專利名稱：：miR-21反義寡聚核苷酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及反義核酸及其應(yīng)用，尤其涉及miR-21的反義核酸及其在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs(又稱為miRNAs或微小核酸)與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。在眾多疾病中，惡性腫瘤的miRNA表達(dá)異常最受矚目。Berezikov等(BerezikovE,GuryevV,vandeBeltJ,etal.PhylogeneticshadowingandcomputationalidentificationofhumanmicroRNAgenes.Cell,2005，120(1):21-24)通過(guò)計(jì)算機(jī)分析顯示30%以上的蛋白編碼基因可能成為miRNA的耙基因。Calin等(CalinGA，SevignaniC，DumitruCD,etal.HumanmicroRNAgenesarefrequentlylocatedatfragilesitesandgenomicregionsinvolvedincancers.ProcNatlAcadSdiUSA,2004,101(9):2999-3004)研究顯示，50%的miRNAs位于腫瘤相關(guān)基因組的區(qū)域或者脆弱位點(diǎn)，提示miRNAs可能在部分腫瘤發(fā)生中發(fā)揮了人們?cè)瓉?lái)所不了解的重要作用。最早人們對(duì)于miRNAs參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的證據(jù)來(lái)自'人慢性淋巴細(xì)胞白血病(CalinGA，D咖itruCD,ShimizuM，etal.Frequentdeletionsanddown-regulationofmicro-RNAgenesmiR15andmiR16at13ql4inchroniclymphocyticleukemia.ProcNatlAcadSciUSA,2002,99(24):15524-15529)，研究者發(fā)現(xiàn)定位于13ql4的miR-15a和miR-16a在50%慢性淋巴細(xì)胞白血病患者中缺失或者表達(dá)下降。之后Ci咖ino(CimminoA,CalinGA,FabbriM,etal.miR-15andmiR_16induce即optosisbytargetingB(X2.ProcNatlAcadSciUSA，2005，102(39):13944-13949)的研究顯示，Bcl_2是miR-15a和miR-16a的靶基因。miR-15a和miR-16a的表達(dá)水平與慢性淋巴細(xì)胞白血病中Bcl-2的表達(dá)水平密切相關(guān)，這兩個(gè)miRNAs可以從轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控Bcl-2的表達(dá)，這一研究同時(shí)也為白血病的細(xì)胞模型il供了依據(jù)，提示miR-15a和miR-16a可以被用來(lái)治療過(guò)度表達(dá)Bel-2的腫瘤。3根據(jù)高通量的miRNA微陣列和QRT-PCR的定量分析，發(fā)現(xiàn)在多種人類惡性腫瘤中，包括結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、腎癌、胃癌、淋巴瘤、白血病等的miRNA表達(dá)譜與它們來(lái)源的正常組織存在很大區(qū)別，這種區(qū)別在低分化和惡性程度高的腫瘤組織表現(xiàn)得更顯著些(AlvarezGarciaI，MiskaEA.MicroRNAfunctionsinanimaldevelopmentandhumandisease.Development,2005'132(21):4653-4662;WakiyamaM'TakimotoK'Ohara0,etal.Let-7microRNA-鵬diatedmRNAdeadenyiationandtranslationalrepressioninamammalianceli-freesystem.GenesDev,2007,21(15):1857-1862;MengF，HensonR，LangM，etal.Involvementofhumanmicro-RNAingrowthandresponsetochemotherapyinhumancholangiocarcinomacelllines.Gastroenterology,2006，130(7):2113-2129)?？偟膩?lái)說(shuō)，惡性腫瘤的miRNA總體含量比來(lái)源的正常組織明顯降低，腫瘤分化越差，miRNA的含量也越低。此外，具體到每一種惡性腫瘤，都發(fā)現(xiàn)有幾種miRNA的表達(dá)明顯低于其來(lái)源的正常組織。在乳腺癌組織中，miR-10b、let-7、miR-125b和miR-145等miRNA的表達(dá)明顯下調(diào)。另一方面，某些miRNA在腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)卻有所上升，如乳腺癌的miR-155(Couzin,J.Cancerbiology.Anewcancerplayertakesthestage.Science,2005，310:766-767)。惡性腫瘤miRNA表達(dá)的變化說(shuō)明腫瘤細(xì)胞基因調(diào)控機(jī)制發(fā)生改變，與cDM微陣列比較，tniRNA表達(dá)譜能為癌腫的分子分期和分型提供更準(zhǔn)確的信息(LuJ,GetzG，MiskaEA，etal.MicroRNAexpressionprofilesclassifyhu畫cancers.Nature,2005，435(7043):834-838)。那么，表達(dá)水平發(fā)生變化的miRNA是否參與了惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展？雖然目前對(duì)該問(wèn)題的研究還'處在初始階段，但是根據(jù)生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)和現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在癌細(xì)胞中表達(dá)異常的miRNA的靶基因?qū)儆诎┗蚧蛘咭职┗?，這些靶基因都與細(xì)胞的增殖、凋亡或分化密切相關(guān)。.正是因?yàn)閙iRNA具有調(diào)節(jié)癌基因或者抑癌基因表達(dá)的功能，故其自身也充當(dāng)著"抑癌基因"和"癌基因"的角色(ChenCZ.MicroRNAsasoncogenesandt咖orsuppressors.NEnglJMed,2005,353(17):1768-1777;IorioMV'FerracinM，LiuCG,etal.MicroRNAg,expressionderegulationinhumanbreastcancer.CancerRes,2005,65(16):7065-7070;CaldasC，BrentonJD.SizingupmiRNAsascancergenes.NatMed，2005，11(7):712-714;ZhangB,PanX,CobbGP，etal.microRNAsasoncogenesand.tumorsuppressors.DevBiol,2007,302(1):1-12;HammondSM.MicroRNAsastumorsuppressors.NatGenet,2007,39(5):582-583;HuangQ，GumireddyK，SchrierM，etal.ThemicroRNAsmiR-373andmiR-520cpromotetumourinvasionandmetastasis.NatCellBiol,2008，10(2):202-210;SchulteJ"H,HornS,OttoT,etal.MYCNregulatesoncogenicMicroRNAsinneuroblastoma.IntJCancer,2008,122(3):699-704;EsquelaKerscherA，SlackFJ.Oncomirs-microRNAswitharoleincancer.NatRevCancer,2006，6(4):259-269)。目前在動(dòng)植物中已發(fā)現(xiàn)數(shù)以千計(jì)的miRNAs，其中只有少數(shù)miRNAs功能得到了確定，而絕大部分還是未知。相對(duì)于其他生物，人類raiRNAs功能的研究更為復(fù)雜。miR-21是較早發(fā)現(xiàn)的人類mi認(rèn)A之一，因其較為明確的存在背景，而成為人類niiRNAs功能研究中的重要工具，miR-21在哺乳動(dòng)物多種組織中的廣泛存在，對(duì)其生物學(xué)發(fā)生、作用機(jī)制的研究方法更具普遍意義。當(dāng)miR-21作為工具來(lái)研究人類miRNAs作用機(jī)制和功能的同時(shí)，miR-21自身的功能研究也得到了更進(jìn)一步的深入，其中最為突出的成果表現(xiàn)在miR-21與腫瘤的關(guān)系。miR-21是由兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別獨(dú)立發(fā)現(xiàn)的。2001年，Lagos等(LagosQuintanaM，RauhutR，LendeckelW，etal.IdentificationofnovelgenescodingforsmallexpressedRNAs.Science,2001，294(5543):853-858)證實(shí)了在非脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中存在類似于Lin4和Let-7的小RNA，其中已經(jīng)包括miR-21。此后，Mourelatos、Dostie等(MourelatosDostieJ，PaushkinS，etal.miRNPs:anovelclassof'ribonucleoproteinscontainingnumerousmicroRNAs.GenesDev，2002,16(6):720-728;DostieJ，MourelatosZ,YangM.，etal..NumerousmicroRNPsinneuronalcellscontainingnovelmicroRNAs.RNA,2003,9(2):180-186)從人類和小鼠的神經(jīng)元細(xì)胞以及人類宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞中分別檢測(cè)到了miR-21。2005年，F(xiàn)u等(FuH，TieY，XuC,etal.IdentificationofhumanfetallivermiRNAsbyanovelmethod.FEBSLett,2005,579(17).:3849-3854)的研究提示，許多miRNAs參與了肝細(xì)胞的基因表達(dá)，采用實(shí)時(shí)定量PCR方法驗(yàn)證了在胚胎肝組織中存在50種miRNA，miR-21又是其中之一。2005年，'Volinia等(VoliniaS，CalinGA，LiuCG，etal.Amicro腿expressionsignatureofhuman.solidtumorsdefinescancergenetargets.ProcNatlAcadSciUSA,2006,103(7):2257-2261)采用基因芯片技術(shù)賴耙位點(diǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)不同系統(tǒng)腫瘤中miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行研究，列出了miRNA在不同系統(tǒng)中表達(dá)升高或降低的譜，并繪出了與其對(duì)應(yīng)的靶基因譜。有趣的是，研究者將在多種腫瘤中都表達(dá)升高的miRNA進(jìn)行歸納，發(fā)現(xiàn)miR-21在幾種腫瘤中都是表達(dá)升高的。Schmittgen等發(fā)現(xiàn)，在HeLa細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞系(HCT-116)中，miR-21明顯高表達(dá)，而在前髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞(HL-60)、慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞(K562)、前列腺癌細(xì)胞(LNCAP)中表達(dá)相對(duì)較低。Iorio等(IorioMV，F(xiàn)erracinM，LiuCG,etal.MicroRNAgeneexpressionderegulationinhumanbreastcancer.CancerRes,2005，65(16):7065-7070)比較了乳腺癌及正常乳房組織miR-21的表達(dá)，通過(guò)微點(diǎn)陣和Northernblot驗(yàn)證了miR-21在乳腺癌組織中的表達(dá)上調(diào)，表明miR-21可能在乳腺癌惡性腫瘤形成中也扮演著癌基因的角色。Ciafre等(CiafreSA，GalardiS,MangiolaA，etal.ExtensivemodulationofasetofmicyoRNAsinprimaryglioblastoma.BiochemBiophysResCommun，2005，334(4):135W358)利用微點(diǎn)陣的分析方法檢測(cè)了245種ndRNAs的整體表達(dá)水平，鑒定了一組在高度惡性的原發(fā)性腦組織腫瘤中其表達(dá)譜發(fā)生改變的miRNAs，其中miR-21在惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)大幅度上調(diào)，而miR-128、miR-181a、miR-181b以及miR-181c表達(dá)下調(diào)。Chan等(ChanJA，KrichevskyAM,KosikKS,etal.MicroRNA-21isanantiapoptoticfactorinhumanglioblastomaceils.CancerRes,2005,65(14):6029-6033)通過(guò)對(duì)原代多形性惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外建立的6種惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(A172、U87、11373、LN229、LN428、LN308)與正常胎兒及成人腦組織以及體外培養(yǎng)的正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的比較分析，也發(fā)現(xiàn)在惡性膠質(zhì)瘤中miR-21的表達(dá)水平明顯升高，進(jìn)一歩研究表明，在培養(yǎng)的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中下調(diào)miR-21的表達(dá)，可以觸發(fā)Caspases的激活，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡。這些研究表明異常表達(dá)的miR-21可能通過(guò)抑制關(guān)鍵性的凋亡相關(guān)基因表達(dá)而促進(jìn)惡性腫瘤的形成。近三十年，盡管臨床上腫瘤的綜合治療已很普遍，但以手術(shù)為主，放化療為輔的綜合治療對(duì)腫瘤患者的生存率提高并不明顯，5年總體生存率仍然較低，徘徊在30%55%左右，并沒(méi)有顯著提高，中晚期患者的5年生存率更低，約為20%。而且這些方法都存在各自的局限性，特別是對(duì)中晚期和復(fù)發(fā)患者療效不佳，對(duì)伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者療效更差。因此，尋找更安全有效的治療途徑是提高腫瘤患者生存率和生存質(zhì)量所亟待解決的難題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的主要問(wèn)題就是提供一組能夠抑制miR-21表達(dá)的反義核酸。本發(fā)明要解決的另一問(wèn)題就是提供上述反義核酸在腫瘤細(xì)胞中抑制miR-21表達(dá)和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的應(yīng)用。為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成了一系列針對(duì)miR-21不同區(qū)域的長(zhǎng)度不同的反義核酸，并在培養(yǎng)細(xì)胞中驗(yàn)證具有抑制效果的反義核酸。研究顯示，這些反義核酸能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、惡'改增殖能力和侵襲能力。本發(fā)明設(shè)^了一系列可以結(jié)合于miR-21不同位置的反義核酸分子，在培養(yǎng)細(xì)胞SSC-15和CAL27中，驗(yàn)證對(duì)miR-21表達(dá)特異性抑制的反義核酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)能力、增殖能力、遷移能力和凋亡能力的影響，反義核酸分子長(zhǎng)度可以包含12~22個(gè)核苷酸殘基，均有不同程度的抑制人腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)能力、增殖能力、遷移能力和凋亡能力的特性，其中最短的反義核酸長(zhǎng)度為12個(gè)堿基，不同長(zhǎng)度的反義核酸均具有良好的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖抑制活性。因此，上述反義核酸均可用來(lái)制備抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)能力、增殖能力、遷移能力和凋亡能力的制劑，其中優(yōu)選miR-21高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。從目前來(lái)看，核酸雜交中RNA與miRNA的雜交親和力比DNA與miRNA雜交的親和力要高，具有很高的藥用價(jià)值。但是人工合成的DNA成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)比合成RNA的成本低，也具有很好的市場(chǎng)潛力。而且也可以采用核糖RNA單體與脫氧核糖DNA單體嵌合相連而成的反義核酸作為藥物進(jìn)行開(kāi)發(fā)。本發(fā)明設(shè)計(jì)的一系列反義核酸分子，既包括DNA分子，也包括柳A分子，兩種分子均具有抑制miR-21表達(dá)的活性。本發(fā)明設(shè)計(jì)的反義核酸，其序列具有特異性生物學(xué)活性，其對(duì)于某一基因互補(bǔ)的位點(diǎn)的反義核酸所互補(bǔ)的長(zhǎng)度有很大關(guān)系，如互補(bǔ)的長(zhǎng)些，則生物學(xué)活性會(huì)更高些，抑制效果也會(huì)更好一些，在增加或減少一個(gè)至數(shù)個(gè)堿基而互補(bǔ)與同一基因位點(diǎn)的反義核酸，同樣也具有不同程度的生物學(xué)活性，也可達(dá)到不同程度的抑制腫瘤細(xì)胞生^:與增殖的作用，本發(fā)明的研究表明，最短可達(dá)12個(gè)堿基仍然具有抑制miR-21表達(dá)的作用。反義核酸研究中，各種化學(xué)修飾方法很多。本發(fā)明采用硫代修飾的反義核酸，主要是硫代的反義核酸的藥理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)、毒理學(xué)等臨床前研究是各種化學(xué)修飾反義核酸中研究最為全面的，硫代反義核酸在體內(nèi)可以有效地防止人體內(nèi)大量核酸外切酶對(duì)反義核酸的酶切而降解，從而使反義核酸失去應(yīng)由的生物學(xué)活性。此外硫代反義核酸還可激發(fā)RNA酶的活性，降解與其雜交的RNA鏈，因此優(yōu)選硫代的反義核酸在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用。應(yīng)當(dāng)明確的是，任何能夠增加反義核酸穩(wěn)定性和生物利用度的修^P方法都可以應(yīng)用，如甲氧修飾、膽固醇修飾等。本發(fā)明的上述反義核酸具有抑制miR-21表達(dá)的效果。當(dāng)將上述反義核酸轉(zhuǎn)染到miR-21高表達(dá)的細(xì)胞株SSC-15和CAL27中后，能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和惡性增殖能力，并能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。圖1轉(zhuǎn)染前后舌鱗癌細(xì)胞SSC-15和CAL27凋亡變化轉(zhuǎn)染miR-21AS后，舌鱗癌細(xì)胞SCC-15和CAL27凋亡增加，出現(xiàn)明顯的凋亡峰，而轉(zhuǎn)染lin4AS0后凋亡無(wú)明顯變化。具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例及附圖進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而應(yīng)當(dāng)理解，列舉這些實(shí)施例只是為了起說(shuō)明作用，而并不是用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1反義核酸對(duì)miR-21表達(dá)的抑制作用.采用本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成的針對(duì)miR-21的反義核酸(以下簡(jiǎn)稱miR-21AS)，反義核酸分子的編號(hào)和序列(經(jīng)過(guò)全硫代修飾)如下AS05'-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3'(針對(duì)miR-21全長(zhǎng)的反義RNA序列)AS15'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3，(針對(duì)miR-21全長(zhǎng)的反義DNA序列)AS35'-AGUCUGAUAAGCUA-3'(針對(duì)miR-215'端的14個(gè)堿基的反義RNA序列)AS55'-UCAACAUCAGU03'(針對(duì)miR-213，端的12個(gè)堿基的反義RNA序列).AS65，-TCAACATCAGTCTG-3，(針對(duì)miR-213，端的14個(gè)堿基的反義DNA序列)AS75'-ACAUCAGUCUGAUAAGC-3'(針對(duì)miR-21中間區(qū)域的17個(gè)堿基的反義RNA序列)對(duì)照l(shuí)in4AS0的序列為5，-UCACACUUGAGGUCUCAGGGA-3，將上述反義核酸序列轉(zhuǎn)染到miR-21高表達(dá)的舌鱗癌細(xì)胞株SCO15和CAL27中.-1)轉(zhuǎn)染前一天，在24孔板中用適量不含抗生素的培養(yǎng)基接種培養(yǎng)細(xì)胞，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的匯合度達(dá)到3050%;2)轉(zhuǎn)染樣品按照如下方法準(zhǔn)備寡聚物-Lipofectaraine2000復(fù)合物a,用50ul不含血清的Opti-MEMI培養(yǎng)基分別稀釋30pmolmiR-21ASO、miR-21AS1、miR-21AS3、miR-21AS5、miR-21AS6、miR-21AS7和30pmolUMASO,輕輕混勻；b,使用前輕輕混勻Lipofectamine2000，然后取2w1稀釋到50w1的Opti-MEMI培養(yǎng)基，輕輕混勻后在室溫下孵育5min;c,孵育5n]in后，稀釋的LipofectamineTM2000分別與稀釋的miR-21ASO、lin4ASO和TPM-1-siRNA混合，輕輕混勻后在室溫下孵育20inin，以允許復(fù)合物的形成；3)將復(fù)合物加入到每一個(gè)包含細(xì)胞和培養(yǎng)基的孔中，輕輕地前后搖動(dòng)培養(yǎng)板混合，4)37°C，5%(:02培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜，更換含10W胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，進(jìn)行后續(xù)基因阻斷分析。以miR-21..AS分別轉(zhuǎn)染SCC-15和CAL2^細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染miR-21AS的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染lin4ASO的細(xì)胞作為對(duì)照組(設(shè)立轉(zhuǎn)染lin4AS0組是為了排除miR-21ASO的脫靶效應(yīng))，采用qRT-PCR檢測(cè)miR-21表達(dá)。結(jié)果可見(jiàn)，轉(zhuǎn)染miR-21AS0、miR-21AS1、miR-21AS3、miR-,21AS5、miR-21AS6、miR-21AS7后，tniR-2i的表達(dá)顯著低于未轉(zhuǎn)染raiR-21AS的細(xì)胞，而轉(zhuǎn)染lin4-SO對(duì)miR-21的表達(dá)未見(jiàn)顯著影響?？俁NA及miRNA的提取(tnirVanamicroRNA提取試劑盒，購(gòu)自Ambion)::1)加入600ulLysis/BindingSolution,裂解組織；2)加入1/10裂解液體積的microRNAHomogenateAdditive,混勻，冰上放置10min;'3)加入與裂解液(未加microRNAHomogenateAdditive)等體積的酚氯仿溶液，混勻，10,000Xg室溫離心5min;4)將上清夜移到干凈的管子中，并記下液體的體積；5)加入l/3上清夜體積的100%酒精，徹底混勻；6)將裂解液/酒精的混合物加入到FilterCartridge柱中，10,OOOXg離心15s，收集濾液；7)FilterCartridge柱上保留的主要為大分子RNA，按照總RNA提取的標(biāo)準(zhǔn)流程回收保留的RNA用于對(duì)樣品保存質(zhì)量的判斷；8)向?yàn)V液中加入2/3體積的100%酒精(室溫)，混勻；9)將混勻的液體加入新的FilterCartridge柱中，10，000rpm離心15s，棄濾液，重復(fù)利用收集管；10)加入700ulmicroRNAWashSolution1，10,000rpm離心510s，棄濾液，重復(fù)利用收集管；11)加入500ulWashSolution2、3，10,000rpm離心510s，棄濾液，重復(fù)洗滌一次；12)10，000g空離心lmin，以去除濾膜中殘余的液體；13)將FilterCartridge柱移到干凈的管子屮，加入100ul預(yù)熱到95。CElutionSolution或Nuclease-freeWater到濾膜中間，最大速度離心2030s，收集濾過(guò)液，重復(fù)上述步驟一次，合并兩次的收集液；14)收集的樣品用于后面的實(shí)驗(yàn)或保存于-2(TC或更低的溫度下。miR-21的熒光實(shí)時(shí)定量PCR由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司檢測(cè)。表1轉(zhuǎn)染miR-21AS前后SCC-15和CAL27細(xì)胞中的miR-21表達(dá)變化(設(shè)定轉(zhuǎn)染前表達(dá)量為1，表格中數(shù)字為轉(zhuǎn)染48小時(shí)后表達(dá)量與轉(zhuǎn)染前的比值)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>F(miR-21AS6)0.0812±0.02980.0927±0.0362G(miR-21AS7)0.0761±0.04340.0914±0.0302H(lin4ASO)0.2974±0.07910.2942±0.1233賣施例2MTT^^測(cè)細(xì)胞存活率采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-21ASO、TPM-;fsi柳A前后舌鱗癌細(xì)胞存活率的變化，結(jié)果顯示，分別轉(zhuǎn)染miR-21:AS0、miR-21AS1、miR-21AS3、miR-21AS5、raiR-21AS6、miR-21AS7后舌鱗癌細(xì)胞SCC-15和CAL27存活率比轉(zhuǎn)染miR-21ASO前明顯降低；而轉(zhuǎn)染lin4ASO后細(xì)胞存活率無(wú)明顯變化1)收集轉(zhuǎn)染后的舌鱗癌細(xì)胞分別接種于96孔板，約5X10'個(gè)/L，置37"、5%0)2溫箱培養(yǎng)。2)計(jì)算轉(zhuǎn)染后72h,去除96孔板每孔中培養(yǎng)液，每孔加入180yl新鮮DMEM培養(yǎng)液，.再加入20"1MTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。3)終止培養(yǎng)，去除孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入IOOyl二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。4)在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570nm處測(cè)量各孔的吸光值表2轉(zhuǎn)染miR-21AS前后SCC-15和CAL27細(xì)胞存活率變化Groupsmean土SD(%)SCC15CAL27A(raock)0.857±0.0570.830±0.080B(raiR-21ASO)0.447±0.0780.390±0.099C(miR-21AS1)0.512±0.0690.467±0.074D(tniR-21AS3)0.472±0.0810.473±0.066E(miR-21AS5).0.507±0.0690.508±0.037F(miR-21AS6)0.517±0.0450.497±0.032G(miR-21AS7)0.493±0.0720.429±0.046H(lin4ASO)0.837±0.0570.813±0.031實(shí)施例3克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞惡性增殖能力通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-21AS0、TPM-1siRNA前后舌鱗癌細(xì)胞的增殖能力變化。結(jié)果顯示，分別轉(zhuǎn)染miR-21AS0、miR-21ASl、miR-21AS3、miR-21AS5、miR-21AS6、miR-21AS7后舌鱗癌細(xì)胞SCC-15和CAL27克隆形成率比轉(zhuǎn)染miR-21反義核酸前明顯降低，差異有顯著性；而轉(zhuǎn)染lin4ASO后細(xì)胞克隆形成率無(wú)明顯變化'1)舌鱗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染后接種于平底6孔培養(yǎng)板中，400個(gè)細(xì)胞/孔，晃動(dòng)培養(yǎng)板使細(xì)胞分布均勻，置37'C、5%0)2溫箱培養(yǎng)。2)當(dāng)培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)中止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，PBS洗2次。3)純甲醇5ml固定15min。4)棄固定液，加適量姬姆薩應(yīng)用染色液染色1030niin，流水緩慢洗去染液，室溫干燥。5)顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。6)克隆形成率的計(jì)算克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)X100X表3轉(zhuǎn)染miR-21AS前后SCC-15和CAL27細(xì)胞克隆形成率變化Groupsme加士SD(%)SCC-15CAL27A(mock)88.67土4.1693.67±10.60B(miR-21ASO)63.33±7.5768.67±8.15C(miR-21ASl)64.29±8.3165.17±6.06D(miR-21AS.3)70.62±6.2969.75±5.85E(miR-21AS5)68.53±5.6972.09±6.23F(miR-21AS6).71.65±7.1774.62±7.33G(miR-21AS7),66.58±4.9270.59±9.62H(lin4AS0)89.67±6.1195.67土10.97實(shí)施例4軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力通過(guò)軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-21AS0、TPM-1siRNA前后非錨著依賴性生長(zhǎng)的舌鱗癌細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果顯示，分別轉(zhuǎn)染miR-21AS0、miR-21AS1、miR-21AS3、miR-21AS5、miR-21AS6、miR-21AS7后非錨著依賴性生長(zhǎng)的舌鱗癌細(xì)胞SCC-15和CAL27集落形成率比轉(zhuǎn)染miR-21AS0前明顯降低，差異有顯著性；而轉(zhuǎn)染lin4AS0后細(xì)胞集落形成率無(wú)明顯變化。1)舌鱗癌細(xì)胞SSC-15和CAL27轉(zhuǎn)染miR-21AS24h后，收集細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至lX10Vml。'2)制備底層瓊脂(0.6%):取6%瓊脂置于沸水浴中使其完全溶化，取出一份6^瓊脂待冷至約5(TC，加入9份預(yù)熱37。C的新鮮培養(yǎng)液，混勻后加入12孔培養(yǎng)板中，室溫凝固備用。.3)制備上層瓊脂(0.35%):取37'C保溫的細(xì)胞懸液9.4ral，加入5(TC的6%瓊脂約0.6ml，混勻后加入鋪有底層瓊脂的12孔板中，細(xì)胞數(shù)約100200個(gè)/孔。'4)置培養(yǎng)板于37°C、5%0)2溫箱培養(yǎng)，待肉眼可見(jiàn)的球狀集落形成時(shí)中止培養(yǎng)。5)把培養(yǎng)板放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆數(shù)，計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)。6)集落形成率的計(jì)算集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)XlOOX表4轉(zhuǎn)染miR-21AS前后SCC-15和CAL27細(xì)胞軟瓊脂集落形成率變化Groupsmean士SD(%)SCC-15CAL27A(mock)95.07±8.1092.00±4.58B(miR-21AS0)'35.00±11.5333.00±7.81C(miR-21AS1)肌13±6.6736.29±8.62D(miR-21AS3)36.83±7.4139.67±10.07E(raiR-21AS5)38.42±10.7540.29±6.74F(miR-21AS6)42.69±9.8433.85±9.42G(miR-21AS7)37.90±9.4334.88±5.97C(lin4AS0)98.00±14.1887.67±8.51實(shí)施例5轉(zhuǎn)染.miR-21AS后細(xì)胞凋亡情況檢測(cè)將AnnexinV進(jìn)行熒光素FITC標(biāo)記，以標(biāo)記了的AnnexinV作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-21AS0、miR-21AS1、miR-21AS3、miR-21AS5、miR-21AS6、miR-21AS7前后舌,癌細(xì)胞SSC-'15和CAL27的凋亡情況。結(jié)果顯示，舌鱗癌細(xì)胞SCC-15和CAL27轉(zhuǎn)染miR-21反義核酸后，凋亡明顯增加，而轉(zhuǎn)染lin4AS0后凋亡無(wú)明顯變化(圖l)。1)消化、收集培養(yǎng)的舌鱗癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目約lXl(T個(gè)/mL，取lml細(xì)胞懸液，1000rpm4。C離心10min，棄去培養(yǎng)液。2)加入1ml冷PBS重懸細(xì)胞，1000rpm4"C離心10min，棄上清。細(xì)胞重懸于200y1結(jié)合緩沖液。4)加入IOulA皿exinV-FITC和5y1PI，,輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15min。5)加入300Pl結(jié)合緩沖液，立即采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，結(jié)果見(jiàn)圖l。實(shí)施例6制備抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)能力、增殖能力、遷移能力的制劑1)用50y1不含血清的Opti-MEMI培養(yǎng)基分別稀釋30pmol反義寡聚核驟，輕輕混勻；2)使用前輕輕混勻Lipofectamine2000，然后取2ul稀釋到50"1的Opti-MEMI培養(yǎng)基，輕輕混勻后在室溫下孵育5min;3)孵育5min后，稀釋的Lipofectamine2000分別與稀釋的反義寡聚核酸混合，輕輕混勻后在室溫下孵育20min，復(fù)合物形成。所述復(fù)合物用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)能力、增殖能力、遷移能力等。權(quán)利要求1、針對(duì)人miR-21的一組反義寡聚核苷酸，其包括與下述核苷酸序列中至少12個(gè)連續(xù)的核苷酸互補(bǔ)的序列5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’。2、如權(quán)利要求1所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于可特異性結(jié)合于人miR-21的不同區(qū)域。3、如權(quán)利要求1或2所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于核苷酸為核糖核苷酸。4、如權(quán)利要求1或2所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于核苷酸為脫氧核糖核苷酸。5、如權(quán)利要求廣4所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于具有以下序列，5'-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3'5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'5'-AGUCUGAUAAGCUA-3'5'-UCAACAU(;AGUC-3''5'-TCAACATCAGTCTG-3'5'-ACAUCAGUCUGA11AAGC-3'6、權(quán)利要求廣5中任一反義寡聚核苷酸序列的修飾型。7、如權(quán)利要求6所述的反義寡聚核苷酸的修飾型，其特征在于所述修飾方式為硫代修飾。8、如權(quán)利要求6所述的反義寡聚核苷酸的修飾型，其特征在于所述修飾方式為甲氧修飾。9、根據(jù)權(quán)利要求廣8中任一反義寡聚核苷酸序列在制備治療raiR-21高表達(dá)的腫^的藥物中的應(yīng)用。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述miR-21高表達(dá)的腫瘤為舌鱗癌。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一組用于抑制舌鱗癌中miR-21表達(dá)的反義寡聚核苷酸及其應(yīng)用。本發(fā)明所述的反義寡聚核苷酸，包括與下述核苷酸序列中至少12個(gè)連續(xù)的核苷酸互補(bǔ)的序列5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’，上述互補(bǔ)序列可特異性結(jié)合于人miR-21的不同區(qū)域。本發(fā)明的反義寡聚核苷酸可以為核糖核苷酸，也可以為脫氧核糖核苷酸，并可以對(duì)任一核苷酸進(jìn)行修飾。本發(fā)明所述的具有抗舌鱗癌作用的miR-21反義寡核苷酸能夠有效抑制舌鱗癌細(xì)胞SSC-15和CAL-27中miR-21的表達(dá)，同時(shí)抑制上述兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而能夠有效地治療舌鱗癌及其他miR-21高表達(dá)的腫瘤。文檔編號(hào)C12N15/113GK101457224SQ20081020472公開(kāi)日2009年6月17日申請(qǐng)日期2008年12月17日優(yōu)先權(quán)日2008年12月17日發(fā)明者宋爾衛(wèi),張佩琢,李勁松申請(qǐng)人:蘇州吉瑪基因藥物科技有限公司;李勁松;宋爾衛(wèi)