS基因不同外顯子的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。較佳的，上述特異性引物為以下4對(a)SEQIDNO:5禾卩SEQIDNO:6;(b)SEQIDNO:7和SEQIDNO:8;(c)SEQIDNO:9禾卩SEQIDNO:10;(d)SEQIDNO:11禾口SEQIDNO:12。上述檢測方法，在步驟(b)之前還包括一步驟，將步驟(a)中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。在進(jìn)行純化時(shí)優(yōu)選使用堿性磷酸酶(SAP)和ExoI酶。本發(fā)明提供了一種檢測KRAS基因突變的試劑盒，其特征在于，它含有2對以上針對KRAS基因不同外顯子的特異性引物。優(yōu)選的，所述試劑盒包括3對或4對針對KRAS基因不同外顯子的特異性引物。上述特異性引物選自下組中的2對以上(包括2對)(a)SEQIDNO:5禾卩SEQIDNO:6;(b)SEQIDNO:7和SEQIDNO:8;(c)SEQIDNO:9禾卩SEQIDNO:10;(d)SEQIDNO:11禾口SEQIDNO:12。較佳的，上述特異性引物為以下4對(a)SEQIDNO:5禾卩SEQIDNO:6;(b)SEQIDNO:7和SEQIDNO:8;(c)SEQIDNO:9禾卩SEQIDNO:10;(d)SEQIDNO:11禾口SEQIDNO:12。上述試劑盒還含有PCR擴(kuò)增試劑。所述PCR擴(kuò)增試劑包括T叫DNA酶、4種dNTP(脫氧核苷三磷酸)和MgCl2。更佳的，上述試劑盒還含有PCR產(chǎn)物純化酶。所述PCR產(chǎn)物純化酶優(yōu)選堿性磷酸酶和Exol酶。在具體實(shí)施例中，上述試劑盒還包括測序酶、測序緩沖液(SequencingBuffer)。本發(fā)明的主要思路是應(yīng)用基因突變檢測的金標(biāo)準(zhǔn)——測序方法將人類原癌基因Kras的突變檢測過程標(biāo)準(zhǔn)化，并且將結(jié)果分析的背景整合在檢測過程中，為臨床遺傳分子診斷的開展提供技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)果分析標(biāo)準(zhǔn)。本方法的步驟1、尋找人類原癌基因Kras的標(biāo)準(zhǔn)序列，找出編碼蛋白的功能區(qū)；2、設(shè)計(jì)了對kras基因2_4個(gè)外顯子一次性PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增的引物并且優(yōu)化條件使之標(biāo)準(zhǔn)化；3、純化PCR產(chǎn)物并且優(yōu)化體系使之標(biāo)準(zhǔn)化；4、對純化產(chǎn)物進(jìn)行測序反應(yīng)(sequencing)，優(yōu)化體系條件并且使之標(biāo)準(zhǔn)化；45、對測序產(chǎn)物采用自己的配方進(jìn)行純化，并且標(biāo)準(zhǔn)化；6、經(jīng)過對資料的查詢，文獻(xiàn)的整理，以及實(shí)際樣本的檢測，得到中國人常見的Kras基因突變種類以及臨床的參考意義，并且將這些信息整合到檢測的結(jié)果分析中；7、將以上所有標(biāo)準(zhǔn)化的過程和結(jié)果分析制作成試劑盒，為臨床遺傳分子診斷的標(biāo)準(zhǔn)化提供便利條件。本技術(shù)有以下突出的效果1、可以提高Kras突變檢測的標(biāo)準(zhǔn)化程度，做到每一步都有嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)化操作和質(zhì)控，以利于該應(yīng)用在臨床分子診斷開展；2、提高了結(jié)果分析的意義，我們把以往研究和臨床數(shù)據(jù)整合在數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)中，給臨床醫(yī)師根據(jù)病人實(shí)際情況分析分子診斷結(jié)果提供參考依據(jù)；3、測序是檢測人類基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，因此可以大大提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，優(yōu)于以往的芯片檢測或者其他檢測方法。4、根據(jù)該技術(shù)得到的結(jié)果，可以指導(dǎo)消化道腫瘤臨床化療的靶向藥物(例如愛必妥Erbitux等)的用藥，Kras在外顯子有突變時(shí)，患者靶向藥療效不佳且毒性明顯，而沒有突變的靶向藥物療效較好。5、一次性的擴(kuò)增2-4個(gè)KRAS外顯子，提高了檢測的速度，節(jié)省了試劑和時(shí)間，是方法學(xué)上的創(chuàng)新。本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是KRAS第二外顯子測序的PCR引物KrasE02F與KrasE02R和測序引物KrasE02F的示意圖圖中有三處標(biāo)有下劃線，第一處為上游引物KrasE02F，第三處為下游引物KrasE02R，中間標(biāo)有下劃線的部分為第二外顯子需要測序的部分。測序引物為KrasE02F。圖2是沒有突變的樣本1部分KRAS第二外顯子的測序結(jié)果示意圖圖3是樣本2的第二外顯子結(jié)果示意，116位錯義突變GGT(Gly12)>GTT(Val)圖4是樣本3的第二外顯子結(jié)果示意，118位錯義突變GGC(Gly13)>GAC(Asp)圖5是樣本4的第三外顯子結(jié)果示意，287位錯義突變GCA(Ala146)>GTA(Val)具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1KRAS基因突變檢測標(biāo)本來源該方法可以應(yīng)用于來源于血液、組織、石蠟標(biāo)本、病理切片等樣本的DNA中Kras基因突變的檢測，樣本的提取我們采用的是德國Qiagen的血液、組織、石蠟等標(biāo)5本的DNA抽提試劑盒(具體抽提方法請參考試劑盒說明書)。本實(shí)施例中我們選取的標(biāo)本是64例大腸癌的腫瘤組織標(biāo)本(福建省腫瘤醫(yī)院，編號1-64)，抽提各組織DNA。PCR擴(kuò)增在微量離心管中配制反應(yīng)混合液，反應(yīng)體系如下組分IX8.5XddH206.52u155.42u110XBufferlu18.5u1dNTP(10mM)0.2u11.7u1MgCl2(25mM)0.2u11.7u1PrimerMix(2uM)lu18.5u1T叫聚合酶(5U/u1)0.08u10.68u1反應(yīng)混合液體積9u176.5u1注PrimerMix是四對引物的混合液，每個(gè)引物的濃度均為2iiM;引物SEQIDN0:5/SEQIDNO:6是擴(kuò)增Kras外顯子2的引物；引物SEQIDNO:7/SEQIDNO:8是擴(kuò)增Kras外顯子3的引物；引物SEQIDNO:9/SEQIDNO:10是擴(kuò)增Kras外顯子4的引物；引物SEQIDN0:11/SEQIDNO:12是擴(kuò)增Kras外顯子5的引物。引物均為自行設(shè)計(jì)，上海生工合成。1)將反應(yīng)混合液輕微振蕩混勻稍稍離心后，分裝到8個(gè)0.2ml的PCR管中，每管9ii1;2)加入1Pi樣本DNA，然后蓋好蓋子，輕微振蕩混勻后2000g離心1分鐘；3)將PCR管放到ABI2720PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)上，按照下面程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增95°C15min94°C15sec56°C30sec^X35cycles72°Clmin一72°C2min4°C①PCR產(chǎn)物純化1)在原來PCR管中，每管加入0.5iUlU/iUSAP(Promega公司)以及0.3iU20U/iUExoI酶(Epicentre公司)，蓋好蓋子，輕微振蕩混勻后稍稍離心；62)將PCR管放到2720PCR擴(kuò)增儀上，按照下面程序進(jìn)行酶純化37°C60min75°C15min4°C①3)力口入9ill無菌超純水輕微振蕩混勻后稍稍離心待用。測序反應(yīng)(以外顯子2為例，引物KrasE02F(0.2iiM))1)在微量離心管中配制反應(yīng)混合液，反應(yīng)體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2)將反應(yīng)混合液輕微振蕩混勻稍稍離心后，分裝到PCR孔板，每孔5iU;3)加入1Pl已經(jīng)純化好的PCR產(chǎn)物稀釋液，然后貼上PCR粘膜，輕微振蕩混勻后2000g離心1分鐘;4)將PCR孔板放到PCR擴(kuò)增儀上，去除PCR粘膜，蓋上PCR蓋墊，按照下面程序(以ABI2720PCR擴(kuò)增儀為準(zhǔn))進(jìn)行測序延伸96°Clmin<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>4°C①其余外顯子(3，4，5)的測序反應(yīng)僅引物不同，分別為KrasE03F、KrasE04F、KrasE05F，其余實(shí)驗(yàn)條件和操作方法均與外顯子2相同。測序產(chǎn)物純化1)每個(gè)測序反應(yīng)加2ullOOmMEDTA，然后加入20ul100%乙醇后蓋上PCR粘膜然后壓緊，稍稍振蕩混勻室溫靜置10分鐘；2)3200g/4000rpm4。C離心40分鐘；3)去PCR粘膜，輕甩倒去上清，然后在吸水紙上倒置輕拍吸去粘在孔口的殘液；4)將PCR孔板倒置于吸水紙上，然后放入離心機(jī)稍甩(離心速度達(dá)到設(shè)定的900rpm即停)5)加入40ul72X乙醇，蓋上PCR粘膜然后壓緊稍稍振蕩后3200g/4000rpm4"離心20分鐘;6)去PCR粘膜，輕甩倒去上清，然后在吸水紙上輕拍吸去粘在孔口的殘液7)將PCR孔板倒置于吸水紙上，放入離心機(jī)稍甩(速度達(dá)900rpm后持續(xù)5sec即停)8)室溫避光20分鐘讓殘留乙醇蒸發(fā)干凈9)加入10ulHi-Di(ABI公司)振蕩溶解后95。C變性5分鐘，待測序儀上樣。10)測序儀ABI公司3130x1，數(shù)據(jù)設(shè)置軟件ABIDatacollection2.0。上樣并按照軟件要求設(shè)置測序參數(shù)后全自動進(jìn)行測序分析。數(shù)據(jù)分析及結(jié)果測序文件用Seqanalysis5.3.1(美國ABI公司標(biāo)準(zhǔn)軟件)打開，肉眼觀察測序得到的4個(gè)外顯子序列中突變雜合子的存在，然后使用DNAstarSeqman軟件(DNAstar公司)將測序得到的序列導(dǎo)出與我們提供的標(biāo)準(zhǔn)序列比較檢測突變雜合子以及純合子的存在。我們共測了64例大腸癌的腫瘤組織DNA標(biāo)本，共得到了3種突變(圖3、圖4、圖5所顯示的三種不同類型突變)，其中圖3、圖4所代表的12、13外顯子突變是文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)報(bào)道過的突變，而圖5所示的146密碼子的錯義突變是發(fā)明人新發(fā)現(xiàn)的原來沒有報(bào)道過的突變。實(shí)施例2KRAS基因突變檢測對樣品1-5號的處理和實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例1，PCR擴(kuò)增步驟中PrimerMix是二對引物的混合液，每個(gè)引物的濃度均為2iiM;引物SEQIDN0:5/SEQIDN0:6是擴(kuò)增Kras外顯子1的引物；引物SEQIDNO:9/SEQIDNO:10是擴(kuò)增Kras外顯子4的引物。測序反應(yīng)中反應(yīng)混合液中測序引物分別為KrasE02F和KrasE04F。測序結(jié)果顯示樣本2、3有錯義突變，見圖3、圖4。實(shí)施例3KRAS基因突變檢測試劑盒的制備制備試劑盒，其成分如下，每個(gè)成分放在一個(gè)管子中1、PCR預(yù)混合液包含3對引物(各2uM)，MgCl2(25mM)，dNTP(10mM)，10XBuffer<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>名稱序列序列(53')SEQIDNO:反向引物KrasE02R:gtgcaggaccattctttgatacaKrasE03R:cactgctctaatcccccaagaKrasE04R:aagaaaccaaagccaaaagcaSEQIDNO:6SEQIDNO:8SEQIDNO:102、TaaDNA聚合酶1Uhotstartaq酶(德國QIAGEN公司)3、PCR產(chǎn)物純化酶包含0.5USAP(Promega公司)以及6UExoI酶(Epicentre公司)4、測序預(yù)混合液I:包含引物KrasE02F(0.2uM),5XSequencingBuffer(美國ABI公司)5、測序預(yù)混合液II:包含引物KrasE03F(0.2uM)，5XSequencingBuffer(美國ABI公司)6、測序預(yù)混合液III:包含引物KrasE04R(0.2uM),5XSequencingBuffer(美國ABI公司)7、測序酶BigDye3.10.5ul(美國ABI公司)8、測序產(chǎn)物純化緩沖液2ul100mMEDTA9、測序上樣液10ulHIDI溶液(美國ABI公司)Kras基因突變檢測試劑盒說明書一份實(shí)施例4KRAS基因突變檢測試劑盒的制備制備試劑盒，其成分如下，每個(gè)成分放在一個(gè)管子中1、PCR預(yù)混合液包含4對引物(各2uM)，MgCl2(25mM)，dNTP(10mM)，10XBuffer名稱序列序列(53')SEQIDNO:正向引物KrasE02F:gagtttgtattaaaaggtactggtggaKrasE03F:cgtcatctttggagcaggaacKrasE04F:ggaaggaaaatttggtgtagtggKrasE05F:caaaccaggattctagcccataSEQIDNO:5SEQIDNO:7SEQIDNO:9SEQIDNO:119<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2、TaqDNA聚合酶:lUhotstartaq酶(德國QIAGEN公司)3、PCR產(chǎn)物純化酶包含0.5USAP(Promega公司)以及6UExoI酶(Epicentre公司)4、測序預(yù)混合液I:包含引物KrasE02F(0.2uM)，5XSequencingBuffer(美國ABI公司)5、測序預(yù)混合液I1:包含引物KrasE03F(0.2uM)，5XSequencingBuffer(美國ABI公司)6、測序預(yù)混合液III:包含引物KrasE04R(0.2uM)，5XSequencingBuffer(美國ABI公司)7、測序預(yù)混合液IV:包含引物KrasE05緣2uM)，5XSequencingBuffer(美國ABI公司)8、測序酶BigDye3.10.5ul(美國ABI公司)9、測序產(chǎn)物純化緩沖液2ul100mMEDTA10、測序上樣液10ulHIDI溶液(美國ABI公司)Kras基因突變檢測試劑盒說明書一份。討論在lievre、DiFioreF等四篇文獻(xiàn)中的四組病人中，KRAS突變的比例分別為43%Q丄i6vreA，etal.CancerRes2006;66:3992-3995)，37%(2.DiFioreF，etal.BrJCancer2007;96:1166-1169)，41%(3.DeRoockW，etal.AnnOncol2008;19:508-515);27%(4丄i色vreA，etal.JClinOncol2008;26:374-379)。采用西妥昔單抗靶向藥物治療的有效率在四個(gè)研究中分別為37%，20%，25%和29%，這些有效的人均是kras野生型，而kras突變的患者使用靶向藥物治療無一例有效。回歸分析得到的無進(jìn)展生存率(PFS)在幾篇文獻(xiàn)中均有顯著性差異，而總體生存率(OS)也有明顯差異，因此KRAS基因的突變可以作為大腸癌西妥昔單抗(例如愛必妥)療效的重要參考依據(jù)，并且是大腸癌病人預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)，具有重要的臨床意義。參見表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表1Kras突變與西妥昔單抗(例如愛必妥)療效的關(guān)系表在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表〈110〉天昊生物科技有限公司〈120〉人類原癌基因KRAS的檢測方法及試劑盒〈130>081107〈160>12〈170>Patentlnversion3.1〈210>1〈211>300〈212>DNA〈213>Kras基因外顯子2〈400〉1ttga肌t肌tttttcatata肌ggtgagtttgtatt肌肌ggtactggtggagtatttg360tagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttcattatttttatt120ataaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtagg180caagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaac240aatagaggtaaatcttgttttaatatgcatattactggtgcaggaccattctttgataca3001160120180240■540600〈210>2〈211>840〈212>DNA〈213〉Kras基因外顯子3〈400>2ttccattttttgagtttttttgttttgtttttttaataatagccaatcctaatgggtatgtggtagcatctcatggttttgattttattttcctgactattgatgatgttgagcatcttttcaggtgcttagtggccatttgtccgtcatctttggagcaggaacaatgtcttttcaagtcctttgcccatttttaaattgaattttttgttgttgagttgtatataacaccttttttgagcactgtaataatccagactgtgtttctcccttctcaggattcctacaggt朋ttgatgg3ga朋cctgtctcttggatettctcgacac3gcaggtc朋gtgcaatgagggaccagtacatgaggactggggagggctttctttgtgtaat肌tact肌atcatttg肌gatattcaccattataggtgggttta肌ttgaatataataagctgacattaaggagtaattatagtttttattttttgagtctttgctaatgccatgcat3t肌tatttaat肌3肌ttttt肌at肌tgtttatgaggtaggt肌tatcaaatgaagttcttgggggattagagcagtggagtaacttgctccagactgggtggtgctgggattgaaacctaggcctgtttgactccacagccttctgtattctec朋33gc朋gacttte朋cttttt3g3tecatc3tte朋3朋g33朋g朋tetg朋33g3tg3tttgagatggtgtc3cttt朋cagtctte朋3gt朋朋ggt300朋gc朋gteg360gaggagtec3420tttgccataacctgttttat660catcggtagt720actcttgact780840〈210>3〈211>720〈212>DNA〈213〉Kras基因外顯子4〈400>3cactttgggtctagaatttttcagtagtttctgttttactattatgatctacctgcatat60taacctattaggttatagttttactatacttctaggtatttgatcttttgagagagatac120aaggtttctgttte^^ggte^g^3ca■ateactegteg^g^gg^gg^^tt180tggtgtagtggaaactaggaattacattgttttctttcagccaaattttatgacaaaagt240tgtggacaggttttgaaagatatttgtgttactaatgactgtgctataacttttttttct300ttcccagaga3ca^tte^agagtteagg3ctctg33g3tgtecctetggtcctegteg360tgatttgccttcteg^cagtegac3c^33C3ggctcaggacttegc^420g朋gttetgg■ttccttttattg^3catC3gc^3gac■gacaggte3gteacactg■agatctgttttctgcaaaatcataactgttatgtcatttaatatatcagt540ttttctctcaattatgetatactaggaaataaaacaatatttagtaaatgtttttgtctc600ttgagagggcattgettettaatccagtgtccatggtactgcttttggctttggtttctt660tctacattgaaaatttctcttcaattctgagcacatgttaacatttagaattcaagaggt720〈210〉4〈211〉600〈212〉DNA〈213〉Kras基因外顯子5〈400〉4tttaagaacaaaccaggattctagcccatattttaaaactgcatcctcag60ttttattcaa3cagtctgatgtctgtttea■■■■■3tctc33gctcateatctca120aacttcttgcacatggctttcccagtaaattactcttaccaatgcaacagactttaaaga180agttgtgttttec^tgeagagagtggaggatgetttttetecattggtg3gggagatcc240gac^tecagattg^^^atc3gc^3g^g^^gactcctggctgtgtg^^tte300teteatgteatctggteagttteagttcagcacatteattttggcaga^13360gcagatgtcttttaaaggtaacaaggtggcaaccactttagaactacttaggtgtagtat420tctaacttgaagtattaaaagataagaaacttgtttccataattagtacatttattttta■atctagtgggaattaattataattgagacaattttgatggctgtagtsigactaatctata540tttggcataaagtctaatgatttaatgagtcttaagta肌ctaaatatttggaaactgat600〈210〉5〈211〉27〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉(1)(27)〈223〉KrasE02F<400>5gagtttgtattaaaaggtactggtgga27〈210〉6〈211>23<212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉(1)(23)<223>KrasE02R〈400>6gtgcaggaccattctttgataca23〈210〉7〈211>21<212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉(1)(21)<223>KrasE03F〈400>7cgtcatctttggagcaggaac〈210>8〈211>21<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈22l>misc—feature〈222〉(1)(21)〈223〉KrasE03R〈400>8cactgctctaatcccccaag〈210>9<211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc—feature〈222〉(1).(23)〈223〉KrasE04R〈220〉〈221>misc—feature〈222〉(1).(23)〈223〉KrasE04F〈400>9ggaaggaaaatttggtgtagtgg〈210>10〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列<220>〈221>misc_feature〈222〉(1).(21)〈223〉KrasE04R〈400>10朋g朋3cc朋agcc朋朋gc21〈210>11〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc一feature〈222〉(1).(22)〈223〉KrasE05F〈400>11caaaccaggattctagcccata22〈210>12〈211>27〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈22l>misc—feature<222>(1)..(27)〈223〉KrasE05R〈400>12agtcteicteicagccatceiemattgtct1權(quán)利要求一種KRAS基因突變的檢測方法，其特征在于，包括步驟(a)抽提樣品中的DNA，用特異性引物在特定的擴(kuò)增條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(b)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，與正常KRAS基因比較，是否存在基因突變。2.權(quán)利要求l所述的KRAS基因突變的檢測方法，其特征在于，所述步驟(a)中同時(shí)用2對以上針對KRAS基因不同外顯子的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3.權(quán)利要求2所述的KRAS基因突變的檢測方法，其特征在于，所述步驟(a)中同時(shí)用3對或4對針對KRAS基因不同外顯子的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。4.權(quán)利要求2所述的KRAS基因突變的檢測方法，其特征在于，所述特異性引物選自下組中的2對以上(a)SEQIDNO:5禾PSEQIDNO:6;(b)SEQIDNO:7禾PSEQIDNO:8;(c)SEQIDNO:9禾PSEQIDNO:10;(d)SEQIDNO:11禾PSEQIDNO:12。5.權(quán)利要求4所述的KRAS基因突變的檢測方法，其特征在于，所述特異性引物為以下4對(a)SEQIDNO:5禾PSEQIDNO:6;(b)SEQIDNO:7禾PSEQIDNO:8;(c)SEQIDNO:9禾PSEQIDNO:10;(d)SEQIDNO:11禾PSEQIDNO:12。6.—種檢測KRAS基因突變的試劑盒，其特征在于，它含有2對以上針對KRAS基因不同外顯子的特異性引物。7.權(quán)利要求6所述的檢測KRAS基因突變的試劑盒，其特征在于，所述特異性引物選自下組中的2對以上(a)SEQIDNO:5禾PSEQIDNO:6;(b)SEQIDNO:7禾PSEQIDNO:8;(c)SEQIDNO:9禾PSEQIDNO:10;(d)SEQIDNO:11禾PSEQIDNO:12。8.權(quán)利要求7所述的檢測KRAS基因突變的試劑盒，其特征在于，所述特異性引物為以下4對(a)SEQIDNO:5禾PSEQIDNO:6;(b)SEQIDNO:7禾PSEQIDNO:8;(c)SEQIDNO:9禾PSEQIDNO:10;(d)SEQIDNO:11禾PSEQIDNO:12。9.權(quán)利要求7或8所述的檢測KRAS基因突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還含有PCR擴(kuò)增試劑。10.權(quán)利要求9所述的檢測KRAS基因突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還含有PCR產(chǎn)物純化酶。全文摘要本發(fā)明提供了一種KRAS基因突變的檢測方法和試劑盒，所述檢測方法包括步驟(a)抽提樣品中的DNA，用特異性引物在特定的擴(kuò)增條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(b)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，與正常KRAS基因比較，是否存在基因突變。所述特異性引物為針對KRAS基因不同外顯子的2-4對引物。采用本發(fā)明檢測方法和試劑盒，可以提高檢測速度，節(jié)省試劑和時(shí)間，利用本發(fā)明檢測結(jié)果可以指導(dǎo)消化道腫瘤臨床化療的靶向藥物的用藥。文檔編號C12Q1/68GK101736080SQ20081020326公開日2010年6月16日申請日期2008年11月24日優(yōu)先權(quán)日2008年11月24日發(fā)明者丁達(dá),姜正文申請人:上海天昊生物科技有限公司