專利名稱：一種使微生物在高于其極限生長溫度下生長的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種使微生物在高于其極限生長溫度的
條件下生長的方法。
背景技術(shù)：
外界環(huán)境溫度是影響生物體，尤其是微生物生長與生理變化的關(guān)鍵因素。每種微 生物均有其獨特的生長溫度范圍，在超越其生長溫度范圍后無法生長。這也是微生物的基 本性質(zhì)之一。例如，大腸桿菌最適生長溫度為37t:，在42-44t:條件下仍能生長。在培養(yǎng)溫 度達到46。C及其以上溫度時無法生長。對于具有應(yīng)用價值的工業(yè)微生物，改變其生理與生 長特性使其更有利于生產(chǎn)要求，是長期以來微生物菌種選育、改造及優(yōu)化的主要目的。提 高生產(chǎn)菌種的高溫耐受性以期進一步提高發(fā)酵過程的溫度，是工業(yè)發(fā)酵領(lǐng)域長期追求的目 標。在微生物的工業(yè)發(fā)酵過程中，一般情況下，較高的微生物培養(yǎng)溫度或微生物的較高耐熱 性均可以給工業(yè)發(fā)酵帶來十分有利的影響，并有助于大幅度降低能源及水資源的消耗。在 許多情況下，菌種對高溫的耐受能力乃至菌種培養(yǎng)溫度的提高，對于發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)過程具 有十分重要的應(yīng)用價值與可觀的商業(yè)價值。 自70年代以來，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了各種熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)，其中 大多數(shù)熱休克蛋白屬于分子伴侶蛋白，在細胞中擔(dān)負輔助新生多肽、蛋白折疊、成熟、組裝、 轉(zhuǎn)運、降解，催化變性蛋白的復(fù)性，防止蛋白的凝聚變性等功能。熱休克蛋白又叫應(yīng)激蛋白 (stress protein, SP)，是生物體對外界剌激迅速作出的應(yīng)激反應(yīng)，關(guān)閉正常的基因表達， 開啟一組應(yīng)激基因的表達，而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)上非常保守的特殊蛋白質(zhì)。使生物體能快速、 短暫調(diào)整應(yīng)激過程中細胞的存活機制，促進細胞抗損傷，并有助于細胞恢復(fù)正常的結(jié)構(gòu)和 機能。從而使生物體在熱、冷、高鹽、有機毒物、重金屬離子、氧自由基、紫外線及缺血、缺氧、 感染、基因損傷、組織創(chuàng)傷等不良環(huán)境和狀態(tài)下生存下來。除了亞致死溫度外，高鹽、酸、堿、 乙醇等環(huán)境壓力也可誘導(dǎo)熱休克蛋白合成。 按照分子量大小，熱休克蛋白 一 般分為五大類HSP100s (80-110kDa)， HSP90s (82-96kDa) ， HSP70s (67-76kDa) ， HSP60s (58-65kDa)和sHSP (40kDa以下)。極端嗜熱 菌的分子伴侶系統(tǒng)十分簡單，主要包括II型Ch即eronins (HSP60) ， sHSPs等。HSP70 (DnaK)、 HSP40 (DnaJ)、以及GrpE等分子伴侶在極端嗜熱菌中則幾乎不含有。 在工業(yè)生產(chǎn)上，目前越來越多地應(yīng)用到微生物，然而目前普遍存在微生物耐熱性 能差的問題，大大限制了其工業(yè)應(yīng)用的廣泛性。因此，本領(lǐng)域有必要開發(fā)和研究有效提高工 業(yè)微生物極限生長溫度的方法，以克服上述問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供分子伴侶蛋白的用途，用于使微生物在高于其極限生長溫 度的條件下生長；或用于提高微生物的高溫耐受性。 本發(fā)明的另一目的在于提供一種使微生物在高于其極限生長溫度的條件下生長的方法。 在本發(fā)明的第一方面，提供一種分子伴侶蛋白或其編碼基因的用途，用于使微生 物在高于其極限生長溫度的條件下生長。 在另一優(yōu)選例中，所述的"使微生物在高于其極限生長溫度的條件下生長"還包 括提高微生物高溫耐受性，或提高微生物在高溫下的生長能力。
在另一優(yōu)選例中，所述的"極限生長溫度"是指一種溫度，在該溫度下微生物可以 憑借自身系統(tǒng)生長和/或代謝，而當高于該溫度時，微生物生長和/或代謝無法正常進行。
在另一優(yōu)選例中，所述的分子伴侶蛋白是分離自古細菌的分子伴侶蛋白。
在另 一 優(yōu)選例中，所述的古細菌選自(但不限于)極端嗜熱古 菌 (hyperthermophilic archaea)，激 烈 火 球 菌 (Pyrococcus furiosus)， Pyrococcushorikoshii、Pyrococcus abyssi等。 在另一優(yōu)選例中，所述的分子伴侶蛋白是Prefoldin蛋白或其蛋白亞基。
在另一優(yōu)選例中，所述的Prefoldin蛋白或其蛋白亞基選自Prefoldin蛋白a 亞基，Prefoldin蛋白P亞基，Prefoldin蛋白a亞基和p亞基復(fù)合體(如Prefoldin蛋 白2個a亞基和4個13亞基的復(fù)合體)。 在另一優(yōu)選例中，所述的Prefoldin蛋白或其蛋白亞基選自Prefoldin蛋白P 亞基，Prefoldin蛋白a亞基和p亞基復(fù)合體。 在另一優(yōu)選例中，Prefoldin蛋白a亞基是(a)SEQ ID NO :1所示的氨基酸序 列的蛋白；或(b)將SEQ ID NO :1所示氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(優(yōu)選1_20個，更佳地 1-10個，更佳地1-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有使微生物在高于 其極限生長溫度的條件下生長功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)SEQ ID NO:l所示氨基酸序 列的蛋白的生物活性片段。 在另一優(yōu)選例中，Prefoldin蛋白P亞基是(a)SEQ ID NO :2所示的氨基酸序 列的蛋白；或(b)將SEQ ID NO :2所示氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(優(yōu)選1_20個，更佳地 1-10個，更佳地1-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有使微生物在高于 其極限生長溫度的條件下生長功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)SEQ ID NO :2所示氨基酸序 列的蛋白的生物活性片段。 在本發(fā)明的第二方面，提供一種使微生物在高于其極限生長溫度的條件下生長的 方法，所述方法包括將外源的分子伴侶蛋白的編碼基因?qū)氲剿鑫⑸锏募毎麅?nèi)，使所 述微生物細胞表達分子伴侶蛋白。 在另一優(yōu)選例中，所述將外源的分子伴侶蛋白的編碼基因?qū)氲剿鑫⑸锏募?胞內(nèi)的方法包括 (i)提供一重組表達載體，該重組表達載體含有一基因表達盒，所述表達盒含有外 源的分子伴侶蛋白的編碼基因；禾口 (ii)將(i)的重組表達載體轉(zhuǎn)化到所述微生物的細胞內(nèi)，從而使得所述細胞內(nèi)含 有所述重組表達載體或者其基因組中整合有所述外源的分子伴侶蛋白。
在另一優(yōu)選例中，所述的微生物選自(但不限于)原核微生物，真核細胞，古細菌。 在另一優(yōu)選例中，所述的微生物是大腸桿菌。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種制備能在高于其極限生長溫度下生長的微生物的 方法，所述方法包括將外源的分子伴侶蛋白的編碼基因?qū)氲剿鑫⑸锏募毎麅?nèi)，使所 述微生物細胞表達分子伴侶蛋白，從而獲得所述的微生物。 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。


圖1. PCR分別擴增3個基因。 其中，泳道l :PFDa基因；泳道2:PFDP基因；泳道3:含PFDP基因的目的基因。
圖2. SDS-PAGE分析純化獲得的3種蛋白。 其中，泳道1 :蛋白PFDa ;泳道2 :蛋白PFD P ;泳道3 :蛋白PFD。 圖3.重組蛋白(PFD a ( ■ ) ， PFD 13 ( ▲)，以及PFD a 213 4 (*))對溶菌酶活性保護
作用的比較，以空白( )為對照。其中 a.溶菌酶的濃度與添加的蛋白濃度之比為1 : 1.67;
b.溶菌酶的濃度與添加的蛋白濃度之比為1 : 1;
c.溶菌酶的濃度與添加的蛋白濃度之比為1 : 0.5。 圖4. 4種重組大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)加熱存活率的比較。其中，A : BL21 (DE) 3 (pET21b) ;B :BL21 (DE) 3 (pPFD a ) ;C :BL21 (DE) 3 (pPFD P ) D :BL21 (DE) 3 (pPFD)。
圖5.重組大腸桿菌(BL21 (DE3) (pET21b) ( ) ， BL21 (DE3) (pPFD 。)(■)， BL21(DE3) (pPFDP) (▲)及BL21(DE3) (pPFD) (o))過量表達相應(yīng)重組蛋白質(zhì)后在不同溫度
下的生長情況。其中，a :37。C ;b :46。C ;C :48。C ;d :50。C。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究，意外地發(fā)現(xiàn)將一些具有特定功能的蛋白重組表達在微
生物細胞內(nèi)可以有效地提高微生物的高溫耐受能力，使微生物在高于其極限生長溫度的條 件下生長。所述具有特定功能的蛋白優(yōu)選的是分子伴侶蛋白類蛋白。在此基礎(chǔ)上完成了本 發(fā)明。 如本文所用，所述的"極限生長溫度"是指一種溫度，在該溫度下微生物可以憑借 自身系統(tǒng)生長和/或代謝，而當高于該溫度時，微生物生長和/或代謝無法正常進行。對于 不同的微生物，該極限生長溫度是不同的，對應(yīng)于已知微生物的極限生長溫度是本領(lǐng)域公 知的。例如，大腸桿菌的極限生長溫度是44-46°C 。 如本文所用，所述的"高溫"是指高于微生物最適生長溫度的溫度；例如，大腸桿菌 的最適生長溫度是37°C ，所述的高溫是高于37°C的溫度，例如是40-50°C 。更特別地，所述 的"高溫"是指高于微生物本身固有的極限生長溫度的溫度；例如大腸桿菌的極限生長溫度 是44-46°C ，所述的高溫是高于44-46°C的溫度，例如是44_50°C (較佳地是46_49°C )。
如本文所用，所述的"使微生物在高于其極限生長溫度的條件下生長"也指提高 微生物高溫耐受性，或提高微生物在極端高溫下的生長能力。例如，一種微生物在培養(yǎng)溫 度達到46t:及其以上溫度時無法生長，在46°C以下可以生長，該46°C的溫度即是所述微生 物的極限生長溫度；而提高微生物的極限生長溫度后，該微生物仍可生長的最高溫度高于
546°C ，如達到47°C ， 48t:或更高。又例如， 一種微生物在常規(guī)情況下，最適生長溫度為37°C ，
高于該溫度不利于該微生物的生長，如在44t:生長速度緩慢、不生長或逐漸死亡；而提高 微生物的高溫耐受性后，其在44t:或更高的溫度下也能較好地生長。 本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)使來源于古細菌如極端嗜熱菌的分子伴侶蛋白 Prefoldin(也稱為pfu-prefoldin)重組表達(優(yōu)選過表達)在微生物細胞內(nèi)可以很有效 地提高微生物的高溫耐受能力，使微生物在高于其極限生長溫度的條件下生長。因此，本發(fā) 明提供了一種分子伴侶蛋白或其編碼基因的用途，用于使微生物在高于其極限生長溫度的 條件下生長。 基于本發(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明還提供了一種使微生物在高于其極限生長溫 度的條件下生長的方法，所述方法包括將外源的分子伴侶蛋白的編碼基因?qū)氲剿鑫?生物的細胞內(nèi)，使所述微生物細胞表達分子伴侶蛋白。 所述的分子伴侶蛋白可以是任何合適的來源于分子伴侶蛋白家族的蛋白，只要其 在被微生物重組表達后能夠顯著提高微生物高溫生長能力。 任何適合的分子伴侶蛋白均可應(yīng)用于本發(fā)明。所述的分子伴侶蛋白包括全長的 分子伴侶蛋白或其生物活性片段(或稱為活性片段)。經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取 代、缺失或添加而形成的分子伴侶蛋白的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。分子伴侶蛋白或 其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其 活性或保留了其部分的活性。適當替換氨基酸是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容 易地被實施，并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認識到，一般 來說，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個氨基酸基本上不會改變生物活性。見Watson等 MolecularBiology of The Gene，第四片反，1987， The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。
任何一種分子伴侶蛋白的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，分子伴 侶蛋白的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的分子伴侶蛋白的全 部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50 %的全長分子伴侶蛋白的 活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長分子伴侶蛋白的60%、70%、80%、 90%、95%、99%、或100%的活性。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的分子伴侶蛋白是分離自古細菌的分子伴侶蛋白。 所述的古細菌可以是但不限于極端嗜熱古菌(Hyperthermophilicarchaea)，包括但不限
于Pyrococcus furiosus，Pyrococcus horikoshii或Pyrococcus abyssi等。 作為本發(fā)明的特別優(yōu)選的方式，所述的分子伴侶蛋白是Prefoldin蛋白或其蛋 白亞基。Prefoldin是一種輔助伴侶，一般認為它能捕獲蛋白折疊中間態(tài)，將其轉(zhuǎn)運到II 型Ch即eronin，并與Ch即eronin—起使變性蛋白進行正確折疊復(fù)性。古細菌Prefoldin 僅有兩種亞基，a和|3亞基，而真核生物的Prefoldin由兩個不同的但相關(guān)的a類亞 基和四個相關(guān)的P類亞基組成(Leroux， M. R.等(1999) ;MtGimC， a novel archaeal
ch鄰erone related to the eukaryotic ch即eronin cofactorGimC/prefoldin. EMB0
J. 18,6730-6743)。來源于極端嗜熱古菌的Prefoldin由兩個a亞基和四個|3亞基組成類 似"水母"形狀的蛋白質(zhì)寡聚體，其結(jié)構(gòu)由兩個13折疊桶構(gòu)成，六個長長的巻曲的觸手伸展 到外面，觸手頂端露出疏水區(qū)域，有證據(jù)表明，巻曲是變性蛋白多價結(jié)合所要求的(Siegert
R.等(2000)Structure ofthe molecular chaperone prefoldin :unique interaction ofmultiple coiled coiltentacles with unfolded proteins. Cell, 103 (4) :621-632)。以往 的研究發(fā)現(xiàn)Pyrococcus horikoshii 0T3 (PhPFD)的Prefoldin能避免豬心檸檬酸合成酶 等在高溫環(huán)境下聚合失活，最近的研究還發(fā)現(xiàn)過量表達來源于Pyrococcus horikoshii0T3 的重組Prefoldin后能賦予大腸桿菌宿主一定的有機溶劑耐受性(0kochi M.等(2007) Increase of organic solvent tolerance by overexpression of manXYZ inEscherichia coli.Appl Microbiol Biotechnol. 73 :1394-1399)。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的Prefoldin蛋白或其蛋白亞基是Prefoldin蛋白 a亞基，Prefoldin蛋白P亞基，Prefoldin蛋白a亞基和p亞基復(fù)合體(如Prefoldin 蛋白2個a亞基和4個|3亞基的復(fù)合體，即Prefoldin a 2|34)。微生物細胞內(nèi)重組表達 Prefoldin蛋白P亞基或Prefoldin蛋白a亞基和|3亞基復(fù)合體具有特別優(yōu)異的提高微 生物耐熱性效果，使得微生物在高于其極限生長溫度的條件下正常生長和增殖。
更優(yōu)選地，Prefoldin蛋白a亞基是(a) SEQ ID NO :l所示的氨基酸序列的蛋白； 或(b)將SEQ ID NO :1所示氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(優(yōu)選1-20個，更佳地1-10個，更 佳地l-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高微生物高溫耐受性功能 的由(a)衍生的蛋白；或(c)SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的蛋白的生物活性片段。或者， Prefoldin蛋白P亞基是(a) SEQ IDNO :2所示的氨基酸序列的蛋白；或(b)將SEQ ID NO : 2所示氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(優(yōu)選1-20個，更佳地1-10個，更佳地1-5個)氨基酸 殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高微生物高溫耐受性功能的由(a)衍生的蛋 白；或(c)SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的蛋白的生物活性片段。 所述的Prefoldin蛋白的a亞基的氨基酸序列還可參見Genbank登錄號 NP_578104。所述的Prefoldin蛋白的P亞基的氨基酸序列還可參見Genbank登錄號 NP—578111. 1。 分子伴侶蛋白的編碼基因是容易獲得的，在蛋白已知的情況下，本領(lǐng)域人員均了 解如何獲得分子伴侶蛋白的編碼基因，例如可以采用PCR擴增的方式從基因組中獲得，獲 得采用化學(xué)合成的方式。例如，所述的Prefoldin蛋白a的亞基的編碼基因可參見Genbank 登錄號PF0375。所述的Prefoldin蛋白的P亞基的編碼基因可參見Genbank登錄號 PF0382。更優(yōu)選地，所述的Prefoldin蛋白的a亞基的編碼基因通過以下方式獲得以上 游引物5' -ATGGAAAACAATAAGGAATTGGAAAAGGTTGCT-3'(或5' -CGGGATCCATGGAAAACAATA AGGAATTGGAAAAGGTTGCT-3' (SEQ ID NO :3))和和下游引物5' -TCACTTCTTAAGCTTGAAGC-T CATTGCTTG-3'(或5' -GGAATTCTCACTTCTTAAGCTTGAAGC-TCATTGCTTG-3' (SEQ ID NO :4)) 從極端嗜熱古菌的(如Pyrococcus furiosus)基因組中PCR擴增獲得。所述的Prefoldin 蛋白的P亞基的編碼基因通過以下方式獲得以上游引物5' -ATGCAAAACATT
CCACCCCAAGT-3'(或5' -CGGGATCCATGCAAAACATTCCACCCCAAGT-3' (SEQ ID NO : 5));和下游引物5' -TCATCCAGCGGTTGGAGGTCTTAGGGCTGCCTGAATC-3 '(或5' -GGAATTC TCATCCAGCGGTTGGAGGTCTTAGGGCTGCCTGAATC-3' (SEQ ID NO :6))從極端嗜熱古菌的(如 Pyrococcus furiosus)基因組中PCR擴增獲得，該擴增產(chǎn)物編碼的蛋白是Prefoldin蛋白 的13亞基片段，該片段的表達具有較佳的提高微生物高溫耐受性的效果。此外，與上述擴 增獲得的基因序列簡并的序列也是可用的。 將外源的分子伴侶蛋白的編碼基因?qū)氲剿鑫⑸锏募毎麅?nèi)的方法是本領(lǐng)域人員熟知的。通常的方法是，獲得編碼所述的分子伴侶蛋白的生物活性片段的基因序列， 將其連入合適的表達載體，再轉(zhuǎn)入微生物細胞。更具體的步驟是(i)提供一重組表達載 體，該重組表達載體含有一基因表達盒，所述表達盒含有外源的分子伴侶蛋白的編碼基因； (ii)將(i)的重組表達載體轉(zhuǎn)化到所述微生物的細胞內(nèi)，從而使得所述細胞內(nèi)含有所述重 組表達載體或者其基因組中整合有所述外源的分子伴侶蛋白。通過選擇合適的表達載體， 或者在表達載體上選擇合適的啟動子或增強子等以促進分子伴侶蛋白的表達是本領(lǐng)域人 員熟知的。根據(jù)需要，所述的重組表達載體上還可含有其它外源蛋白的基因表達盒。
本發(fā)明的方法適用于多種微生物，所述的微生物可以是原核微生物，真核細胞，古 細菌等。所述微生物的一個具體的例子是大腸桿菌。所述的微生物可以是內(nèi)源含有完整的 自身分子伴侶蛋白系統(tǒng)，但在外源給予分子伴侶蛋白后，耐熱性進一步提高。
當所述的微生物是一種工業(yè)生產(chǎn)用的微生物時，所述的微生物還可內(nèi)源性或外源 性地表達其它的蛋白質(zhì)或產(chǎn)生其它代謝產(chǎn)物(如工業(yè)上有用的產(chǎn)物)。例如，所述的微生物 中可轉(zhuǎn)入至少一種分子伴侶蛋白以外的其它外源蛋白的編碼基因，并表達該外源蛋白。
在本發(fā)明的較佳實施例中，本發(fā)明人從極端嗜熱古菌的基因組DNA中克隆得到 Prefoldin基因，在大腸桿菌中獲得重組表達，并分別純化得到Prefoldin的a亞基、|3亞 基及成熟Profoldin蛋白。體外實驗結(jié)果顯示，在高溫條件下，13亞基及成熟Profoldin 蛋白的作用對于溶菌酶具有明顯的保護作用。并且還意外發(fā)現(xiàn)，Prefoldin單個亞基 或Prefoldin能夠顯著提高宿主大腸桿菌在高溫處理下的存活率。不僅如此，重組表達 PrefoldinP亞基或同時重組表達a亞基與|3亞基的大腸桿菌宿主細胞能夠在高于正常 大腸桿菌極限生長溫度的條件下生長。本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)首次表明并證實來源于極端嗜熱菌 的分子伴侶Prefoldin的重組表達能夠明顯地提高宿主菌的極限生長溫度。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于 (1)本發(fā)明首次表明并證實外源分子伴侶蛋白在微生物中的重組表達可以有效地 提高微生物的極限生長溫度。從而不需要復(fù)雜的選育步驟即可獲得大量的耐高溫的微生 物。 (2)本發(fā)明為未來微生物(特別是工業(yè)微生物)菌種的改造、應(yīng)用與優(yōu)化提供了一 個全新的途徑，并有助于深刻認識生命現(xiàn)象的本質(zhì)。 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計算。
I.材料和方法
材料 pET21b載體購自Novagen公司，Pfu DNA聚合酶、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA瓊脂糖電 泳膠回收試劑盒購自上海申能博彩生物科技有限公司，BamHI、 EcoRI、 Xbal、 Sail、 T4DNA連 接酶、Taq DNA聚合酶購自大連寶生物工程有限公司。
極端嗜熱古菌(Pyrococcus furiosus)基因組的提取 約0. 5g Pyrococcus furiosus DSM3638 (購自DSMZ ;德國菌種與細胞保藏中心)濕菌體中，加入7.5ml TNE(0.1M Tris HCl (pH7. 5) ， 0. 1M NaCl， 50mMEDTA) ， lml 10%十二 烷基肌氨酸鈉，lml 10% SDS，O. 5ml蛋白酶K(lmg/ml)，混合均勻，5(TC水浴保溫3小時，用 酚抽提2次，再用氯仿抽提1次，加入0. 42ml 5M NaCl，再加入2倍體積無水乙醇沉淀DNA， 12000rpm，離心10分鐘，37。C烘箱晾干，加入含0. lmg/ml RNase A的TE， 37。C水浴1小時以 除去RNA。 Pfu-Prefoldin的基因克隆及重組表達 比對Pyrococcus furiosus禾口 Pyrococcus horikoshii的序列，獲取編碼
PFDa亞基禾口 P亞基的基因(Kawarabayasi Y.等(1998) ;Complete sequence and
geneorganization of the genome of a hyPer—thermophilic archaebacteri咖，
Pyrococcushorikoshii 0T3 ;DNA Res. 5，55-76.)。 PFDa的引物為 上游引物(SEQ ID NO :3): 5' -CGGGATCCATGGAAAACAATAAGGAATTGGAAAAGGTTGCT-3'，
下游引物(SEQ ID NO :4): 5' -GGAATTCTCACTTCTTAAGCTTGAAGCTCATTGCTTG-3'; 以Pyrococcus furiosus基因組為模板PCR擴增，然后克隆到經(jīng)BamHI/EcoRI酶
切的pET21b載體上，得到含有PFD a亞基編碼序列的表達載體pPFD a 。 PFDP的引物為 上游引物(SEQ ID NO :5): 5' -CGGGATCCATGCAAAACATTCCACCCCAAGT-3'， 下游引物(SEQ ID NO :6): 5' -GGAATTCTCATCCAGCGGTTGGAGGTCTTAGGGCTGCCTGAATC-3'; 以Pyrococcus furiosus基因組為模板PCR擴增，然后克隆到經(jīng)BamHI/EcoRI酶
切的pET21b載體上，得到含有PFD 13亞基編碼序列的表達載體pPFD P 。
共表達質(zhì)粒PFD的構(gòu)建如下以pPFD P為模板，引物為 上游引物(SEQ ID NO :7): 5' -GCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGA-3'，
下游引物(SEQ ID NO :8): 5' -ACGCGTCGACGGAGCTCGAATTCTCATCCAGCGGTTG-3'; PCR擴增后克隆到經(jīng)Xbal/Sall酶切的pPFD a上，得到共表達載體pPFD。PCR擴增程序為94。C變性3min，94。C 30s，56。C 30s，72。C lmin， 30個循環(huán)，72。C延
伸10min，4。C保存。 測序正確的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到E. coli BL21(DE)3中，得到 E.coliBL21(DE)3(pPFDa)，E.coli BL21 (DE) 3 (pPFD P ) ， E. coli BL21 (DE) 3 (pPFD);同時轉(zhuǎn) 化pET21b作對照。 重組Prefoldin的表達和純化 挑取-70。C保存的菌株E. coli BL21(DE)3(pPFDa)，E.coli BL21 (DE) 3 (pPFD P )， E. coli BL21(DE)3(pPFD)于LB液體培養(yǎng)基(含100 y g/ml的氨芐青霉素)中，37"過夜培 養(yǎng)，以1%接種于同樣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3小時，至0D達到0. 6-0. 7時，加入IPTG至終濃度lmmol/L，誘導(dǎo)3小時，離心收集菌體，隨后重懸于超聲破碎緩沖液中(50mM Tris-HCl緩沖 液，含O. 5M NaCl， pH 8. 0)，置冰水中超聲破碎，4°C 15000g離心40分鐘，上清隨后上樣于 Ni2+親和層析柱，0-0. 5M咪唑梯度洗脫，獲得純化的蛋白。 將純化的PFD a亞基和PFD P亞基按照濃度1 : 2混合，8(TC水浴加熱30min，可 得到PFDa^4。 SDS-PAGE電泳分析蛋白的分布和純度。蛋白的濃度則用Bradford法測定，以牛血 清白蛋白作為標準。 Prefoldin對溶菌酶熱保護作用的測定 反應(yīng)體系為0. 1M磷酸氫鈉緩沖液，PH 7. O，溶菌酶的終濃度為0. 18mg/ml，分別以 1 : 1.67、1 : 1、1 : 0. 5的終濃度分別加入PFDa ，PFDP ，PFD，和重組蛋白PFDa2P4，9(TC 加熱0， 10， 20， 30， 40分鐘。 溶菌酶的作用底物為小球菌，O. 25mg/ml，緩沖體系為0. 1M磷酸鉀緩沖液，ffl 6. 2，樣品每隔10分鐘取樣，加入到小球菌反應(yīng)體系，在450nm處測得0D值每分鐘遞減 量，根據(jù)相對活力百分比可比較加熱前和加熱后的溶菌酶活性(參見Garcia-Orozco K. D. 等 (2005) Recombinant bacterial expression of the lysozymefrom the tobacco—hornworm Manduca sexta with activity at low temperatures. Biotechnol Lett. 27 :1075-1080.)。 重組大腸桿菌加熱后存活率的測定 挑取于-70 °C 儲存的菌種E.coli BL21 (DE)3(pET21b)、 E.coliBL21(DE)3(pPFDa)、 E.coli BL21 (DE) 3 (pPFD P ) 、 E. coli BL21 (DE) 3 (pPFD)于 20/100ml LB(含100iig/ml氨芐青霉素)錐形瓶中培養(yǎng)過夜，測0D600,根據(jù)吸光值以 相同接種量接到20/100ml LB培養(yǎng)基(含100 y g/ml氨芐青霉素)，待0D600為0. 6左 右，加IPTG至終濃度O. lmM，誘導(dǎo)2. 5h，各分裝400iU到4支試管中，于50°C水浴分別 加熱0、lh，再用滅過菌的0. 9 % NaCl稀釋到適當倍數(shù)，均勻涂布到LB平板上，過夜培 養(yǎng)后數(shù)菌落，計算細菌加熱后的存活率(參見Takeuchi S. (2006)Analytical assays of human HSP27and thermal—stresssurvival of Escherichia coli cells that overexpress it. Biochem Biophys ResComm皿.341 (4) :1252-1256; 或Plater M丄， 等(1996)Effects of site_directedmutations on the ch即erone-like activity of the alphaB-crystallin. J Biol Chem. Nov8 ;271 (45) :28558-66 ;或Soto A.等(1999) Heterologous expression of a plant smallheat—shock protein enhances Escherichia coli viability under heat and coldstress. Plant Physiol. ，120 (2) :521-528)。
重組大腸桿菌生長極限溫度的測定 挑取于-70 °C 儲存的菌種E.coli BL21 (DE)3(pET21b)、 E.coliBL21(DE)3(pPFDa)、 E.coli BL21 (DE) 3 (pPFD P ) 、 E. coli BL21 (DE) 3 (pPFD)于 20/100ml LB(含100iig/ml氨芐青霉素)錐形瓶中培養(yǎng)過夜，測0D600,根據(jù)吸光值以相 同接種量接到20/100ml LB培養(yǎng)基(含100 y g/ml氨芐青霉素)，待0D600為0. 6左右，加 IPTG至終濃度0. lmM，誘導(dǎo)2. 5h，各分裝20ml到4個250ml錐形瓶中，再加入20ml新鮮LB 培養(yǎng)基，分別于37t:、46t:、48t:、5(rC水浴搖床(150rpm)中進行培養(yǎng)，每隔1小時測定菌體 生長情況(0D600值)。
10
II.實施例 實施例l.重組Prefoldin的克隆、表達和純化 以P. furiosus基因組DNA為模板，PCR擴增得到PFD a 、 PFD P禾P PFD基因，鑒 定結(jié)果如圖1。將上述擴增產(chǎn)物分別克隆到載體pET21b上，測序正確后，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE)3中，IPTG誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE電泳分析顯示，PFD a禾P PFD P亞基的分子量分別 為16. 4kDa和13. 2kDa。根據(jù)其N末端的His-tag， Ni2+親和層析可獲得純度較高的蛋白， 鑒定結(jié)果如圖2。 將純化獲得的PFD a亞基和PFD P亞基蛋白按照濃度1 : 2混合，再于8(TC水浴 加熱30min，從而獲得重組蛋白PFD a 213 4。
實施例2.防止溶菌酶熱變性的測定 雞卵白溶菌酶常被用于作為模型蛋白，這是因為它的變性和折疊機理被研究得比 較詳細。當不同濃度的PFD加入一起孵育時，可以發(fā)現(xiàn)溶菌酶活性下降顯著變得緩慢，并且 這種保護效果隨著PFD加入量的增加而提高，如圖3。
實施例3.重組大腸桿菌加熱存活率的測定 將IPTG誘導(dǎo)后過量表達相應(yīng)重組蛋白質(zhì)的大腸桿菌菌株BL21 (DE) 3 (pET2 lb)、 BL21 (DE) 3(pPFD a ) 、BL21 (DE) 3 (pPFD P ) 、BL21 (DE) 3 (pPFD)轉(zhuǎn)移到50。C水浴中分別加熱0、 lh，以37t:為對照，再用滅過菌的0. 9% NaCl稀釋適當倍數(shù)后，均勻涂布到LB固體培養(yǎng)基 上，過夜培養(yǎng)后可以發(fā)現(xiàn)表達PFD a 、 PFD 13 、 PFD的菌株存活率分別較不表達PFD菌株提高 約2倍、12倍和10倍，如圖4。 SDS-PAGE結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，PFD蛋白質(zhì)為可溶性表達。實驗結(jié) 果表明過量表達的重組PFD大大提高了大腸桿菌宿主對高溫的耐受性。
實施例4.重組大腸桿菌生長極限溫度的測定 菌株E.coli BL21 (DE) 3(pET21b) 、 E. coli BL2 1 (DE) 3 (pPFD a )、 E. coliBL21(DE)3(pPFDe)、 E. coli BL21 (DE)3(pPFD)于LB(含100 ii g/ml氨節(jié)青霉素) 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當IPTG誘導(dǎo)表達相應(yīng)重組蛋白質(zhì)后，菌株E. coliBL21(DE)3(pPFD) 在37。C時的生長情況明顯好于對照。如圖5a。菌株E. coliBL21 (DE)3(pPFDa ) 、 E. coli BL21 (DE)3(pPFDP ) 、 E. coli BL21 (DE)3(pPFD)在46。C及48。C都可繼續(xù)生長，而對照菌株 E. coli BL21(DE)3(pET21b)則生長停滯，且OD值持續(xù)下降，如圖5b，圖5c。當培養(yǎng)溫度上 升至大腸桿菌致死溫度5(TC時，4種菌株均生長停止，如圖5d。 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。 序列表 〈110〉中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院 〈120〉 一種使微生物在高于其極限生長溫度下生長的方法 〈130>087472 〈160>8 〈170>PatentIn version 3. 3
〈210>1
〈211>146〈212>PRT〈213〉古細菌(Pyrococcusfuriosus)〈400>1MetGluAsn Asn Lys GluLeuGluLysVal Ala TyrGluTyrGinVal151015ValGinAla Gin Ala GinLeuLeuAlaGin Asn LeuGluLeuLeuSer202530LeuAlaGin Ala Glu ValGinThrValLys Glu ThrLeuGluAsnLeu354045MetLyslie Glu Asp GluAsnProGlulie Leu ValProlieGlyAla505560GlySerPhe Leu Lys GlyLyslieValAsp Lys AsnAsnAlalielie65707580SerValGly Ser Gly TyrAlaValGluLys Thr LeuGluAspAlalie859095LysTyrLeu Asp Glu ArglieLysGluTyr Asp GluAlalieArgLys100105110ThrGinGlu Ala Leu AsnGluLeuGinLys Arg AlaAlaGluLeuAla115120125LysLysAla Gin Glu lieGinGinLysGin Ala MetSerPheLysLeu130135140LysLys145〈210>2〈211>117〈212>PRT〈213〉古細菌(Pyrococcusfuriosus)〈400>2MetGinAsn lie Pro ProGinValGinAla Met LeuGlyGinLeuGlu151015SerTyrGin Gin Gin LeuGinLeuVallie Gin GinLysGinLysVal202530GinAlaAsp Leu Asn GluAlaLysLysAla Leu GluGlulieGluLys354045LeuThrAsp Asp Ala VallieTyrLysThr Val GlyThrLeulieVal505560LysThrThr Lys Glu LysAlaLeuGinGlu Leu LysGluLysValGlu65707580:0155] Thr Leu Glu Val Arg Leu Asn Ala Leu Asn Arg Gin Glu Gin Lys lie
:0156] 85 90 95
:0157] Asn Glu Lys lie Lys Glu Leu Thr Gin Lys lie Gin Ala Ala Leu Arg
:0158] 100 105 110
:0159] Pro Pro Thr Ala Gly
:0160] 115
:0161] 〈210>3
:0162] 〈211>41
:0163] 〈212>DNA
:0164] 〈213>人工序列
:0165] 〈221〉misc—feature
:0166] 〈223〉引物
:0167] 〈400>3
:0168] cgggatccat gg朋朋c朋t 3agg朋ttgg朋朋ggttgc t 41
:0169] 〈210>4
:0170] 〈211>37
:0171] 〈212>DNA
:0172] 〈213>人工序列
:0173] 〈221>misc—feature
:0174] 〈223〉引物
:0175] 〈400>4
:0176] ggaattctca cttcttaagc ttgaagctca ttgcttg 37
:0177] 〈210>5
:0178] 〈211>31
:0179] 〈212>DNA
:0180] <213>人工序列
:0181] 〈221〉misc_feature
:0182] 〈223〉引物
:0183] 〈400>5
:0184] cgggatccat gcaaaacatt ccaccccaag t 31 <210>6 〈211〉44 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈221>misc—feature 〈223〉引物 〈400>6 ggaattctca tccagcggtt ggaggtctta gggctgcctg aatc 44 〈210>7
〈211>35<212>DNA〈213〉人工序列〈22l〉misc—feature〈223〉引物<400>7gctctagaaa taattttgtttaactttaag〈210>8〈211>37<212>DNA〈213〉人工序列〈22l>misc—feature〈223〉引物<400>8acgcgtcgac ggagctcgaattctcatccagcggttg
權(quán)利要求
一種分子伴侶蛋白或其編碼基因的用途，用于使微生物在高于其極限生長溫度的條件下生長。
2. 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的分子伴侶蛋白是分離自古細菌的分 子伴侶蛋白。
3. 如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的古細菌選自極端嗜熱古菌，激烈火 球菌，Pyrococcus horikoshii， Pyrococcus abyssi。
4. 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的分子伴侶蛋白是Prefoldin蛋白或其蛋白亞基。
5. 如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的Prefoldin蛋白或其蛋白亞基選自 Prefoldin蛋白a亞基，Prefoldin蛋白P亞基，或Prefoldin蛋白a亞基和p亞基復(fù) 合體。
6. —種使微生物在高于其極限生長溫度的條件下生長的方法，所述方法包括將外源 的分子伴侶蛋白的編碼基因?qū)氲剿鑫⑸锏募毎麅?nèi)，使所述微生物細胞表達分子伴侶 蛋白。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述將外源的分子伴侶蛋白的編碼基因?qū)?入到所述微生物的細胞內(nèi)的方法包括(i) 提供一重組表達載體，該重組表達載體含有一基因表達盒，所述表達盒含有外源的 分子伴侶蛋白的編碼基因；禾口(ii) 將(i)的重組表達載體轉(zhuǎn)化到所述微生物的細胞內(nèi)，從而使得所述細胞內(nèi)含有所 述重組表達載體或者其基因組中整合有所述外源的分子伴侶蛋白。
8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的微生物選自原核微生物，真核細胞， 古細菌。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的微生物是大腸桿菌。
10. —種制備能在高于其極限生長溫度下生長的微生物的方法，所述方法包括將外 源的分子伴侶蛋白的編碼基因?qū)氲剿鑫⑸锏募毎麅?nèi)，使所述微生物細胞表達分子伴 侶蛋白，從而獲得所述的微生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使微生物在高于其極限生長溫度下生長的方法。本發(fā)明還提供了分子伴侶蛋白的用途。本發(fā)明為微生物(特別是工業(yè)微生物)菌種的改造、應(yīng)用與優(yōu)化提供了全新的途徑。
文檔編號C12N15/31GK101748134SQ20081020355
公開日2010年6月23日 申請日期2008年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日
發(fā)明者張毅, 楊勝利, 陳輝 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院