專利名稱：：用于高通量藥物篩選的微流控細(xì)胞陣列芯片、方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于高通量藥物篩選的微流控細(xì)胞陣列芯片、制備方法及應(yīng)用，屬于微流控芯片
技術(shù)領(lǐng)域：
，。
背景技術(shù)：
：高通量藥物分析技術(shù)主要用于藥物研究的發(fā)現(xiàn)階段，這一階段也是藥物研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。自20世紀(jì)90年代以來因現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展而出現(xiàn)的以96孔板為基礎(chǔ)的高通量篩選由于其快速、高效等特點，適合初步篩選，被國際大多數(shù)藥物研究機構(gòu)廣泛采用，并得到快速的發(fā)展，已成為藥物篩選的主要技術(shù)手段之一。但是基于這種方式的細(xì)胞水平藥物篩選存在一些局限，如高通量篩選一般通過多孔板(96孔和384孔板)進行，消耗的試劑量比較大，雖然微孔板可以減少試劑的用量，可其微體積的溶液易蒸發(fā)，而且微量樣品液體的分配和操作難度大、精度要求高，此外高通量篩選的設(shè)備體積龐大、價格昂貴。這些很大程度限制了高通量篩選的普及應(yīng)用。因此，高通量篩選技術(shù)的微型化、自動化和成本化是未來發(fā)展的必然趨勢。微流控芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代初由瑞士的Manz和Widmer首次提出的，由于其具有分析速度快、試劑消耗少、易于集成和高通量分析等諸多優(yōu)點，在過去的二十年里，微流控芯片在生物和化學(xué)樣品的分析處理方面取得了顯著的進展，近幾年來微流控芯片技術(shù)的研究人員把研究方向轉(zhuǎn)移到了更為復(fù)雜的生物系統(tǒng)，例如利用微流控芯片進行細(xì)胞分析的研究.這樣微流控芯片對于細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)學(xué)、藥學(xué)和組織工程等領(lǐng)域的探索研究起到越來越重要的作用。微流控芯片技術(shù)在細(xì)胞研究方面具有特殊的優(yōu)勢，例如微通道的尺寸與細(xì)胞尺寸相當(dāng)，可以精確的控制微環(huán)境的成分、溫度等因素，模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的情況，同時增強實驗的操作性。而且在微流控芯片中可以通過設(shè)計特定的二維甚至三維結(jié)構(gòu)和精密加工集成微閥微電極等器件實現(xiàn)細(xì)胞的培養(yǎng)、操縱、定位、溶解、檢測等多種功能，設(shè)計靈活多樣，各具特色。目前，將微流控芯片技術(shù)用于細(xì)胞研究和藥物篩選等方面已有不少報道，如HimgP.J.等在文獻(xiàn)(HungP.J.，LeeRJ.，SabounchiP.，AghdamN.，LinR.，LeeL.R，Anovelhighaspectratiomicrofluidicdesigntoprovideastableanduniformmicroenvironmentforcellgrowthinahighthroughputmammaliancellculturearray.LabChip，2005,5，44-48)中通過微加工技術(shù)制作了高寬比的細(xì)胞培養(yǎng)池陣列，進行了細(xì)胞的長時間穩(wěn)定培養(yǎng)觀察，實現(xiàn)了芯片內(nèi)高通量細(xì)胞陣列的培養(yǎng)；Thorsen等在文獻(xiàn)(WangZ.，KimM.C.，MarquezM.，ThorsenT.,High-densitymicrofluidicarraysforcellcytotoxicityanalysis.LabChip,2007，7，740-745)中制作了高密度的細(xì)胞培養(yǎng)陣列芯片，在芯片實現(xiàn)了多種化合物對多種細(xì)胞的并行毒性分析，不僅可以實時檢測細(xì)胞形態(tài)和活性的變化，而且操作簡便，試劑消耗量大大減少，更容易實現(xiàn)高通量和自動化；NannanYe等人在文獻(xiàn)(NannanYe，JianhuaQin，WeiweiShi，XinLiu，BingchengLin，Cell-basedhighcontentscreeningusinganintegratedmicrofluidicdevice，Chip,2007，7，1696—1704)中構(gòu)建了一種集成化細(xì)胞水平的藥物篩選微流控芯片，該芯片集濃度梯度稀釋和加樣、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞刺激以及細(xì)胞標(biāo)記等單元操作于一體，實現(xiàn)了肝癌細(xì)胞多種參數(shù)測量的高內(nèi)涵藥物篩選。目前的研究并沒有在芯片細(xì)胞的區(qū)域分布和芯片微流體的操控等方面做深入和系統(tǒng)化的研究報道，而這些是微流控技術(shù)在細(xì)胞高通量藥物篩選的研究應(yīng)用的關(guān)鍵和難點。這些關(guān)鍵和難點正是本發(fā)明構(gòu)思的出發(fā)點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種適用于高通量藥物篩選的微流控細(xì)胞陣列芯片及其制備方法，即通過對微系統(tǒng)加工技術(shù)的SU-8模具制作和PDMS芯片制作等工藝的研究，設(shè)計制作具有多層結(jié)構(gòu)的可以實現(xiàn)對細(xì)胞和微流體進行操控的的微流控細(xì)胞陣列芯片，構(gòu)建成高通量的細(xì)胞藥物篩選的平臺。本發(fā)明采用微加工技術(shù),即"多次曝光一次顯影"的SU-8雙層模具工藝和雙層PMDS粘合工藝，設(shè)計和制作微流控細(xì)胞陣列芯片，在芯片上制作獨特的培養(yǎng)腔陣列及其微通道，進行多種細(xì)胞的固定分布和共培養(yǎng)，集成微閥單元實現(xiàn)對芯片微流體的控制，并在芯片上設(shè)計藥物濃度梯度結(jié)構(gòu)，形成不同濃度的藥物溶液，不同濃度的藥物并行作用不同的細(xì)胞，獲得多參數(shù)的藥物細(xì)胞參數(shù)，為了藥物篩選和藥物細(xì)胞研究提供了一個理想的研究方法和平臺。從而建立高通量的細(xì)胞藥物篩選的平臺。具體地說，本發(fā)明的目的是通過微流控陣列芯片設(shè)計和制造、芯片內(nèi)細(xì)胞的導(dǎo)入、區(qū)域分布和固定培養(yǎng)及藥物梯度的形成和刺激、細(xì)胞培養(yǎng)活性和藥物作用的檢測三個主要步驟實現(xiàn)的。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的1)根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和高通量藥物篩選結(jié)合微流控芯片技術(shù)的特點，設(shè)計細(xì)胞陣列芯片，通過對"多次曝光，一次顯影"的SU-8負(fù)性光刻膠工藝以及多層PDMS(聚二甲基硅氧垸)鍵合工藝的研究，設(shè)計并制作了具有高深寬比的多層結(jié)構(gòu)的微流控細(xì)胞陣列芯片，該芯片由三層結(jié)構(gòu)組成，自上而下依次為閥控制通道層、流體通道層和適合細(xì)胞貼壁生長的玻璃層，包含以下核心單元C型壩結(jié)構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)池陣列，細(xì)胞迸樣和培養(yǎng)液微通道，藥物梯度濃度通道網(wǎng)絡(luò)，閥控制通道以及進出口等。其中，(a)所述流體通道層和玻璃層通過離子鍵合構(gòu)成流體通道單元，所述流體通道單元包括細(xì)胞培養(yǎng)池構(gòu)成的細(xì)胞培養(yǎng)池陣列，相應(yīng)數(shù)目的橫向進樣管道和出樣管道，相應(yīng)數(shù)目的縱向進樣管道和出樣管道；所述橫向進樣管道和出樣管道分別用于藥物的進樣及排出，縱向進樣管道和出樣管道分別用于待檢測細(xì)胞的進樣及排出；所述細(xì)胞培養(yǎng)池中有一個C型壩結(jié)構(gòu)，所述C型壩開口朝向細(xì)胞進樣方向，壩頂(底)與玻璃層間有一小于細(xì)胞直徑的狹縫，以控制進樣細(xì)胞的分布；(b)所述閥控制通道層與流體通道層通過PDMS熱鍵合構(gòu)成閥控制單元，所述閥控制單元為位于相鄰細(xì)胞培養(yǎng)池之間的管道上方、用于阻斷細(xì)胞培養(yǎng)池間的聯(lián)系的橫向閥組和縱向閥組，所述橫向閥組和縱向闊組均為由PDMS與PDMS薄膜構(gòu)成的密閉的空腔，所述空腔分別與壓力施加裝置相連，當(dāng)對閥空間施加壓力后，PDMS薄膜發(fā)生形變，阻擋流體通道層的液體流動，從而實現(xiàn)相應(yīng)閥組對流體通道層橫向或縱向通道的封閉；當(dāng)壓力移除后，PDMS薄膜恢復(fù)原形，從而恢復(fù)流體層通道橫向或縱向的液體流通；(c)所述芯片的流體通道單元還包括藥物濃度梯度網(wǎng)絡(luò)，所述藥物濃度梯度網(wǎng)絡(luò)為多級通道組組成的網(wǎng)絡(luò)，所述通道組的通道數(shù)量從進樣孔向細(xì)胞培養(yǎng)池陣列依次增加至與縱向閥垂直的細(xì)胞培養(yǎng)池陣列方向的細(xì)胞培養(yǎng)池數(shù)目相同，所述進樣孔的數(shù)目大于1個小于縱向閥垂直的細(xì)胞培養(yǎng)池陣列方向的細(xì)胞培養(yǎng)池數(shù)目；(d)所述進樣孔的數(shù)目為2;(e)所述細(xì)胞培養(yǎng)池陣列為6X6細(xì)胞培養(yǎng)池陣列；(f)所述流體層的通道高為50(im;寬為100(am;培養(yǎng)池為一邊長600pm的正6邊形，中間有一個半徑為200pm的C型壩結(jié)構(gòu)，壩高45|im，寬50jim;(g)所述壓力施加裝置為注射器。2)采用微量注射泵將培養(yǎng)液、多種細(xì)胞(血管內(nèi)皮細(xì)胞，正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞)及其它成分導(dǎo)入芯片中，利用設(shè)計的C型壩結(jié)構(gòu)及微流體特性以及閥控制作用將細(xì)胞分布在特定的區(qū)域，利用細(xì)胞培養(yǎng)箱的條件進行細(xì)胞在片培養(yǎng)。3)導(dǎo)入治療腫瘤的藥物，藥物在芯片的藥物梯度濃度網(wǎng)絡(luò)中形成6個不同濃度的藥物成分，分別與芯片的培養(yǎng)池陣列的細(xì)胞作用，通過熒光探針和熒光顯微鏡檢測細(xì)胞的活性，分析特異熒光探針標(biāo)記的胞內(nèi)物質(zhì)各個參數(shù)(線粒體膜電位和細(xì)胞膜等)的改變，通過這些參數(shù)的變化的分析來研究藥物對細(xì)胞的藥物作用機理。本發(fā)明構(gòu)建的微流控細(xì)胞陣列芯片能夠很好地控制細(xì)胞在芯片內(nèi)的生長分布，有效地解決陣列芯片細(xì)胞分布無序的難題。通過雙層PDMS鍵合將微閥器件集成到芯片上，通過對閥控制網(wǎng)絡(luò)的操控實現(xiàn)陣列芯片流體的控制。這些工藝的研究有效地解決了微流控芯片在基于細(xì)胞研究方面的一些關(guān)鍵問題。芯片還設(shè)計了藥物濃度梯度網(wǎng)絡(luò)，形成穩(wěn)定的梯度藥物濃度，以便研究不同濃度藥物對細(xì)胞的毒性作用。微流控細(xì)胞陣列芯片可用于細(xì)胞藥物篩選的高通量、低成本的快速篩選，同時也可用于一些細(xì)胞相關(guān)的研究。本發(fā)明不僅闡述了一種基于微流控技術(shù)的高通量藥物篩選平臺的構(gòu)建方法，還提供了多層多結(jié)構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)陣列芯片的制作方法(詳見實施例l)。本發(fā)明提供的用于高通量藥物篩選的微流控細(xì)胞陣列芯片可用于不同濃度藥物并行作用多種細(xì)胞，進行高通量細(xì)胞藥物篩選。芯片通過C型的三維壩結(jié)構(gòu)將進樣細(xì)胞攔截在芯片的細(xì)胞培養(yǎng)的固定區(qū)域，設(shè)計了藥物濃度梯度結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生6個不同濃度的藥物刺激細(xì)胞，同時芯片還集成了PDMS微閥網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)了芯片通道內(nèi)微流體的操控。微流控細(xì)胞陣列芯片可以實現(xiàn)低試劑消耗、高通量的多種細(xì)胞共培養(yǎng)，并行分析不同藥物濃度對不同細(xì)胞的刺激作用及其在片的實時觀察與檢測，為高通量藥物篩選和細(xì)胞-藥物研究提供了一個全新的技術(shù)平臺和方法。圖1為本發(fā)明的微流控細(xì)胞陣列芯片總體結(jié)構(gòu)圖，其中，1為6X6細(xì)胞培養(yǎng)池陣列；2為藥物梯度濃度網(wǎng)絡(luò)；3和4分別為縱向閥組和橫向閥組。圖2為本發(fā)明的微流控細(xì)胞陣列芯片三層結(jié)構(gòu)截面圖；其中，5為閥控制通道層；6為流體通道層；7為玻璃層。圖3為本發(fā)明的微流控細(xì)胞陣列芯片的細(xì)胞進樣、閥陣列控制的示意圖；其中，8為C型環(huán)壩結(jié)構(gòu)；9為細(xì)胞進樣時縱向閥的控制的示意圖；10為藥物梯度濃度作用細(xì)胞時時橫向閥的控制的示意圖；11為進樣后被固定在C型環(huán)壩內(nèi)的細(xì)胞的示意圖。具體實施例方式下面結(jié)合附圖進一步說明本發(fā)明的一種具體實施過程。如圖2所示，微流控細(xì)胞陣列芯片有三層結(jié)構(gòu)，分別為閥控制通道層(圖2中的5)(第一層)，流體通道層(圖2中的6)(第二層)和適合細(xì)胞貼壁生長的玻璃層(圖2中的7)(第三層)，其中閥控制通道層與流體通道層通過PDMS熱鍵合構(gòu)成閥控制單元，流體通道層和玻璃層通過氧等離子鍵合構(gòu)成流體通道單元。流體通道單元包括6X6細(xì)胞培養(yǎng)池陣列(圖1中的1)以及橫向進樣管道和出樣管道、縱向進樣管道和出樣管道；其中，橫向進樣管道和出樣管道用于藥物的進樣，縱向進樣管道和出樣管道用于檢測細(xì)胞的進樣。流體通道層的通道高為50pm;寬為100pm，每個培養(yǎng)池為600jnmX600|iim，中間有一個半徑為200pm的C型壩結(jié)構(gòu)，壩高45jim，寬50)am，該C型壩的開口朝向細(xì)胞進樣方向，壩頂部與玻璃層之間有一高度小于細(xì)胞直徑的狹縫(通常為5pm)，該結(jié)構(gòu)可以將細(xì)胞攔截在壩內(nèi)，保證細(xì)胞在固定的區(qū)域生長，而培養(yǎng)基和藥物等液體可以自由流通。(紅色標(biāo)識的數(shù)值最好為一范圍而不是單點數(shù)值)閥控制通道層有2組位于相鄰細(xì)胞培養(yǎng)池之間、用于阻斷細(xì)胞培養(yǎng)池間的聯(lián)系的控制閥，分別是橫向閥組(圖1中的4)和縱向閥組(圖1中的3)。這兩種閥的結(jié)構(gòu)是由第一層閥控制通道層的PDMS與第二層流體通道層的PDMS薄膜構(gòu)成密閉的空腔，并分別與壓力施加裝置相連(即圖l中的注射器)，當(dāng)通過注射器對閥空間加壓力時，下層的PDMS因楊氏模量小且厚度薄，易發(fā)生形變，阻擋第二層流體通道層液體流動，從而實現(xiàn)橫向閥組或縱向閥組閥對流體通道層通道的封閉效果；當(dāng)壓力移除后，PDMS薄膜恢復(fù)原形變，從而恢復(fù)流體通道層橫向或縱向通道的液體的流通。如圖3所示，通過C型壩結(jié)構(gòu)和微闊陣列實現(xiàn)了芯片的操控，即對細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域的分布，通道微流體的控制。細(xì)胞進樣時在芯片內(nèi)的分布是通過芯片培養(yǎng)池的C型壩(圖3中的8)結(jié)構(gòu)的物理攔截來實現(xiàn)的。壩頂部與玻璃層之間構(gòu)成一個5um的狹縫，而細(xì)胞的直徑一般為10-20um，因此，細(xì)胞進入培養(yǎng)腔，由于狹縫的攔截作用和微流體的流動，細(xì)胞只分布在培養(yǎng)腔的中心區(qū)域，即C型壩內(nèi)，而其它區(qū)域的細(xì)胞會隨著流體流走，這樣細(xì)胞陣列芯片可以有效地控制進樣細(xì)胞的分布區(qū)域，以便實驗的觀察和分析。為獲得不同濃度梯度的藥物的試驗結(jié)果，在上述微流控細(xì)胞陣列芯片中還可以加入一個如圖1中2所示的藥物濃度梯度網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)為由多級通道組組成的網(wǎng)絡(luò)，所述通道組的通道的數(shù)量從進樣孔向細(xì)胞培養(yǎng)池陣列依次增加，至與縱向閥垂直的細(xì)胞培養(yǎng)池陣列方向的細(xì)胞培養(yǎng)池數(shù)目相同。在圖1所示的微流控細(xì)胞陣列芯片中，該藥物梯度網(wǎng)絡(luò)包含2個進樣孔和5級濃度梯度通道(圖1中的2)，可產(chǎn)生6個不同濃度的藥物溶液。雖然在本實施例中，細(xì)胞培養(yǎng)池陣列為一6X6細(xì)胞培養(yǎng)池陣列，但對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容和教導(dǎo)，為試驗的需要，而使用其他規(guī)格的細(xì)胞培養(yǎng)池陣列，能達(dá)到其相應(yīng)的試驗?zāi)康模秋@而易見的，因此，也是本方面需要保護的內(nèi)容。實施例1、芯片的制備該微流控芯片采用多次軟光刻技術(shù)以及模塑法制作。芯片采用具有良好的透光透氣性和生物相容性的聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料與常規(guī)載玻片鍵合形成細(xì)胞培養(yǎng)池陣列及其微通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。芯片制作的關(guān)鍵工藝是通過制作雙層的SU-8負(fù)性光刻膠的流體通道層模具形成壩結(jié)構(gòu)以及熱鍵合法制作雙層的PDMS(聚二甲基硅氧垸)芯片。具體步驟如下-1)在清洗干凈的硅片基底上甩涂上稀釋配成的SU8-2005(MicroChemCorp，MA,USA，用SU8-2025與環(huán)戊酮按體積比100:53稀釋而成)，厚約5|im，放在熱板上65"C烘lmin然后升溫至95'C保持2min，緩慢降溫到室溫，在光刻機上第一次曝光后，將硅片放到熱板上進行PEB(Postexposedbake)，即65。C加熱烘lmin，然后升溫到95。C保持2min，之后緩慢降至室溫，用SU-8負(fù)膠專用顯影液顯影后，得到第一層的SU-8光刻膠模具；2)接著將SU8-2050甩涂到具有第一層SU-8結(jié)構(gòu)的基片上，厚度約為50pm，完成前烘，將第二層掩模板與第一層光刻圖形對準(zhǔn)，第二次曝光和PEB，最后超聲輔助顯影就形成雙層圖形結(jié)構(gòu)的流體通道層SU-8模具；3)采用步驟1)和2)中的方法，用SU8-2050完成單層的閥控制通道圖形的SU-8模具的制作；4)為了制作雙層的PDMS芯片，先將PDMS(DowComing,Michigan,USA)單體與固化劑按重量比20:1均勻混合，抽真空進行脫氣處理后，倒入雙層圖形結(jié)構(gòu)的SU-8模具中，在甩膠臺上轉(zhuǎn)速800rpm甩涂30s，然后放置在熱板上7(TC加熱10min，形成厚約150^im的PDMS薄層；接著調(diào)配單體與固化劑比為10:1的PDMS，真空脫氣處理后，澆注在閥控制通道層的SU-8模具中，厚為5mm，在熱板7(TC加熱20min，冷卻后從硅片剝離，將剝離的閥控制PDMS層在顯微鏡下與流體通道層的PDMS薄層對準(zhǔn)貼合，然后移至熱板上90。C加熱lh，完成雙層PDMS的熱鍵合。5)最后將雙層PDMS從硅片上剝離，打好孔并切割合適大小，與清洗干凈的玻璃片進行氧等離子鍵合，形成芯片通道的封閉，完成微流控細(xì)胞陣列芯片的制作。實施例2、芯片的應(yīng)用芯片培養(yǎng)的細(xì)胞采用人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，人肝正常細(xì)胞HL-7702和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)液為RMPI1640(Gibco)，添加10%的胎牛血清(杭州四季青)和1%的鏈青雙抗(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)，細(xì)胞消化液為0.25%的胰酶和0.02%的EDTA(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)。芯片通入75%乙醇，用紫外線照射lh，進行消毒處理。先用注射泵在芯片內(nèi)通入細(xì)胞培養(yǎng)液2h，以排除芯片內(nèi)殘余的乙醇和氣泡，有利于細(xì)胞在培養(yǎng)腔內(nèi)貼壁生長。通過注射泵將三種細(xì)胞分別導(dǎo)入芯片的各縱列細(xì)胞培養(yǎng)腔，進行細(xì)胞培養(yǎng)。每24h通過注射泵更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，以保證細(xì)胞培養(yǎng)時的營養(yǎng)更新和代謝物的排除。在芯片集成微閥以實現(xiàn)對芯片通道微流體的控制。當(dāng)多種細(xì)胞進樣時，橫向閥(圖3中的10)打開，縱向閥(圖3中的9)關(guān)閉，不同的細(xì)胞分別進入縱向的細(xì)胞培養(yǎng)腔，由于縱向閥阻隔了橫向通道的液體流動，各個縱向的細(xì)胞不會進入別的縱向細(xì)胞培養(yǎng)腔，從而實現(xiàn)多種細(xì)胞在片共培養(yǎng)。細(xì)胞成功培養(yǎng)后，藥物濃度梯度結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的6種含不同濃度藥物的細(xì)胞培養(yǎng)液從橫向通道進入細(xì)胞培養(yǎng)腔，橫向閥關(guān)閉，縱向閥打開，藥物溶液可以保持穩(wěn)定的濃度作用于橫向的不同細(xì)胞的培養(yǎng)腔。因此芯片兩組閥的操控可以進行對芯片通道內(nèi)的微流體的控制，實現(xiàn)了芯片多種細(xì)胞的共培養(yǎng)和不同濃度的藥物分別對不同的細(xì)胞進行刺激的功能。本發(fā)明構(gòu)建的微流控細(xì)胞陣列芯片能夠很好地控制細(xì)胞在芯片內(nèi)的生長分布，有效地解決陣列芯片細(xì)胞分布無序的難題。通過雙層PDMS鍵合將微閥器件集成到芯片上，通過對閥控制網(wǎng)絡(luò)的操控實現(xiàn)陣列芯片流體的控制。這些工藝的研究有效地解決了微流控芯片在基于細(xì)胞研究方面的一些關(guān)鍵問題。芯片還設(shè)計了藥物濃度梯度網(wǎng)絡(luò)，形成穩(wěn)定的梯度藥物濃度，以便研究不同濃度藥物對細(xì)胞的毒性作用。微流控細(xì)胞陣列芯片可用于細(xì)胞藥物篩選的高通量、低成本的快速篩選，同時也可用于一些細(xì)胞相關(guān)的研究。ii本發(fā)明不僅闡述了一種基于微流控技術(shù)的高通量藥物篩選平臺的構(gòu)建方法，還提供了多層多結(jié)構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)陣列芯片的制作方法。權(quán)利要求1、一種用于高通量藥物篩選的微流控細(xì)胞陣列芯片，其特征在于，所述芯片從上向下依次為閥控制通道層，流體通道層和適合細(xì)胞貼壁生長的玻璃層；所述流體通道層和玻璃層通過離子鍵合構(gòu)成流體通道單元，所述流體通道單元包括細(xì)胞培養(yǎng)池構(gòu)成的細(xì)胞培養(yǎng)池陣列，相應(yīng)數(shù)目的橫向進樣管道和出樣管道，相應(yīng)數(shù)目的縱向進樣管道和出樣管道；所述橫向進樣管道和出樣管道分別用于藥物的進樣及排出，縱向進樣管道和出樣管道分別用于待檢測細(xì)胞的進樣及排出；所述細(xì)胞培養(yǎng)池中有一個C型壩結(jié)構(gòu)，所述C型壩開口朝向細(xì)胞進樣方向，壩頂(底)與玻璃層間有一小于細(xì)胞直徑的狹縫，以控制進樣細(xì)胞的分布；所述閥控制通道層與流體通道層通過PDMS熱鍵合構(gòu)成閥控制單元，所述閥控制單元為位于相鄰細(xì)胞培養(yǎng)池之間的管道上方、用于阻斷細(xì)胞培養(yǎng)池間的聯(lián)系的橫向閥組和縱向閥組，所述橫向閥組和縱向閥組均為由PDMS與PDMS薄膜構(gòu)成的密閉的空腔，所述空腔分別與壓力施加裝置相連，當(dāng)對閥空間施加壓力后，PDMS薄膜發(fā)生形變，阻擋流體通道層的液體流動，從而實現(xiàn)相應(yīng)閥組對流體通道層橫向或縱向通道的封閉；當(dāng)壓力移除后，PDMS薄膜恢復(fù)原形，從而恢復(fù)流體層通道橫向或縱向的液體流通。2、如權(quán)利要求l所述的芯片，其特征在于，所述芯片的流體通道單元還包括藥物濃度梯度網(wǎng)絡(luò)，所述藥物濃度梯度網(wǎng)絡(luò)為多級通道組組成的網(wǎng)絡(luò)，所述通道組的通道數(shù)量從進樣孔向細(xì)胞培養(yǎng)池陣列依次增加至與縱向閥垂直的細(xì)胞培養(yǎng)池陣列方向的細(xì)胞培養(yǎng)池數(shù)目相同，所述進樣孔的數(shù)目大于1個小于縱向閥垂直的細(xì)胞培養(yǎng)池陣列方向的細(xì)胞培養(yǎng)池數(shù)目。3、如權(quán)利要求2所述的芯片，其特征在于，所述進樣孔的數(shù)目為2。4、如權(quán)利要求l所述的芯片，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)池陣列為6X6細(xì)胞培養(yǎng)池陣列。5、如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，所述流體層的通道高為50prn;寬為100pm;培養(yǎng)池為一邊長600pm的正6邊形，中間有一個半徑為200pm的C型壩結(jié)構(gòu)，壩高45pm，寬50pm。6、如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，所述壓力施加裝置為注射器。7、制備如權(quán)利要求1所述的微流控細(xì)胞陣列芯片的方法，其特征在于采用多次曝光、一次顯影的Su-8負(fù)性光刻膠工藝以及多層PDMS鍵合，制作了具有高深寬比的多層結(jié)構(gòu)的芯片，所述方法包括以下步驟a)在清洗干凈的硅片基底上甩涂上稀釋配成的5pm厚的SU8-2005，于65。C烘lmin，升溫至95。C保持2min，緩慢降溫到室溫，在光刻機上第一次曝光后，將硅片放到熱板上，于65'C加熱烘lmin，升溫到95"C保持2min，之后緩慢降至室溫，用SU-8負(fù)膠專用顯影液顯影后，得到第一層的SU-8光刻膠模具；b)將SU8-2050鬼涂到具有第一層SU-8結(jié)構(gòu)的基片上，厚度約為50pm，完成前烘，將第二層掩模板與第一層光刻圖形對準(zhǔn)，第二次曝光和PEB操作，最后超聲輔助顯影就形成雙層圖形結(jié)構(gòu)的流體通道層SU-8模具；c)采用步驟1)和2)中的方法，用SU8-2050完成單層的閥控制通道圖形的SU-8模具的制作；d)為了制作雙層的PDMS芯片，先將PDMS單體與固化劑按重量比20:1均勻混合，抽真空進行脫氣處理后，倒入雙層圖形結(jié)構(gòu)的SU-8模具中，在甩膠臺上轉(zhuǎn)速800rpm甩涂30s，放置在熱板上70。C加熱10min，形成厚約150pm的PDMS薄層；接著調(diào)配單體與固化劑比為10:1的PDMS，真空脫氣處理后，澆注在閥控制通道層的SU-8模具中，厚為5mm，在熱板7(TC加熱20min，冷卻后從硅片剝離，將剝離的閥控制PDMS層在顯微鏡下與流體通道層的PDMS薄層對準(zhǔn)貼合，然后移至熱板上9(TC加熱lh，完成雙層PDMS的熱鍵合。e)最后將雙層PDMS從硅片上剝離，打好孔并切割合適大小，與清洗干凈的玻璃片進行氧等離子鍵合，形成芯片通道的封閉，完成微流控細(xì)胞陣列芯片的制作。8、按權(quán)利要求7所述的微流控細(xì)胞陣列芯片的制備方法，其特征在于步驟a中所述的稀釋配成的Su8-2005是用Su8-2005與環(huán)戊酮按100:53的體積比稀釋而成。9、如權(quán)利要求1一6中任一項所述的芯片，其特征在于用于不同濃度的藥物并行作用于多種細(xì)胞進行高通量細(xì)胞藥物篩選。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于高通量藥物篩選的微流控細(xì)胞陣列芯片、制備方法及應(yīng)用。其特征在于所述的芯片從上向下依次為閥控制通道層，流體通道層和適合細(xì)胞貼壁生長的玻璃層。該芯片可用于不同濃度藥物并行作用多種細(xì)胞，進行高通量細(xì)胞藥物篩選。所述的芯片采用多次曝光，一次顯影的Su-8負(fù)性光刻膠工藝以及多層PDMS鍵合，制作了具有高深寬比的多層結(jié)構(gòu)的芯片。本發(fā)明提供的微流控細(xì)胞陣列芯片可以實現(xiàn)低試劑消耗、高通量的多種細(xì)胞共培養(yǎng)，并行分析不同藥物濃度對不同細(xì)胞的刺激作用及其在片的實時觀察與檢測，為高通量藥物篩選和細(xì)胞-藥物研究提供了一個全新的技術(shù)平臺和方法。文檔編號C12M3/00GK101629143SQ20081020386公開日2010年1月20日申請日期2008年12月2日優(yōu)先權(quán)日2008年12月2日發(fā)明者吳建璋,趙建龍,邵建波,鄭允煥,金慶輝申請人:中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所