專利名稱：Cyp2c9基因第九號外顯子單核苷酸多態(tài)性的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基因工程技術領域的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，具體是
一種CT尸it^基因第九號外顯子單核苷酸多態(tài)性的檢測方法。
背景技術：
細胞色素氧化酶P450 2C9，即CYP2C9是細胞色素P450的一個成員。CYP2C9 在人類肝微粒體內含量豐富，約占CYP450s總量的2096，僅次于CYP3A4。人類 的6T尸i^基因定位在染色體10q24. 2。迄今為止，己分離出六個CYP2C的cDNAs， 即CYP2C8、 CYP2C9、 CYP2C10、 CYP2C17、 CYP2C18及CYP2C19。 CYP2C9和CYP2C10 僅有2個氨基酸的不同，且二者的催化活性極為相似，故一般常把CYP2C9和 CYP2C10統(tǒng)稱為CYP2C9/10或CYP2C9。 CF/^C9含有9個外顯子和8個內含子， 全長約5.5kb。在6T/l ("5'-上游2.2kb內含有幾個與糖皮質激素效應元件一 致的序列，另外在起始密碼子上游57bp和110bp處分別有一個TATA和CMT盒。 在5'調控區(qū)至少存在7個SNPs，它們可能影響CKPa^的轉錄，其中位于 HNF-l(H印atic nuclear factor-1)結合位點的T-1912C參與了基因轉錄的激活。 另外，第一外顯子內的6bp重復也參與了基因表達的調控。若缺失從-155到0 這段序列，基因轉錄水平會降低至正常狀態(tài)的1/7-1/8,這意味著可能有重要的 未知調控元件位于該區(qū)間。6T/^^編碼的酶蛋白分子量為53KDa，含有490個 氨基酸。CYP2C9含有一個能被細胞色素b5識別并對其產生激活作用的位點，即 Arg-Arg-Phe-Ser，經cAMP依賴性激酶進行絲氨酸殘基磷酸化修飾后能被細胞 色素b5所識別，進而導致該酶的激活。臨床上約有10%的常用藥物由CYP2C9 催化代謝，常見的底物有磺胺類、氨基比林(Antipyrin)、雙香豆素 (Dicoumarol)、氯霉素(Chloramphenicol)、西米替丁(Cimetidine)、咪唑類抗 真菌藥、甲苯磺丁脲(Tolbutamid)等。多數Cr尸it^的單核苷酸突變可以影響基 因的后續(xù)轉錄和表達，進而改變酶的結構和活性，這是造成個體差異的主要原因。鑒于CYP2C9在藥物代謝中的作用及活性存在個體差異，因此CF尸iV"基因 的多態(tài)性檢測是急需解決的技術問題。
經對現有技術文獻的檢索發(fā)現，未發(fā)現有OPit^基因第九號外顯子單核苷 酸多態(tài)性(SNP)檢測方法的相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種基因第九號外顯子單核苷酸多態(tài)性的 檢測方法。本發(fā)明為藥物設計提供了基因學理論根據，同時也為基于藥物基因組 學理念的新藥研發(fā)提供了指導依據。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現的，本發(fā)明涉及的一種cr/^^9基因第九號
外顯子單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其步驟具體為
步驟一，以GenBank數據庫中。7^<"基因第九號外顯子以及外顯子與內含 子接合部位序列為模板設計一對等位基因特異性的核酸引物，利用引物對來擴 增6T尸it^基因的第九號外顯子的DNA序列，對擴增產物進行分離純化，得到相 應分離核酸；
步驟二，對分離核酸的6T尸itP基因第九號外顯子的第1739-1740位核苷酸 進行檢測，確定其是否存在單核苷酸多態(tài)性，即兩個堿基AT的缺失。
步驟一中，所述一對等位基因特異性的核酸引物，該引物長度為15bp-50bp， 且特異性地雜交并擴增出含人《7^<"基因第九號外顯子的如序列表SEQ ID NO. 1所示序列的第1739-1740位的單核苷酸多態(tài)性的擴增產物。
步驟一中，所述分離核酸，該核酸具有序列表SEQ ID N0.2所示的序列。
步驟一中，所述分離純化具體為在基因組DNA水平上，利用引物來擴增 每個多態(tài)性位點的基因序列和利用純化試劑盒對擴增產物進行提純。
步驟二中，所述檢測，具體包括以下方法DNA測序法、雜交測序法、酶促 錯配切割法、異源雙鏈分析法、點雜交法、寡核苷酸陣列法、微測序法、Taqman 技術、分子信標法、變性高效液相色譜法。
用于本發(fā)明的測試樣品中抽提出的DNA或mRNA。對于OT^CP基因的第九號 外顯子活性而言，可以是任何含有CJ7^"基因的第九號外顯子的樣品。
與現有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的效果本發(fā)明是一項原創(chuàng)性的發(fā)明。本發(fā)明的內容涉及一種分離出的或純化的cr尸i^p基因的第九號外顯子多態(tài)
性位點的基因序列，所說的"分離出的或純化的"是指在基因組DNA水平上，
利用引物對來擴增多態(tài)性位點的基因序列和利用純化試劑盒對擴增產物進行提
純。通過對所取樣品cr尸i^p基因測序結果，在兩個地區(qū)中發(fā)現了 i個樣品含有 cr尸it^基因的第九號外顯子snp和2個樣品含有6t尸iV"基因的第九號外顯子 SNP。本發(fā)明為研究我國人群中6t尸^"基因多態(tài)性與臨床用藥安全的關系奠定
了基礎，為藥物設計和臨床用藥個體化提供了基因學理論根據，同時也為基于藥 物基因組學理念的新藥研發(fā)提供指導依據。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常
按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條 件。
實施例
步驟一，核酸的分離和測序 引物設計
采用Primer 5. 0軟件，以GenBank數據庫CF/^C9基因(NM—000771)，第 九號外顯子以及外顯子與內含子接合部位序列為模板設計一對等位基因特異性 的核酸引物，由Invitrogen公司合成。
引物信息
擴增Cr尸iV"基因的第九號外顯子SNP位點的DNA序列引物信息 正向引物 5，-CTCTGTGCCGCCCTTCTAC-3'; 反向引物 5'墨TACCCTCTTCCTCTTTGTCC隱3，。
PCR擴增條件體系各項試劑除DNA外均由Bio-Asia公司提供， 反應體系總體積為15W，其中各反應試劑的用量表述如下 ddH20 10.
10 X Buffer 1.5Ml，其中聚合反應緩沖液包含KC1 Tris-HC1溶液DMSO 0. 2mM d證1.
10pM正反向引物各0. 6^1 5U Taq 0.
lOng DNA 0. 10ng 。 PCR反應條件
94°C 3mins; 14X (94。C 30 seconds; 64°C 30 seconds, -0. 5°C/CYCLE; 72 。C lmin;); 30X (94°C 30 seconds; 57。C 30 seconds; 72 °C lmin;); 72°C 10mins。
測序反應均作正反向，條件如下
擴增產物酶純化法PCR產物2W加入2W純化酶系，其中純化酶系內含 SAP(Shrimp alkaline phosphatase,堿性磷酸酶)0. 15u/ul和Exo-nuclease I(核酸外切酶I) 0. 75u/ul， 37。C 30mins,85。C 20mins， 4°C保存?zhèn)溆谩?br> 須!l序采用ABI公司的Prism BigDye terminator (BDT) cycle sequencing reaction kit試劑盒進行測序，測序總體積為5W，其中純化后的PCR產物4W， BDT 0. 5J4，正向或反向引物0. 5W。反應條件是94°C 2 mins，之后是35個循 環(huán)，每個循環(huán)為94。C 30 seconds, 55。C 40 seconds, 60 °C 1.5 mins ， 4 °C保存?zhèn)溆谩?br> 上樣前純化5W測序產物中加入無水乙醇和3.0 mol / L醋酸鈉混 合液，混合液中無水乙醇與醋酸鈉溶液的體積比為25: 1，室溫、避光、靜置 15min，4000rpm/min 45mins, 700rpm/min 5 seconds,棄上清；2X (75%Alcohol 25Pl，4000 rpm/min lOmins, 700rpm/min 5 seconds,棄上清)；室溫、避光、 靜置、風干20mins;上樣于3100測序儀進行測序。
步驟二， SNP的獲得
對6Tfit^基因進行直接測序，將測定的各樣本序列與GenBank數據庫 CT尸》"基因序列(NM一000771)進行比較，從而得出序列的差異。在一地區(qū)中 發(fā)現了 1個樣品含有6T尸itP基因第九號外顯子SNP，即第1739-1740位^Ze7AT， 而其它樣品的基因型均為AT，只有這1個樣品的基因型為在另一個地區(qū)中發(fā)現了 2個樣品含有67/^<"基因的第九號外顯子SNP，即第1739-1740位 A7AT,而其它樣品的基因型均為AT,只有這2個樣品的基因型為^Ze7AT。經分 析發(fā)現，該SNP位于3， - UTR區(qū)域，而3， - UTR區(qū)域與轉錄的mRNA的穩(wěn)定 性有關。
6T尸iV"基因CDS與3' -UTR及其多態(tài)性位點的CDS與3' -UTR序列如SEQ NO. l所示:
(a) 序列特征 *長度1836堿基對
*類型核酸 *鏈型雙鏈
(b) 反義:否
(c) 最初來源人
(d) SEQ ID NO. 1核酸序列描述如下
atggattctcttgtggtccttgtgctctgtctctcatgtttgcttctcctttcactctgg60
agEica^gctctggg卿ggeiaaactccctcctggccccactcctctcccagtgattgga120
aetta/tcctac3ga^ggtEitta^ggacatcagca^3tccttaaccaatctctcaaaggtc180
tatggcccggtgttcactctgtattttggcctgaaacccettagtggtgctgcatggatat240
g犯gC3gtg3aggaagccctgattgatcttgg卿gg&gttttctggaagaggcattttc300
ccactggctga^agagctaacagaggatttggaattgttttcagcaatgga^gEia^tgg360
a^ggaga/tccggcgtttctccctcatgacgctgcggaattttgggatgggg犯gElggELgC420
3ttgaggaccgtgttcaagagg犯gcccgctgccttgtgg3gg3gUgElga^a^eicca^g480
gcctcaccctgtgatcccactttCEltCCtgggctgtgctccctgcaatgtgatctgctcc540
attattttcca/taaacgttttgattataaag3tcagc肌tttcttaactta^tggaa犯g600
ttgaatgaaaeic3tcaagErttttgetgcagcccctggatccagatctgcaataatttttct660
cctatcattgattacttcccgggaactcacttaaa^cgttgcttttatg720
Etaaagttatattttgg犯犯ca^ccaagaeitca^tgga^cEitga^c犯ccct780
caggEictttattgattgcttcctgatgEia^atggag犯ggccaaccatct840
gaatttactattgaaagcttggeia^CEictgcagttgacttgtttggagctgggacagag9003Cg3CElELgCElcaaccctgag atatgctctc cttctcctgc tgaagcaccc agaggtcaca %0gctaaagtcc3gg肌g卿ttgaacgtgtgattggcagaa a<ccgg￡igcccctgcatgcaa1020
g3CElggELgCCacatgccctacetcagatgctgtggtgC3Cg ElggtCC卿gatacattgac1080
cttctccccaccagcctgccccatgcagtgacctgtgacei tta犯t;tcagaaactatctc1140
Eittcccaagggcacaaccatattaatttccctgacttctg tgctacatga1200
tttcccaacccagagatgtttgaccctcatcactttctgg atgaaggtggcaattttaag1260
acttcatgcctttctcagcaggaaaacgga tttgtgtgggag肌gccctg1320
gccggcatggagctgtttttattcctgacctccattttac agaactttaacctgaaatct1380
ctggttgacccaaag肌ccttgacaccactccagttgtca atgga/tttgcctctgtgccg1440
cccttctaccagctgtgcttcattcctgtctga^ga^g3g C3g3tggcctggctgctgct1500
gtgcagtccctgcagctctctttcctctggggcattatcc atctttcactatctgtaatg1560
ccttttctcacctgtcatctcacattttcccttccctgaa gatctagtgaacattcgacc1620
tccattacggagagtttcctatgtttcactgtgcaaatat atctgctattctccatactc1680
tgtaacagttgcattgactgtcacataatgctcatactta tctaatgttgagttattaat1740
Eitgttattattaaatagagaaatatgatttgtgtatta^ Eittca^ggcatttcttttc1800
tgcatgttctcattattatttgctgei 1836
擴增H7^C^基因的第九號外顯子SNP位點以及外顯子與內含子接合部位的 DNA序列，得到的序列如SEQ NO. 2所示
(a) 序列特征 *長度532堿基對 *類型核酸 *鏈型雙鏈
(b) 反義否 (C)最初來源人
(d) SEQ ID N0.2核酸序列描述如下 ctctgtgccg cccttctacc agctgtgctt cattcctgtc tgaagaagag cagatggcct 60 ggctgctgct gtgcagtccc tgcagctctc tttcctctgg ggcattatcc atctttcact 120atctgtaatg ccttttctca cctgtcatct cacattttcc cttccctgaa gatctagtga 180 acattcgacc tccattacgg agagtttcct atgtttcact gtgcaaatat atctgctatt 240 ctccatactc tgtaacagtt gcattgactg tcacataatg ctcatactta tctaatgttg 300 agttatta[-/3t] atgttattat taaatagaga犯tatgattt gtgtattEita attc犯aggc 360
atttcttttc tgcatgttct aaataaaaag cattattatt tgctgagtca gtttattaga 4=20 ccttccttct tttatgCEit3 a^gtaggtcEi gaaattaaag犯aata^gt tccaggaggc 480 catgctggtt ctcaaaatga taaggacaga aaggacaaag aggaagaggg ta 532
本發(fā)明實施例中采用的樣品包括來自四個地區(qū)的樣本。對所取樣品進行
CT尸iv"基因的PCR擴增與測序，根據對所取樣品cr尸》"基因測序結果，在其中
一個地區(qū)發(fā)現了 1個樣品含有^T尸i^^基因的第九號外顯子SNP，即第1739-1740 位A7AT;在另一個地區(qū)中發(fā)現了2個樣品含有C7/^C^基因的第九號外顯子SNP, 即第1739-1740位(Ze7AT。序列表
SEQ ID NO. 1
<110>上海交通大學
<120> CT尸itP基因第九號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法 <160> 3 <210> 1 <211> 1836 <212> DNA
<213>人(Homo sapiens) <220>
<221> misc_feature <222> (1739-1740) <223> ii =at或-<220> <221> CDS <222> (1)...(1836) <400>
atggattctcttgtggtccttgtgctctgtctctcatgtttgcttctcctttcactctgg60
agacagagctctggg柳ggaaaactccctcctggccccactcctctccc3gtgEittgga^120
aatatcctactaaggeica^cagcaaatcctta^cc犯tctctca犯ggtc180
tatggcccggtgttcactctgtattttggcctg3aaccc3tagtggtgctgcatggatat240
g犯gcagtg3agg肌gccctg3ttg3tcttgg柳ggagttttctgga^gaggcattttc300
ccactggctgaaeig8Lgctaacagaggatttggaeittgttttcagcaatgg犯eLgeLELeitgg360
a^ggetga/tccggcgtttctccctcatgacgctgcggaattttgggatgggga卿gga^c420
attgaggaccgtgttcaagagg犯gcccgctgccttgtgga gg￡igttgag480
gcctcaccctgtgatcccactttcatcctgggctgtgctccctgcaatgtgatctgctcc540attattttcc ataaacgttt tgattataaa gatcagcaat ttcttaactt aatggaaaag 600 ttgaatgaaa acatcaagat tttgagcagc ccctggatcc agatctgcaa taatttttct 660 cctatcattg attacttccc gggaactcac aacaaattac ttaaaaacgt tgcttttatg 720 aaaagtt3t3 ttttgga^aa 3gtaeiaaga^ cacca^g犯t c犯tggaceit g犯ca^ccct 780 caggacttta ttgattgctt cctgatgaaa atggagaagg aaaagcacaa ccaaccatct 840 g肌tttacta ttgaaagctt gga^aac3ct gcEigttgeict tgtttggagc tgggaca^g 900 acgacaagca caaccctgag atatgctctc cttctcctgc tgaagcaccc agaggtcaca 960
gctaaagtcctg肌cgtgtgattggcEiga^accggagcccctgceitgc犯1020
gacaggagccacatgccctacacagatgctgtggtgcacg3ggtCC卿gatacattgac1080
cttctcoccaCCELgCCtgCCccatgcagtgacctgtgacatta^ttcagaaactatctc1140
attcccaagggcacaaccatattaatttccctgacttctgtgctacatgaca^ca^3g犯1200
tttcccaacccag3g3tgtttgaccctcatC3Ctttctgga>tga^ggtggcaatttt犯g1260
acttcatgcctttctcagcagga^犯cgg3tttgtgtgggagaagccctg1320
gccggcatggELgCtgtttttattcctgacctccattttac3g犯ctttaacctgaaatct1380
ctggttgacccaa3gaaccttgacaccactccagttgtcaatggatttgcctctgtgccg1440
cccttctaccagctgtgcttcattcctgtccagatggcctggctgctgct1500
gtgcagtccctgcagctctctttcctctggggcattatccatctttcactatctgtaatg1560
ccttttctcacctgtcatctcacattttcccttccctgaagatctagtgaacattcgacc1620
tccattacggagagtttcctatgtttcactgtgcaaeitatatctgctattctccatactc1680
tgtaacagttgcattgactgtcacataatgctcatacttatctaatgttgagttattaat1740
6itgttattatta^a/ta^gagaaatatgatttgtgtattataattcaaaggcatttcttttc1800
tgcatgttctcattattettttgctga 1836
SEQ ID NO. 2 <210> 2 <211> 532 <212> DNA
<213>人(Homo sapiens)<formula>formula see original document page 12</formula>
權利要求
1、一種CYP2C9基因第九號外顯子單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于包括如下步驟步驟一，以GenBank數據庫中CYP2C9基因第九號外顯子以及外顯子與內含子接合部位序列為模板設計一對等位基因特異性的核酸引物，利用引物對來擴增CYP2C9基因的第九號外顯子的DNA序列，對擴增產物進行分離純化，得到相應分離核酸；步驟二，對分離核酸的CYP2C9基因第九號外顯子的第1739-1740位核苷酸進行檢測，確定其是否存在單核苷酸多態(tài)性，即兩個堿基AT的缺失。
2、 根據權利要求1所述的6T/^C;9基因第九號外顯子單核苷酸多態(tài)性的檢 測方法，其特征在于，步驟一中，所述一對等位基因特異性的核酸引物，該引 物長度為15bp-50bp，且特異性地雜交并擴增出含人C^^C;9基因第九號外顯子 的如序列表SEQ ID NO. 1所示序列的第1739-1740位的單核苷酸多態(tài)性的擴增 產物。
3、 根據權利要求1所述的6T/^"基因第九號外顯子單核苷酸多態(tài)性的檢 測方法，其特征在于，步驟一中，所述分離核酸，該核酸具有序列表SEQIDN0.2 所示的序列。
4、 根據權利要求1所述的Cf尸it^基因第九號外顯子單核苷酸多態(tài)性的檢 測方法，其特征在于，步驟一中，所述分離純化具體為在基因組DNA水平上， 利用引物對用來擴增每個多態(tài)性位點的基因序列進行提純和利用純化試劑盒對 擴增產物進行提純。
5、 根據權利要求i所述的cr尸》"基因第九號外顯子單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，步驟二中，所述檢測，具體包括以下方法DNA測序法、 雜交測序法、酶促錯配切割法、異源雙鏈分析法、點雜交法、寡核苷酸陣列法、 微測序法、Taqman技術、分子信標法、變性高效液相色譜法。
全文摘要
一種基因工程技術領域的CYP2C9基因第九號外顯子單核苷酸多態(tài)性的檢測方法。方法包括步驟一，以GenBank數據庫中CYP2C9基因第九號外顯子以及外顯子與內含子接合部位序列為模板設計一對等位基因特異性的核酸引物，利用引物對來擴增CYP2C9基因的第九號外顯子的DNA序列，對擴增產物進行分離純化，得到相應分離核酸；步驟二，對分離核酸的CYP2C9基因第九號外顯子的第1739-1740位核苷酸進行檢測，確定其是否存在單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明可用于研究我國人群中CYP2C9基因多態(tài)性與臨床用藥安全的關系，為新藥研發(fā)提供了指導依據。
文檔編號C12Q1/68GK101434994SQ20081020777
公開日2009年5月20日 申請日期2008年12月25日 優(yōu)先權日2008年12月25日
發(fā)明者熊玉宇, 鳴 王, 秦勝營, 林 賀 申請人:上海交通大學