專(zhuān)利名稱(chēng)：與大鼠精子發(fā)生相關(guān)的基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的基因序列，更具體地說(shuō)，是涉及一 種與大鼠精子發(fā)生相關(guān)的基因序列。
背景技術(shù)：
精子發(fā)生是復(fù)雜的過(guò)程，這過(guò)程包括精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells, SSCs)經(jīng)過(guò)有絲分裂、減數(shù)分裂，依次分化為A型精原細(xì)胞、B型精原細(xì) 胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞，最后生成成熟的精子。在這一分 化過(guò)程中，每一特定的階段都受到嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控。由于每個(gè)階段都有細(xì)胞特異性和 發(fā)育階段特異性的結(jié)構(gòu)形成，因此，眾多階段特異性基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)就成為了 形成生精細(xì)胞階段特異性結(jié)構(gòu)及發(fā)揮特定細(xì)胞功能的基礎(chǔ)。一旦其中的任一階段 發(fā)生變異，都有可能影響最終精子的生成?，F(xiàn)今，在發(fā)達(dá)國(guó)家的已婚人群中，有 將近15%的夫婦存在不孕不育的問(wèn)題，而其中男性不育將近占到了一半。在我國(guó)， 男性不育也占到了 33. 15%。其中遺傳因素占原發(fā)性男性不育的60%，并且大多數(shù) 以常染色體隱性方式遺傳。目前，由于性激素的濫用和環(huán)境污染等問(wèn)題，男性不 育呈上升趨勢(shì)，這就越來(lái)越引起人們的關(guān)注和重視。從而研究這些精子發(fā)生過(guò)程 中階段性轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的基因，闡明精子發(fā)生的分子機(jī)制，對(duì)人類(lèi)的生殖健康、避 孕疫苗的研制和男性不育的防治就具有十分重要的意義。
此外，畜牧業(yè)作為以種植業(yè)為基礎(chǔ)的第二性產(chǎn)業(yè)，現(xiàn)今己成為中央為推動(dòng)糧 食生產(chǎn)區(qū)的農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，增加農(nóng)民收入的重要舉措。而在畜牧業(yè)中，往往一只 雄性要負(fù)擔(dān)好幾只雌性的配種任務(wù)，因此如何從根本上提高雄性的繁殖能力就成 了推動(dòng)畜牧業(yè)發(fā)展的重要內(nèi)容。
但是迄今為止，人們對(duì)參與精子發(fā)生的各基因的研究還處在初級(jí)階段，雖然 已經(jīng)對(duì)少數(shù)的相關(guān)基因的作用進(jìn)行了研究，但是還存在大量的、未知的作用基因 沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)
發(fā)明內(nèi)容
.本發(fā)明的目的在于通過(guò)實(shí)驗(yàn)從大鼠睪丸中克隆出的一個(gè)新的、還未見(jiàn)報(bào)道的 基因，在其他物種中，也沒(méi)有其同源基因的有關(guān)報(bào)道，提供一種與大鼠精子發(fā)生 相關(guān)的基因序列。利用這個(gè)新基因在大鼠睪丸中具有階段性轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的特性， 為進(jìn)一步研究雄性不育、開(kāi)發(fā)雄性相關(guān)避孕藥具有重要的作用；此外，對(duì)于畜牧 業(yè)來(lái)說(shuō)，該基因的克隆及功能也將為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與研制提高雄性生殖能力的飼料 具有十分積極的促進(jìn)作用。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)從大鼠睪丸中克隆出一個(gè)具有階段性 轉(zhuǎn)錄和表達(dá)特性的全新基因，由于其在大鼠生殖細(xì)胞(rat germ cells)中具有表 達(dá)，因此將其命名為rGecl。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的-
本發(fā)明所分離出或純化的與大鼠精子發(fā)生相關(guān)基因編碼的核苷酸序列及其 蛋白分子序列，所述的核苷酸序列，是指包括在已經(jīng)分離出或純化的與大鼠基 因具有高度同源性的核苷酸序列的DNA分子，該分子與SEQ ID NO. 3中的從第 459-1214位的核苷酸序列至少有70%的同源性。
所述的基因，其mRNA全長(zhǎng)為1705bp，其開(kāi)放閱讀框的啟示密碼子始于第459 位核苷酸，終于第1214位核苷酸，編碼一條含252個(gè)氨基酸的多肽。
或者在中度嚴(yán)緊條件下，所述的核苷酸序列能與SEQ ID NO. 3中的從第 459-1214位的核苷酸序列雜交。較佳地是所述的核苷酸序列能編碼與SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列一致的多肽。更佳地是所述的核苷酸序列能與SEQ ID NO. 3中從第459-1214位的核苷酸序列一致。這就包括SEQ ID NO. 3中的第 459-1214位的核苷酸序列、其簡(jiǎn)并序列及SEQ ID NO. 3中的第459-1214位的核 苷酸序列的變異形式。簡(jiǎn)并序列是指SEQ ID N0.3序列的第459-1214位核苷酸 中有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代而產(chǎn)生的序列。該 術(shù)語(yǔ)還指那些能在中度嚴(yán)緊條件下、更佳地是能在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO. 3中第459-1214位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。SEQ ID NO. 3中的第 459-1214位的核苷酸序列的變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)核苷酸的缺失、 插入和/或取代(通常為l-90個(gè)，較佳地為l-6 0個(gè)，更佳地為l-20個(gè)，最佳地 為1-10個(gè))，以及在5'和/或3'端添加數(shù)個(gè)核苷酸(通常為60個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為 30個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，最佳地為5個(gè)以?xún)?nèi))。
上面所述的核苷酸序列或其片段可以采用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成等
4方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi) 放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域常規(guī)方法所制備的cDNA 庫(kù)作為模板進(jìn)行擴(kuò)增而得到相關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要兩次或多次PCR 擴(kuò)增，然后把擴(kuò)增出的片段按正確的次序拼接起來(lái)。 一旦獲得了有關(guān)的序列，就 可以采用各種方法進(jìn)行大批量地獲得該序列。通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入菌 株或是細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主中分離得到該序列。
所述的基因編碼，具有SEQIDN0.3所示的氨基酸序列的蛋白或多肽、其變 異形式、活性片段，或活性衍生物。
所述的蛋白或多肽，是指分離出的或純化的與大鼠基因蛋白具有高度同源 性的蛋白或多肽，該多肽為具有SEQ ID N0.3中的氨基酸序列的多肽。
所述的蛋白或多肽，利用該蛋白或多肽獲得的抗血清。
最佳地是該多肽的氨基酸序列完全與SEQ ID NO. 3氨基酸序列一致。其變異 形式包括(但并不限于)若干個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取代(通常為1-90 個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地l-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))，以及在C末端和/或N 末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸(通常為60個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為30個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為 IO個(gè)以?xún)?nèi)，最佳地為5個(gè)以?xún)?nèi))。例如，在本領(lǐng)域中，用性質(zhì)相近或相似的氨基 酸進(jìn)行取代(稱(chēng)為保守性變異)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末 端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。其類(lèi)似物 與天然的大鼠多肽的差別可以是不影響序列的修飾形式上的差異，也可以是氨基 酸序列上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的突變體。誘導(dǎo)突變 體可以通過(guò)采用輻射或誘變劑的方法產(chǎn)生，還可通過(guò)已知分子生物學(xué)的技術(shù)(如 通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中)產(chǎn)生。這些類(lèi)似物還包括含有不同 于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類(lèi)似物，以及含有非天然存在的氨基酸 (如e、 Y-氨基酸)的類(lèi)似物。修飾的形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生
形式，如磷酸化、糖基化、乙?；螋然?。應(yīng)該指出的是，本發(fā)明的多肽
并不限于上述列舉的代表性多肽。
所述的分離出或純化的DNA，是指在cDNA水平上，利用引物對(duì)該基因的擴(kuò) 增和利用純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。
上面所述的蛋白或多肽可采用重組法生產(chǎn)，也可用固相技術(shù)，人工直接合成。例如，通過(guò)使用肽合成儀來(lái)自動(dòng)合成肽。也可以分別合成本發(fā)明蛋白的各片段， 然后用化學(xué)方法加以連接而形成全長(zhǎng)的分子。利用本發(fā)明的與大鼠蛋白具有高度 同源性的蛋白，進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)方法，可篩選出與之發(fā)生相互作用的物質(zhì)、或者受 體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明提供了一種載體，它包含所述的DNA分子。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng) 域中已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒、病毒載體、粘粒等。在生產(chǎn)本 發(fā)明的大鼠蛋白的多肽時(shí)，可以將大鼠蛋白的編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序 列，從而形成大鼠蛋白表達(dá)載體，可用于后續(xù)對(duì)該基因功能的研究或是構(gòu)建該基 因過(guò)量表達(dá)的模型。術(shù)語(yǔ)"可操作地連于"指DNA連接完成后，編碼該蛋白的 DNA序列的活性能被與之位于同一線(xiàn)性DNA序列的其他部分所影響。例如，如果 信號(hào)肽DNA、啟動(dòng)子控制序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等都可操作地連于編碼序列。
所述的核苷酸序列，對(duì)于可用作探針的核苷酸分子，該分子具有SEQ ID NO. 3 核苷酸序列中所示的第459-1214位核苷酸序列中10-600個(gè)連續(xù)核苷酸。較佳地 是具有100-500個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼大鼠蛋白 的核酸分子。
本發(fā)明提供了檢測(cè)樣品中是否存在編碼大鼠蛋白的核苷酸序列的方法。它包 括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否能與之發(fā)生結(jié)合。該樣品可 以是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于大鼠基因的核苷酸序列，并可 位于該序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為15-50個(gè)核苷酸。在本發(fā)明中，可用 Northern印跡法技術(shù)分析各樣品中與大鼠蛋白具有高度同源性的基因產(chǎn)物的表 達(dá)，即分析其RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
所述的氨基酸序列，對(duì)于可用作制備抗體的氨基酸分子，該分子具有SEQID NO.氨基酸序列中所示的10-252個(gè)連續(xù)氨基酸。該多肽可用于制備抗體，并用所 得的抗體檢測(cè)樣品中是否存在大鼠蛋白分子。
本發(fā)明提供了檢測(cè)樣品中是否存在大鼠蛋白的方法。它包括用上述的制備的 抗體與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)抗體是否能與之發(fā)生結(jié)合。在本發(fā)明中，可用 Western雜交法技術(shù)分析各樣品中與大鼠蛋白具有高度同源性的基因產(chǎn)物的表 達(dá)，即分析其蛋白在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
本發(fā)明提供的通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)并克隆得到了新的與精子發(fā)生相關(guān)的大鼠基因，增加了我們?cè)趯?duì)精子發(fā)生研究方面的認(rèn)識(shí)。有利于我們進(jìn)一步研究精子發(fā)生的分 子機(jī)制以及對(duì)與之有關(guān)的疾病的研究，對(duì)治療男性不育、研制男性避孕藥以及開(kāi) 發(fā)具有提高畜牧業(yè)中雄性繁殖能力的詞料也都具有重要的作用。因此，本發(fā)明具
有很大實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。


圖l大鼠基因在不同時(shí)期的大鼠睪丸中的表達(dá)差異分析示意圖； 圖中A為Northern Blot的結(jié)果，B為Western Blot的結(jié)果。 圖2大鼠基因在不同時(shí)期的大鼠睪丸中的表達(dá)細(xì)胞分析示意圖中A: 1日齡睪丸；B: 5日齡睪丸；C:成年睪丸；D:陰性對(duì)照
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案 為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于 下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未列出具體實(shí)驗(yàn)方法的，通常按照《分子克隆實(shí)
驗(yàn)指南》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)或《精編 分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)指南》(中國(guó)科學(xué)出版社，2005)中所述的操作方法，或 按照制造廠(chǎng)商所建議的條件進(jìn)行。 實(shí)施例1
大鼠基因的篩選及全長(zhǎng)克隆
1. 取組織
雄性大鼠，取睪丸，準(zhǔn)備抽取RNA。
2. 提取RNA
取睪丸于1. 5ml的EP管中，加入TRIzol試劑，用均漿器在冰中進(jìn)行均漿， 然后室溫放置5min，加入氯仿，劇烈混勻，并室溫放置3min。然后4'C最大速 度離心15min，取水相。最后可采用無(wú)水乙醇及乙酸鈉進(jìn)行濃縮。用分光光度計(jì) 測(cè)定RNA含量。
3. 反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)合成篩選探針
對(duì)上述所得RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，并采用PCR方法合成用于篩 選的探針。所用的PCR引物對(duì)為G0N001 (SEQI,.l) +GON002 (SEQIDN0.2)。 然后采用Promega公司的隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒將Y -P32標(biāo)記到探針上。4.克隆基因的全長(zhǎng)
通過(guò)cDNA文庫(kù)篩選以及3' -RACE方法克隆得到與精子發(fā)生相關(guān)基因的 cDNA全長(zhǎng)序列。
(1) cDNA文庫(kù)篩選
用上述標(biāo)記好的探針進(jìn)行對(duì)Stratagen提供的Lambda ZAP* II Library的 cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，挑選出陽(yáng)性克隆，得到其中片段，并進(jìn)行進(jìn)一步的克隆及 研究。
(2) 3， -RACE
根據(jù)Clontech公司的SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。然后將 各測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到該基因的全長(zhǎng)序列(SEQ ID NO. 3)。 實(shí)施例2
大鼠基因的序列信息
本發(fā)明的大鼠基因的全長(zhǎng)cDNA的長(zhǎng)度為1705bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO. 3， 其中開(kāi)放閱讀框位于459-1214位核苷酸(共756個(gè)核苷酸)。根據(jù)全長(zhǎng)cDNA推 導(dǎo)出基因的氨基酸序列，共252個(gè)氨基酸殘基，分子量為22138.45Da，等電點(diǎn) (pi)為4. 59。詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO. 3。
實(shí)施例3
大鼠蛋白特異性抗體的制備。
1. 合成目標(biāo)肽段
由Invitrogen公司制備小肽，其氨基酸序列為L(zhǎng)VEE腿認(rèn)HEGNGTD。
2. 制備抗體
以上述小肽作抗原免疫兔子，并加以純化，得到兔源的大鼠基因蛋白特異性 純化抗體。 實(shí)施例4
大鼠基因在大鼠不同時(shí)期的睪丸中的表達(dá)譜分析
1. 組織的收集
取l日齡、3日齡、5日齡、10日齡、15日齡、20日齡及成年大鼠睪丸。
2. Northern雜交分析
1) . RNA的提取利用TRIzol試劑提取上述各組織的RNA[參考《分子克隆:
8實(shí)驗(yàn)指南》有關(guān)RNA的制備章節(jié)(Sambrook等，2001)]。
2) . RNA的定量參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(Sambrook等，2001)，用 分光光度計(jì)測(cè)0D260: RNA含量計(jì)算1 OD260 = 40嗎/ml。
3) .總RNA用甲醛變性膠電泳分離l)稱(chēng)取l. lg瓊脂糖，加入到108.65ml 無(wú)菌水中，加熱融化，轉(zhuǎn)入55。C水浴中。2)取6.25ml 20X電泳緩沖液加入到 55°C的凝膠溶液中，混勻。3)再于通風(fēng)櫥中取10. Oral甲醛，加入到55°C的凝 膠溶液中，混勻。4)迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。5) 將提取的RNA (25嗎)溶解于RNA變性溶液中，在65°C下加熱5分鐘，然后立 即置于冰上。6)在樣品中加入2ul IOX上樣緩沖液，混勻。7)在電泳液未蓋 過(guò)膠的條件下點(diǎn)樣，5V/cm電壓電泳2-3小時(shí)左右。
4) . RNA尼龍膜上轉(zhuǎn)移1)轉(zhuǎn)移之前，將尼龍膜用20XSSC浸泡。2)電 泳好的膠先在浸膠液(50mM NaOH, lOmMNaCl)中浸泡20分鐘，然后再在lOmM Tris-HCl (pH=7. 5)中浸泡20分鐘，最后用20XSSC浸泡20分鐘。3)將濕潤(rùn)的 膜準(zhǔn)確地蓋在膠上，將三張與膜大小相同的濾紙置20XSSC溶液中濕潤(rùn)，蓋在膜 上，趕盡氣泡。4)濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃 板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時(shí)。5)轉(zhuǎn)移后，將膜于紫外交聯(lián)儀中紫 外交聯(lián)1分鐘。
5) .膜上雜交信號(hào)的檢出1)將膜浸在Rapid-hyb緩沖液(Amersham Bioscienses)中，65°C下預(yù)雜交30分鐘。2)將用Y-P"標(biāo)記的探針在沸水中 變性5分鐘，直接加入l)的雜交液中，于65。C雜交3小時(shí)。3)取出膜，置于 洗膜液I (2XSSC， 0. 1%SDS)中，漂洗2次，每次5分鐘。然后，轉(zhuǎn)入洗膜液 II (0. 1XSSC， 0. 1%SDS)中于65。C漂洗15分鐘。4)用X光片壓片30-90分鐘， 然后顯影、定影。
Northern雜交結(jié)果表明基因在早期的大鼠睪丸(1日齡、3日齡、5日齡、 10日齡、15日齡)中有著很強(qiáng)的表達(dá)，而在20日齡以后的大鼠睪丸中表達(dá)量明 顯下降(圖1A)。
3. Western雜交分析
提取上述取的的總蛋白，
2)提蛋白收集不同時(shí)期的大鼠睪丸，加入蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑，機(jī)械搗碎，提取總蛋白[參考《精編分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)指南》有關(guān)蛋白質(zhì)的提 取及濃度測(cè)定章節(jié)(奧斯伯等主編，2005)]。
3) 總蛋白用SDS-PAGE電泳分離A. 12%分離膠配制雙蒸水3. 35ml， 1.5M0L/L Tris-HCl (pH8. 8)2. 5ml， 10%SDS 0. lml， 30%丙烯酰胺4. 0ml， 10%過(guò) 硫酸胺50 u 1 ， TEMED 5 u 1 ; B. 4%濃縮膠配制雙蒸水1. 22ml ， 0. 5M0L/L Tris-HCl (pH6. 8)0. 5ml， 10%SDS 20ul， 30%丙烯酰胺0. 26ml， 10% 過(guò)硫酸胺10ul， TEMED 2ul; C.待膠凝固后，取下梳子；D.樣品加等量上樣 緩沖液混勻，IO(TC煮沸5min， 12000rpm離心5min，上樣后穩(wěn)壓條件下電泳， 濃縮膠70V、分離膠140V，至溴酚藍(lán)遷移到凝膠底部時(shí)，停止電泳。
4) 蛋白向硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移A.在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡約30min與凝膠同樣 大小的Hybond膜和兩張3mm濾紙；B. SDS-PAGE結(jié)束后，取出凝膠，將膜、凝 膠和濾紙按海綿墊-濾紙-凝膠-Hybond膜-濾紙-海綿墊的結(jié)構(gòu)，裝入轉(zhuǎn)印夾中， 各層間不能有氣泡，轉(zhuǎn)印時(shí)凝膠側(cè)接負(fù)極，Hybond膜側(cè)接正極，轉(zhuǎn)印電泳槽置 冰浴中，100V恒壓轉(zhuǎn)印2小時(shí)；C.轉(zhuǎn)印結(jié)束后，按加樣孔的位置，剪下分子量 標(biāo)準(zhǔn)的膜條用麗春紅染色，觀(guān)察轉(zhuǎn)印效果。
5) 膜上目標(biāo)蛋白的檢出A.置于封閉液中室溫振搖1小時(shí)；B.取出后置 于合適稀釋度的一抗(大鼠基因特異性抗體或e-tublin抗體中，室溫振搖2 小時(shí)；C.取出膜用洗滌液洗2-3次，每次5min; D.然后置于帶有服P的相應(yīng) 二抗中，室溫振蕩l小時(shí)；E.取出膜用洗滌液洗2-3次，每次5min; F.最后 將膜置于ECL顯色液中，并用X光片壓片5-60分鐘，然后顯影、定影。
結(jié)果同樣也表明大鼠基因蛋白在早期的大鼠睪丸(5日齡、10日齡、15日齡) 中有著很強(qiáng)的表達(dá)，而在20日齡以后的大鼠睪丸中大鼠基因的表達(dá)量明顯下降 (圖1B)。
綜上所述，Northern和Western雜交同時(shí)表明大鼠基因在大鼠睪丸中具 有階段性表達(dá)的特性。這說(shuō)明大鼠基因與大鼠的睪丸發(fā)育具有一定的相關(guān)性。 實(shí)施例5
大鼠基因蛋白在大鼠睪丸中的表達(dá)細(xì)胞種類(lèi)分析
1. 組織1日齡、5日齡、成年睪丸
2. 石蠟包埋各睪丸組織的石蠟包埋方法參考《精編分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)
10指南》有關(guān)組織的石蠟包埋的章節(jié)(奧斯伯等主編，2005)。然后對(duì)各不同時(shí)期 的睪丸進(jìn)行包埋塊進(jìn)行切片。
3.原位雜交原位雜交的基本方法參照《精編分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)指南》 相關(guān)原位雜交實(shí)驗(yàn)的章節(jié)(奧斯伯等主編，2005)。
1) 探針的制備采用Ambion公司提供的T7RNA或T3RNA pn1 m八vnn八—ni.,nTM:;+玄ii會(huì) 1、1*琉傷|| /i出-旦^il66豐";大哉/feb力未苣未)5
制備RNA探針探針。然后參照Roche公司提供的DIG RNA labeling Kit的說(shuō)明書(shū)標(biāo)記該核酸探針。
2) 原位雜交的最后顯色采用Roche公司提供的DIG Nucleic Acid Detection Kit,并參照其說(shuō)明對(duì)結(jié)果進(jìn)行顯色。
原位雜交的結(jié)果表明大鼠基因主要在睪丸的生殖細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)(如圖2所 示)。本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分列如下 (1 ) SEQ ID NO. 1的信息
(i) 序列特征-
(A) 長(zhǎng)度20bp
(B) 類(lèi)型核苷酸
(C) 鏈型單鏈
(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性
(ii) 分子烈性寡核苷酸
(iii) 序列描述SEQ ID NO. 1 CAGGGGAATCCGACTGTTTA
(2) SEQ ID NO. 2的信息
(i) 序列特征
(A) 長(zhǎng)度20bp
(B) 類(lèi)型核苷酸
(C) 鏈型單鏈
(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性
(ii) 分子烈性寡核苷酸
(iii) 序列描述SEQ ID NO. 2 TCCGTAGGTAGGGACAGTGG
(3) SEQ ID NO. 3的信息 〈110〉上海交通大學(xué)
〈120〉大鼠基因序列
〈160〉 2
〈210〉 1
〈211〉 1705
〈212〉畫(huà)
〈213〉大鼠(Rattus norvegicus) <400> 1
ctggtgcgga ccaggggaat ccgactgttt aattaaaaca aagcatcgcg aaggcccgcg 60 gcgggtgttg acgcgatgtg atttctgccc agtgctctga atgtcaaagt gaagaaattc 120
12<formula>formula see original document page 13</formula>
權(quán)利要求
1、一種與大鼠精子發(fā)生相關(guān)的基因序列，其特征在于，所分離出或純化的與大鼠精子發(fā)生相關(guān)基因編碼的核苷酸序列及其蛋白分子序列，所述的核苷酸序列，是指包括在已經(jīng)分離出或純化的與大鼠基因具有高度同源性的核苷酸序列的DNA分子，該分子與SEQ ID NO.3中的從第459-1214位的核苷酸序列至少有70％的同源性。
2、 如權(quán)利要求l所述的與大鼠精子發(fā)生相關(guān)的基因序列，其特征是，所述 的基因，其mRNA全長(zhǎng)為1705bp，其開(kāi)放閱讀框的啟示密碼子始于第459位核苷 酸，終于第1214位核苷酸，編碼一條含252個(gè)氨基酸的多肽。
3、 如權(quán)利要求l所述的與大鼠精子發(fā)生相關(guān)的基因序列，其特征是，所述 的核苷酸序列，對(duì)于用作探針的核苷酸分子，該分子具有SEQ ID NO. 3核苷酸序 列中所示的第459-1214位核苷酸序列中10-600個(gè)連續(xù)核苷酸。
4、 如權(quán)利要求l所述的與大鼠精子發(fā)生相關(guān)的基因序列，其特征是，所述 的基因編碼，具有SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列的蛋白或多肽、其變異形式、 活性片段，或活性衍生物。
5、 如權(quán)利要求3所述的與大鼠精子發(fā)生相關(guān)的基因序列，其特征是，所述 的蛋白或多肽，是指分離出的或純化的與大鼠基因蛋白具有高度同源性的蛋白或多肽，該多肽為具有SEQ ID N0.3中的氨基酸序列的多肽。
6、 如權(quán)利要求4或者5所述的與大鼠精子發(fā)生相關(guān)的基因序列，其特征是，所述的蛋白或多肽，利用該蛋白或多肽獲得的抗血清。
全文摘要
一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的與大鼠精子發(fā)生相關(guān)的基因序列。本發(fā)明所分離出或純化的與大鼠精子發(fā)生相關(guān)基因編碼的核苷酸序列及其蛋白分子序列，所述的核苷酸序列，是指包括在已經(jīng)分離出或純化的與大鼠基因具有高度同源性的核苷酸序列的DNA分子，該分子與SEQ ID NO.3中的從第459-1214位的核苷酸序列至少有70％的同源性。本發(fā)明涉及的基因?qū)τ谖覀冄芯烤影l(fā)生的分子機(jī)制以及與之相關(guān)的疾病具有重要的作用，同時(shí)也對(duì)于我們了解男性生殖、開(kāi)發(fā)男性避孕藥以及如何提高畜牧業(yè)中雄性繁殖能力提供了新的信息。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101475937SQ200810203440
公開(kāi)日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2008年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月27日
發(fā)明者際 吳, 楊兆娟 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)