專利名稱：：一種鑒別膽管正常上皮細(xì)胞或膽管癌細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，是一種用于鑒別正常膽管上皮細(xì)胞或膽管細(xì)胞癌細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
：小RNA是一種長度大約為1825個核苷酸的RNA小分子，自參與調(diào)控線蟲時序發(fā)育的小RNA分子lin-4與let-7被發(fā)現(xiàn)以來,至2004年初已有700多個線蟲、果蠅、人、擬南芥等真核生物小RNA被報道。目前根據(jù)國際權(quán)威小RNA數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，人體中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)695個小RNA分子(SangerInstitute,Release12.0)。小RNA的特點(diǎn)主要表現(xiàn)為它的保守性、基因簇集現(xiàn)象和特異性表達(dá)。由于小RNA分子本身長度很短，很難被機(jī)體中RNA酶降解，因此它在不同類型組織中的豐度非常穩(wěn)定，有利于應(yīng)用各種方法對其表達(dá)水平進(jìn)行檢測。測定的具體方法為將相應(yīng)的組織樣本勻漿后，抽提組織中總的RNA，再通過定量PCR、表達(dá)譜芯片或液相芯片技術(shù)分別檢測不同小RNA分子在組織中的表達(dá)豐度。有人通過使用上述技術(shù)對小RNA表達(dá)水平進(jìn)行大規(guī)模篩查后發(fā)現(xiàn)肺癌、大腸癌、白血病、肝癌、腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌等組織中許多小RNA的表達(dá)水平與正常組織相比均發(fā)生了明顯的改變。有報道指出，小RNA分子let-7表達(dá)水平的顯著降低與非小細(xì)胞肺癌病人更差的預(yù)后密切相關(guān)，let-7表達(dá)水平越低，其預(yù)后越差，術(shù)后生存期越短[TakamizawaJ,KonishiH，YanagisawaK,TomidaS，OsadaH,EndohH，HaranoT,YatabeY,NaginoM,NimuraY,MitsudomiT，TakahashiT.CancerRes.2004Jun1;64(11):3753-3756]。還有文獻(xiàn)報道，不同組織來源的樣本，其小RNA表達(dá)譜差異明顯[LuJ，GetzG，MiskaEA,Alvarez-SaavedraE，LambJ，PeckD,Sweet-CorderoA,Ebert已L,MakRH，F(xiàn)errandoAA，DowningJR,JacksT'HorvitzHR，GolubTR.Nature.2005Jun;435(7043):834-838]。但至今未見將小RNA的表達(dá)豐度用于鑒別正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌細(xì)胞的報道。
發(fā)明內(nèi)容鑒于臨床上出現(xiàn)正常組織和惡性腫瘤組織難以區(qū)分的問題，特別是正常膽管上皮細(xì)胞和膽管癌細(xì)胞容易相混，本發(fā)明提供一種用一組標(biāo)志性小RNA的表達(dá)豐度鑒別正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌細(xì)胞的方法。本發(fā)明根據(jù)不同組織來源的樣本，其相關(guān)小RNA的表達(dá)豐度存在明顯差異的特點(diǎn)，將正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌細(xì)胞的小RNA表達(dá)豐度的數(shù)據(jù)分別進(jìn)行篩選、歸類，用一組正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌細(xì)胞的標(biāo)志性小RNA的表達(dá)豐度值Ct減去18sRNA的表達(dá)豐度值所得的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)豐度值A(chǔ)Ct值作為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)，采用聚類分析軟件GeneCluster3.0，分別輸入標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)和待測樣本的標(biāo)志性小RNA的ACt值，由顯示的聚類分析圖譜，來判定該樣本是否來源于正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌細(xì)胞，若彩色圖譜顯示該樣本歸入膽管癌細(xì)胞部分，說明其來源于膽管癌組織；若顯示該樣本歸入正常膽管上皮細(xì)胞部分，說明其來源于正常膽管上皮細(xì)胞；若顯示其既不歸入膽管癌細(xì)胞部分，也不歸入正常膽管上皮細(xì)胞部分，就說明該樣本既非來源于膽管癌組織，也非來源于正常膽管上皮組織。本發(fā)明方法如下1.制備總RNA:將同種不同體的正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌樣本若干例，分別用lnvitrogen公司的RNA抽提液TriZol按常規(guī)抽提總RNA，并測定各例正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌樣本相應(yīng)的總RNA的濃度。2.小RNA表達(dá)豐度的測定使用AppliedBiosyste公司的小RNA檢測試劑盒(TaqManMicroRNAAssayHumanPanel-EarlyAccessKit,P/N:4365409)，以及熒光實時定量PCR技術(shù)，按常規(guī)分別檢測各例正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌樣本中總RNA樣本中的156種小RNA的表達(dá)豐度，各例分別得156種小RNA的表達(dá)豐度值(Ct值)。3.篩選標(biāo)志性小RNA:用上述方法先檢測各例正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌樣本的總RNA中18sRNA的表達(dá)豐度值，將其作為內(nèi)參照，再將上述156種小RNA的表達(dá)豐度值(Ct)減去18sRNA的表達(dá)豐度值后得標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)豐度值(ACt)。將各例正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌樣本的156種小RNA中相應(yīng)小RNA的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)豐度值(ACt)之差A(yù)ACt的閾值設(shè)定為3.5，使用數(shù)據(jù)顯著性差異分析軟件(SAM，http:〃www-stat.stanford.edu/tJbs/SAM/)，從這156種小RNA中篩選得到AACt>3.5的13種小RNA，它們是mir-21、mir-374、mir-25、mir-15a、mir國193、mir陽106a、mir畫204、mir-198、mir-337、mir畫302d、mir匿320、mir-371、mir-184，以這13種小RNA作為鑒別正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌細(xì)胞樣本的標(biāo)志性小RNA。取各例13種小RNA的ACt值，分別將各例正常膽管上皮細(xì)胞和膽管癌樣本的13種小RNA的ACt值歸為一組，作為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)(見表1、表2)用于鑒別無法判定惡性程度的膽管細(xì)胞樣本是否為正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌細(xì)胞。4.鑒別正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌細(xì)胞的方法應(yīng)用數(shù)據(jù)聚類分析軟件(GeneCluster3.0，http:〃bonsai.ims.u-tokyo.ac.jp/mdehoon/software/cluster/),分另ij輸入上述木示準(zhǔn)數(shù)據(jù)(見表1、表2),和未知樣本中13種標(biāo)志性小RNA的ACt值，由軟件通過聚類分析程序?qū)⑵溥M(jìn)行歸類，如果落入正常膽管細(xì)胞標(biāo)志性小RNAACt值的范圍內(nèi)，則聚類分析彩色圖譜顯示其歸入正常膽管上皮細(xì)胞部分，說明該樣本來源于正常膽管上皮細(xì)胞；如果落入膽管癌細(xì)胞標(biāo)志性小RNAACt值的范圍內(nèi)，則聚類分析彩色圖譜顯示其歸入膽管癌部分，說明該樣本來源于膽管癌細(xì)胞樣本。實驗證明，本發(fā)明方法能從無法判定惡性程度的膽管細(xì)胞樣本中鑒別出是否為正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌細(xì)胞，具有檢測方便、準(zhǔn)確率高的優(yōu)點(diǎn)。圖1正常膽管上皮細(xì)胞和膽管癌小RNAACt值聚類分析圖譜圖2K值法對應(yīng)用13種標(biāo)志性小RNAACt值作鑒別的可靠性交叉驗證圖圖3(l，II)應(yīng)用表1、2的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)鑒別正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌細(xì)胞的聚類分析圖譜具體實施方式現(xiàn)結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明作詳細(xì)描述。實施例1.建立鑒別正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌細(xì)胞標(biāo)志性小RNA的ACt標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)。1.RNA抽提選取27例膽管癌組織和10例正常膽管上皮組織，每例樣本分別取100mg組織加入1mlTriZol(lnvitrogen公司)，用液氮研磨充分研碎組織塊。加入約1/5體積的氯仿，上下顛倒充分混勻1分鐘左右，室溫下靜置5分鐘。4°C、12，000rpm離心15分鐘后小心轉(zhuǎn)移上清液入新的1.5ml離心管，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4'C、12000rpm離心10分鐘后，去上清，向沉淀中加入2/5體積的70%乙醇，4°C、12000rpm離心洗滌沉淀5分鐘。去上清，將沉淀室溫晾干后加入適量無RNA酶的水充分溶解，測定總RNA的濃度。2.實時定量PCR反應(yīng)使用AppliedBiosyste公司的小RNA檢測試劑盒(TaqManMicroRNAAssayHumanPanel-EarlyAccessKit,P/N:4365409)，禾口熒光實時定量PCR技術(shù)，分別檢測37例樣本中各例的156種小RNA的表達(dá)豐度值(Ct)。3.實時定量PCR數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理用上述方法先檢測各例正常膽管上皮細(xì)胞或膽管細(xì)胞癌的總RNA中18sRNA的表達(dá)豐度值，將其作為內(nèi)參照，再將上述156種小RNA的表達(dá)豐度值(Ct)減去18sRNA的表達(dá)豐度值后得標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)豐度值(ACt)。4.標(biāo)志性小RNA的篩選將上述各例正常膽管上皮細(xì)胞與膽管癌的156種小RNA中相應(yīng)小RNA的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)豐度值(ACt值)之差A(yù)ACt的閾值設(shè)定為3.5，使用數(shù)據(jù)顯著性差異分析軟件(SAM，http:〃www-stat.stanford.edu/tibs/SAM/)，篩選出ACt〉3.5的13種小RNA，它們是mir-21、mir-374、mir-25、mir-15a、mir-193、mir-106a、mir畫204、mir曙198、mir-337、mir隱302d、mir-320、mir國371、mir誦184，以這13種小RNA作為鑒別正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌細(xì)胞的標(biāo)志性小RNA，取各例13種小RNA的ACt值，分別將各例正常膽管上皮細(xì)胞或膽管細(xì)胞癌的13種小RNA的ACt值歸為一組，作為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)(見表1、表2)用于鑒別組織樣本是否為正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌細(xì)胞。表1.10例正常膽管上皮細(xì)胞(cholangjocyte)的13種小RNA的△Ct值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>將上述表1、2的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)輸入聚類分析軟件(GeneCluster3.0，http7/bonsai.ims.u-tokyo.ac.jp/~mdehoon/software/cluster/)f尋至(J正常月旦管上皮細(xì)胞和膽管癌小RNAACt值聚類分析圖譜，見圖1。5.標(biāo)志性小RNAACt值作鑒別的可靠性的交叉驗證使用表達(dá)譜預(yù)測分析軟件(Predictionanalysismicroarray,PAM)對使用本發(fā)明表1和表2的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)鑒別正常膽管上皮細(xì)胞和膽管癌細(xì)胞的可靠性進(jìn)行K值法交叉驗證。結(jié)果見圖2、圖3，由圖2和圖3可見，本發(fā)明方法鑒別的準(zhǔn)確率接近100%。實施例2.用本發(fā)明方法鑒別受檢組織樣本取2份受檢組織樣本，分別以每100mg組織加入1mlTriZol抽提樣本中總的RNA，應(yīng)用實時定量PCR技術(shù)測定18sRNA的表達(dá)豐度值作為內(nèi)參照。另以5ng/孔/為標(biāo)準(zhǔn)，使用AppliedBiosystem公司小RNA檢測試劑盒，測定13個標(biāo)志性小RNA的表達(dá)豐度值(Ct)。將相應(yīng)小RNA的表達(dá)豐度值Ct減去18sRNA的表達(dá)豐度值，得到標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)豐度值(ACt)。將待測樣本中13種標(biāo)志性小RNA的ACt值與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)分別輸入聚類分析軟件(GeneCluster3.0)，并進(jìn)行如下設(shè)置設(shè)定。/。present參數(shù)大于等于80，設(shè)定連鎖方式為averagelinkage,輸出聚類分析圖譜，并以此來判定各樣本的起源。結(jié)果1號樣本在聚類分析圖譜上顯示其歸入膽管癌部分，說明相應(yīng)小RNAACt值落入膽管癌標(biāo)志性小RNAACt值的范圍內(nèi)，該樣本來源于膽管癌(見圖3，I);2號樣本在聚類分析圖譜上顯示其歸入正常膽管上皮細(xì)胞部分，說明相應(yīng)小RNA△Ct值落入正常膽管上皮細(xì)胞標(biāo)志性小RNA△Ct值的范圍內(nèi)，該樣本來源于正常膽管上皮細(xì)胞(見圖3，ll)。權(quán)利要求1.一種鑒別正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌細(xì)胞的方法，其特征在于用一組正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌細(xì)胞的標(biāo)志性小RNA的表達(dá)豐度值Ct減去18sRNA的表達(dá)豐度值所得的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)豐度值ΔCt值作為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)，采用聚類分析軟件GeneCluster3.0，分別輸入標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)和待測樣本的相應(yīng)標(biāo)志性小RNA的ΔCt值，并進(jìn)行如下設(shè)置設(shè)定％present參數(shù)大于等于80，設(shè)定連鎖方式為averagelinkage，由顯示的聚類分析圖譜，來判定其是否為正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌細(xì)胞，所說的標(biāo)志性小RNA分別為mir-21、mir-374、mir-25、mir-15a、mir-193、mir-106a、mir-204、mir-198、mir-337、mir-302d、mir-320、mir-371、mir-184。2.按權(quán)利要求1所述的鑒別正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌細(xì)胞的方法，其特征在于所說的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)如表1和表2所示；表1.10例正常膽管上皮細(xì)胞(cholangiocyte)的13種小RNA的ACt值<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>全文摘要本發(fā)明是一種鑒別正常膽管上皮細(xì)胞或膽管癌細(xì)胞的方法。本方法用一組膽管癌細(xì)胞和正常膽管上皮細(xì)胞的標(biāo)志性小RNA的表達(dá)豐度值Ct減去18sRNA的表達(dá)豐度值所得的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)豐度值ΔCt值作為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)，采用聚類分析軟件GeneCluster3.0，分別輸入標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)和待測樣本的標(biāo)志性小RNA的ΔCt值，由顯示的聚類分析圖譜來作出判定，若彩色圖譜顯示該樣本歸入膽管癌細(xì)胞部分，說明其來源于膽管癌組織；若顯示該樣本歸入正常膽管上皮細(xì)胞部分，說明其來源于正常膽管上皮細(xì)胞；若顯示既不歸入正常膽管癌細(xì)胞部分，也不歸入正常膽管上皮細(xì)胞部分，就說明該樣本既非膽管癌細(xì)胞，也非正常膽管上皮細(xì)胞。本方法鑒別方便，準(zhǔn)確率高。文檔編號C12Q1/68GK101407842SQ20081020361公開日2009年4月15日申請日期2008年11月28日優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日發(fā)明者亮李,王紅陽,良胡,鄢和新,磊陳申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)