專利名稱：：一種利用限制性內(nèi)切酶防止pcr污染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及檢測領(lǐng)域，更具體地涉及一種利用限制性內(nèi)切酶防止PCR污染的方法。
背景技術(shù)：
：PCR是分子生物學(xué)中擴(kuò)增DNA片段的一種非常常用的方法，靈敏度極高。然而，PCR反應(yīng)經(jīng)常會出現(xiàn)污染，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果，這是PCR方法面臨的最大的問題?！N常見的造成PCR假陽性的主要原因是PCR產(chǎn)物的污染。當(dāng)一個(gè)實(shí)驗(yàn)室(如醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)室)多次或反復(fù)通過某一特定PCR反應(yīng)進(jìn)行檢測(例如檢測模板為受試者的基因組DNA)，那么會在陽性樣品的PCR反應(yīng)中獲得正常的PCR產(chǎn)物。然而，這些陽性的PCR產(chǎn)物很可能殘留在實(shí)驗(yàn)室中的桌面、容器、儀器、或其他地方，并在下次PCR反應(yīng)的檢測過程中混入PCR反應(yīng)體系中，從而在原本陰性的樣品中因?yàn)榍耙淮蜳CR產(chǎn)物的污染而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。目前常用的和主流的防止PCR污染的辦法是UNG酶技術(shù)。該方法是在PCR體系中摻入dUTP，從而使得擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物中含有dUTP;然后，在后續(xù)的PCR體系中加入U(xiǎn)NG酶，孵育一段時(shí)間后再進(jìn)行PCR，因UDG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU而阻止DNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴(kuò)增的能力，因此可以消除由之前的PCR產(chǎn)物引起的污染。然而，此方法有兩大缺陷一、由于dUTP不是DNA聚合酶的特異性底物，會大大降低PCR的效率，對長片段的擴(kuò)增十分不利。二、帶有dU的PCR產(chǎn)物不同于正常的DNA，會增加探針雜交、分子克隆等下游實(shí)驗(yàn)的難度和煩瑣程度。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)簡便有效地防止PCR污染的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種簡便有效地防止PCR污染的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種減少聚合酶鏈反應(yīng)PCR假陽性的方法，包括步驟(a)將PCR反應(yīng)體系在IIS型限制性內(nèi)切酶的酶切溫度下保溫一段時(shí)間，從而使得所述的限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)體系中可能存在的污染物，其中，所述的PCR體系含有所述IIS型限制性內(nèi)切酶；(b)滅活PCR反應(yīng)體系中的所述的IIS型限制性內(nèi)切酶，從而獲得IIS型限制性內(nèi)切酶被滅活的PCR反應(yīng)體系；禾口(c)對步驟(b)獲得的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。在另一優(yōu)選例中，所述的PCR擴(kuò)增包括"變性-退火-延伸"的循環(huán)(通常為20-50個(gè)循環(huán)，較佳地為25-40個(gè)循環(huán))。在另一優(yōu)選例中，所述的污染物是在步驟(a)之前的PCR反應(yīng)中所形成的、且與步驟(c)中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相同的擴(kuò)增產(chǎn)物。在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，在酶切溫度下的保溫時(shí)間為5-60分鐘，較佳地10-30分鐘。在另一優(yōu)選例中，所述的IIS型限制性內(nèi)切酶選自下組AlwI、Bbs1、BbvI、BciV工、Bpm工、Bsa1、BsmA1、BsmF工、Eci工、Fok工、Hga工、Hph工、Mbo11、或MmeI。在另一優(yōu)選例中，所述的IIS型限制性內(nèi)切酶選自下組BbvI、Bpm1、BsmFI、EciI、FokI、HgaI或MmeI。在另一優(yōu)選例中，所述的PCR體系中含有的PCR引物具有以下特征引物由3'端、5'端以及位于兩端之間的中間區(qū)域所構(gòu)成；引物的3'端為與模板特異性配對(或完全互補(bǔ))的互補(bǔ)結(jié)合區(qū)域，互補(bǔ)結(jié)合區(qū)的長度為15-40個(gè)堿基(較佳地為18-30個(gè)堿基)，引物的中間區(qū)域?yàn)镮IS型限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，長度為4-6個(gè)堿基(更佳地為4-5個(gè)堿基)；禾口引物的5'端是IIS型限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的保護(hù)區(qū)，長度為2-10個(gè)堿基(更佳地為3-6個(gè)堿基)。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，滅活PCR反應(yīng)體系中的所述的IIS型限制性內(nèi)切酶是使得所述的PCR反應(yīng)體系在60-9『C保持1-15分鐘，從而使得不耐熱的IIS型限制性內(nèi)切酶被滅活。在另一優(yōu)選例中，上述方法中的PCR反應(yīng)體系是本發(fā)明第二方面中所述的PCR反應(yīng)體系。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的反應(yīng)體系，所述的反應(yīng)體系含有以下組分PCR反應(yīng)緩沖液；進(jìn)行PCR反應(yīng)的原料dATP、dTTP、dCTP和dGTP;正向引物和反向引物；耐熱的PCR聚合酶IIS型限制性內(nèi)切酶并且，其中PCR正向引物和反向引物具有以下特征引物由3'端、5'端以及位于兩端之間的中間區(qū)域所構(gòu)成；引物的3'端為與模板特異性配對或完全互補(bǔ)的互補(bǔ)結(jié)合區(qū)域，互補(bǔ)結(jié)合區(qū)的長度為15-40個(gè)堿基，較佳地為18-30個(gè)堿基，引物的中間區(qū)域?yàn)?IS型限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，長度為4-6個(gè)堿基，更佳地為4-5個(gè)堿基；禾口引物的5'端是IIS型限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的保護(hù)區(qū)，長度為2-10個(gè)堿基(更佳地為3-6個(gè)堿基)。在另一優(yōu)選例中，所述的反應(yīng)體系為溶液。更佳地，所述的反應(yīng)體系中還含有待擴(kuò)增的模板。更佳地，所述的模板為哺乳動物(如人)的基因組DNA。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種試劑盒，所述的試劑盒包括(i)容器，以及位于容器內(nèi)的引物對，所述的引物對包括正向引物和反向引物，正向引物和反向引物具有以下5特征引物由3'端、5'端以及位于兩端之間的中間區(qū)域所構(gòu)成；引物的3'端為與模板特異性配對或完全互補(bǔ)的互補(bǔ)結(jié)合區(qū)域，互補(bǔ)結(jié)合區(qū)的長度為15-40個(gè)堿基，較佳地為18-30個(gè)堿基，引物的中間區(qū)域?yàn)?IS型限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，長度為4-6個(gè)堿基，更佳地為4-5個(gè)堿基；禾口引物的5'端是IIS型限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的保護(hù)區(qū)，長度為2-10個(gè)堿基(更佳地為3-6個(gè)堿基)；以及(ii)用于告訴用戶按本發(fā)明第一方面中所述方法進(jìn)行PCR檢測從而減少聚合酶鏈反應(yīng)PCR假陽性的說明書。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種設(shè)計(jì)聚合酶鏈反應(yīng)的引物的方法，包括步驟(a)根據(jù)待擴(kuò)增的模板，確定待擴(kuò)增區(qū)域所對應(yīng)的核苷酸序列；(b)分析所述的核苷酸序列，并選擇一種在所述核苷酸序列中不存在酶切位點(diǎn)的IIS型限制性內(nèi)切酶；(c)根據(jù)所述的核苷酸序列和所述的IIS型限制性內(nèi)切酶，設(shè)計(jì)具有以下特征的聚合酶鏈反應(yīng)引物(包括PCR正向引物和/或反向引物)引物由3'端、5'端以及位于兩端之間的中間區(qū)域所構(gòu)成；引物的3'端為與模板特異性配對或完全互補(bǔ)的互補(bǔ)結(jié)合區(qū)域，互補(bǔ)結(jié)合區(qū)的長度為15-40個(gè)堿基，較佳地為18-30個(gè)堿基，引物的中間區(qū)域?yàn)?IS型限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，長度為4-6個(gè)堿基，更佳地為4-5個(gè)堿基；禾口引物的5'端是IIS型限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的保護(hù)區(qū)，長度為2-10個(gè)堿基(更佳地為3-6個(gè)堿基)。在另一優(yōu)選例中，該方法還包括步驟(d):合成步驟(c)中所設(shè)計(jì)的引物。在另一優(yōu)選例中，所述的IIS型限制性內(nèi)切酶選自下組:AlwI、BbsI、Bbvl、BciVI、Bpm1、Bsa1、BsmA1、BsmF1、Eci1、Fok1、Hga1、Hph1、Mbo11、或MmeI。在另一優(yōu)選例中，所述的IIS型限制性內(nèi)切酶選自下組Bbv1、Bpm1、BsmFI、EciI、FokI、HgaI或MmeI。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)，本申請上述以及下述的各技術(shù)特征可以各種方式進(jìn)行組合，以構(gòu)成各種優(yōu)選例。例如，IIS型限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的保護(hù)區(qū)的長度一般范圍的下限2個(gè)堿基可以與優(yōu)選范圍的上限6個(gè)堿基進(jìn)行組合，從而構(gòu)成范圍2-6個(gè)堿基。圖1顯示了本發(fā)明引物的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2顯示了本發(fā)明方法的作用原理圖。圖3顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的檢測結(jié)果。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次開發(fā)了一種在不改變PCR反應(yīng)體系和PCR產(chǎn)物屬性的情況下，利用限制性內(nèi)切酶，特異性識別位于在引物5'端的特定序列從而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增之前將可能存在的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染物的3'端切斷，以消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。如本文所用，術(shù)語"本發(fā)明的限制性內(nèi)切酶"或"IIS型限制性內(nèi)切酶"可互換使用。如本領(lǐng)域所知曉的那樣，ns型限制性內(nèi)切酶指一類識別特定的核酸序列，但切口不在識別序列內(nèi)而是在其外側(cè)若干個(gè)(通常為卜20bp)堿基處的限制性內(nèi)切酶。如本文所用，術(shù)語"PCR污染物"、"PCR污染產(chǎn)物"或"PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(污染物)"可互換使用，指前次或之前的PCR反應(yīng)中所形成的、可能會導(dǎo)致假陽性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(污染物)。如本文所用，術(shù)語"前次"、"以前"或"之前"與PCR產(chǎn)物聯(lián)用時(shí)，可互換使用，都指在本次PCR反應(yīng)之前的任何一次PCR中所形成的PCR污染產(chǎn)物。簡而言之，本發(fā)明是利用一類特殊的IIS型限制性內(nèi)切酶來特異性切斷PCR產(chǎn)物污染物中引物3'端結(jié)合的部分，使PCR引物不能結(jié)合從而消除污染。為了便于理解本發(fā)明，本發(fā)明人提供了以下基本原理。然而，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受限于本發(fā)明的基本原理。參見圖1和圖2。本發(fā)明的基本原理是，在PCR引物的5'端加入IIS型限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，這一類酶識別特定的核酸序列，但切口不在識別序列內(nèi)而是在其外側(cè)若干個(gè)(通常為l至20bp)堿基處。應(yīng)用時(shí)，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，在引物的5'端增加一個(gè)酶的識別位點(diǎn)和保護(hù)堿基。這樣，首次PCR反應(yīng)會擴(kuò)增獲得PCR產(chǎn)物。然而該P(yáng)CR產(chǎn)物可能成為后續(xù)PCR反應(yīng)的污染物。因此，在進(jìn)行后續(xù)的PCR時(shí)，在反應(yīng)體系中加入識別所述位點(diǎn)的IIS型限制性內(nèi)切酶，于第一次熱變性之前孵育一段時(shí)間，從而使內(nèi)切酶消化體系中可能混入的前次PCR產(chǎn)物(污染物)。然后，再進(jìn)行新一輪的PCR(其中，在高溫變性步驟中，不耐熱的IIS型限制性內(nèi)切酶被滅活)。因?yàn)楸景l(fā)明的限制性內(nèi)切酶的切口在靠近引物的3'端(因而也靠近PCR污染物的兩端)，在被本發(fā)明的限制性內(nèi)切酶消化后，消化后的PCR污染物就不再含有與引物互補(bǔ)的長度足夠長的結(jié)合區(qū)，因而不能在常規(guī)的退火溫度下與引物有效結(jié)合，因此PCR引物也就不能以前次PCR產(chǎn)物(污染物)為模板進(jìn)行延伸，從而有效的杜絕了PCR產(chǎn)物的污染問題。引物設(shè)計(jì)在設(shè)計(jì)引物時(shí)，在引物的5'端增加IIS型限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)和保護(hù)堿基，如圖l所示，引物的3'端為常規(guī)的與模板特異性配對的區(qū)域，一般為18至30個(gè)堿基的，中間為IIS型限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)一般為4至6個(gè)堿基，最后5'端為3至4個(gè)保護(hù)堿基。由這樣的引物擴(kuò)增而得的PCR產(chǎn)物，其一個(gè)或兩個(gè)末端含有內(nèi)切酶識別位點(diǎn)?？捎糜诒景l(fā)明的IIS型限制性內(nèi)切酶沒有特別限制，可以是本領(lǐng)域中已知的或?qū)戆l(fā)現(xiàn)的各種IIS型限制性內(nèi)切酶。代表性的IIS型限制性內(nèi)切酶包括(但并不限于)下表中所列出的種類。表l:可用的內(nèi)切酶表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>設(shè)計(jì)時(shí)宜按下面三個(gè)原則注意選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶—是目的DNA片段內(nèi)應(yīng)無所選擇的限制性內(nèi)切酶的識別序列；二是酶切位置距離識別位點(diǎn)距離越遠(yuǎn)越好，至少5個(gè)堿基以上；三是內(nèi)切酶在PCR體系里有較高活性和特異性。因此，特別優(yōu)選的IIS型限制性內(nèi)切酶是BbvI、BpmI、BsmFI、EciI、FokI、HgaI禾口MmeI。雖然在本發(fā)明中可以同時(shí)使用一種或多種IIS型限制性內(nèi)切酶，但通常使用一種就足夠了，而且使用一種11S型限制性內(nèi)切酶時(shí)在成本上更為有利。在設(shè)計(jì)時(shí)，應(yīng)當(dāng)選用在目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物中原本沒有識別位點(diǎn)的IIS型限制性內(nèi)切酶。例如，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中原本沒有BpmI的識別位點(diǎn)，那么可以在引物5'端加上CTGGAG(BpmI識別位點(diǎn))，然后在PCR第一次熱變性之前加入BpmI于37。C孵育30分鐘。酶切反應(yīng)在本發(fā)明方法中，在進(jìn)行PCR反應(yīng)之前，用本發(fā)明相應(yīng)的IIS型限制性內(nèi)切酶對反應(yīng)體系中可能存在的之前的PCR污染產(chǎn)物進(jìn)行消化，從而消除假陽性。在本發(fā)明中，酶切反應(yīng)的溫度、時(shí)間等條件沒有特別限制，可按本領(lǐng)域常規(guī)的條件進(jìn)行。例如，對于20-100微升的PCR反應(yīng)體系而言，通常在PCR反應(yīng)體系中加入例如15U的IIS型限制性內(nèi)切酶，在內(nèi)切酶活性最佳的溫度范圍內(nèi)(通常為內(nèi)切酶的最佳溫度士2t:內(nèi))孵育5-60分鐘(較佳地10-30分鐘)后，再進(jìn)行PCR循環(huán)。當(dāng)然，如果需要，還可適當(dāng)?shù)脑黾臃跤龝r(shí)間(例如在污染較嚴(yán)重或懷疑存在嚴(yán)重污染的情況下)。PCR反應(yīng)在本發(fā)明方法中，在用IIS型限制性內(nèi)切酶酶切可能的PCR污染物之后，可先對內(nèi)切酶進(jìn)行滅活。一種優(yōu)選的方法是升高PCR體系的溫度，并在高溫(如60-98°C，較佳地70-98°C，更佳地80-96°C)保溫一段時(shí)間(如1_15分鐘，較佳地2-10分鐘，更佳地3_8分鐘)，從而使得不耐熱的IIS型限制性內(nèi)切酶滅活。一種典型的滅活手段是在酶切反應(yīng)后先95t:孵育5分鐘，從而滅活內(nèi)切酶。在IIS型限制性內(nèi)切酶被滅活后，即可進(jìn)行PCR反應(yīng)。在本發(fā)明中，PCR反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)、溫度、時(shí)間、酶用量等條件沒有特別限制，可按本領(lǐng)域常規(guī)的PCR條件進(jìn)行。換言之，在本發(fā)明方法中，PCR反應(yīng)條件與常規(guī)PCR—樣，無需作特別調(diào)整。在本發(fā)明的優(yōu)選例中，PCR反應(yīng)是在IIS型限制性內(nèi)切酶和耐高溫的聚合酶的優(yōu)選pH范圍內(nèi)進(jìn)行，例如在pH7.5-8.8范圍中進(jìn)行，較佳地在pH7.9_8.4范圍中進(jìn)行，以便IIS型限制性內(nèi)切酶和耐高溫的聚合酶(如Taq酶)都能夠很好地工作。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(a)本發(fā)明方法不改變PCR反應(yīng)體系和PCR產(chǎn)物屬性，便于進(jìn)行后續(xù)的探針雜交、分子克隆等下游實(shí)驗(yàn)。(b)本發(fā)明方法對長片段的擴(kuò)增較為有利。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1擴(kuò)增人p53基因外顯子-4序列人p53基因外顯子-4的序列如SEQIDNO:1所示。tcccccttgccgtcccaagcaatggatgatttgatgctgtccccggacgatattgaacaatggttcactgaagacccaggtccagatgaagctcccagaatgccagaggctgctccccgcgtggcccctgcaccagcagctcctacaccggcggcccctgcaccagccccctcctggcccctgtcatcttctgtcccttcccagaaaacctaccagggcagctacggtttccgtctgggcttcttgcattctgggacagccaagtctgtgacttgcacg(SEQIDNO:1)注粗體部分為外側(cè)引物結(jié)合位置，下劃線部分為內(nèi)側(cè)引物結(jié)合位置在本實(shí)施例中，檢測目的是以人的基因組DNA為模板，擴(kuò)增人p53基因的外顯子-4的片段。在本實(shí)施例中，鑒于SEQIDNO:1中無BpmI酶切位點(diǎn)，故選用IIS型限制性內(nèi)切酶BpmI來防止PCR污染(當(dāng)然，對于SEQIDNO:1而言，也可以選用IIS型限制性內(nèi)切酶AlwI，BciVI，BsaI，BsmAI，HgaI，HphI，MmeI等)。1.設(shè)計(jì)引物外側(cè)引物正向引物Primer-Fl:5'-TAACTGGAGCTTGCCGTCCCAAGCTG_3，(SEQIDNO:2)反向引物Primer-Rl:5'-ATACTGGAGGTGCAAGTCACAGAC77GGCTG-3，(SEQIDNO:3)下劃線部分為Bpml酶識別位點(diǎn)Bpml酶切位點(diǎn)為5'…CTGGAG(N)w…3，3，...GACCTC(N)14...59因此，BpmI在SEQIDNO:2的斜體"AA"之間(在識別位點(diǎn)下游16個(gè)堿基處)和SEQIDN0:3的斜體"TT"之間進(jìn)行切割。切割后，在PCR產(chǎn)物(污染物)的兩端分別僅剩下5個(gè)和8個(gè)堿基的與引物結(jié)合(或咬合)的結(jié)合區(qū)，因此不能在常規(guī)的PCR退火溫度下與SEQIDNO:2和3所示的引物有效結(jié)合。應(yīng)注意，因?yàn)槊冈贒NA雙鏈上切割的位置是錯(cuò)開的，即對于引物咬合的模板的互補(bǔ)鏈?zhǔn)乔懈钤谙掠?4堿基處，而對于引物所代表的DNA鏈來講，才是切割在斜體標(biāo)記的堿基中間。內(nèi)測引物為了檢測PCR污染物的確被IIS型限制性內(nèi)切酶所消化，還設(shè)計(jì)合成了以下內(nèi)側(cè)引物。正向引物Primer-F2:5'-CAATGGATGATTTGATGCTGTC-3'(SEQIDNO:4)反向引物Primer-R2:5'-AGAAGCCCAGACGGAAACC-3，(SEQIDNO:5)內(nèi)側(cè)引物結(jié)合位置為外側(cè)的Primer-Fl/Primer-Rl引物下游15bp以上的區(qū)域。:0109]2.配置PCR體系:0110]10XTaq緩沖液5ii1:0川]d證(各2.5mM):5ii1:0112]正向引物(SEQIDNO:2或4)氺(2iiM):1:0113]反向引物(SEQIDNO:3或5)*(2iiM):1:0114]模板2.0ill:0115]TaqDNA聚合酶(5U/ii1):0.5ii1:0116]BpmI(5U/ii1):0.5ii1:0117]ddH20:力瞎50iU*注在l-4號反應(yīng)管中引物使用Primer-Fl/Primer-Rl，5號管引物使用內(nèi)側(cè)引物Primer-F2/Primer-R2。PCR反應(yīng)體系的pH值為8.4。分別以含有人p53基因外顯子-4片段的市售pSK-p53質(zhì)粒(A)或稀釋10000倍的前次PCR產(chǎn)物(B)(污染物)為模板，在體系中加入或者不加入Bpml進(jìn)行PCR反應(yīng)。3.反應(yīng)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>反應(yīng)產(chǎn)物保存于4t:。當(dāng)引物對是外側(cè)引物Primer-Fl/Primer-Rl時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為292bp。當(dāng)引物對是內(nèi)側(cè)引物Primer-F2/Primer-R2時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為225bp。4.電泳鑒定對PCR反應(yīng)進(jìn)行常規(guī)的電泳檢測，結(jié)果如圖3所示。圖3中，泳道1-4都是用Primer-Fl/Rl擴(kuò)增的產(chǎn)物，而5是用Primer-F2/R2擴(kuò)增的產(chǎn)物。泳道1和2是以質(zhì)粒為模板擴(kuò)增的產(chǎn)物，都有明顯條帶，說明能夠擴(kuò)增出目的片段，并且BpmI不影響PCR反應(yīng)。泳道3和4是以稀釋10000倍的前次PCR產(chǎn)物為模板擴(kuò)增的產(chǎn)物，模擬PCR污染的狀況，其中泳道4為加入了BpmI處理，產(chǎn)物中沒有條帶，而3號樣品沒有加入BpmI處理，則擴(kuò)增出了明顯的條帶，表明經(jīng)BpmI處理后，消除了由前次PCR產(chǎn)物引起的污染。泳道5為使用內(nèi)側(cè)引物以稀釋10000倍的前次PCR產(chǎn)物為模板，并且加入了BpmI處理后擴(kuò)增的產(chǎn)物，有明顯條帶，證明BpmI只是切斷了前次PCR產(chǎn)物的兩端外側(cè)引物結(jié)合的小片段，而不影響內(nèi)部的片段，其可以被內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增。上述結(jié)果表明，用IIS型限制性內(nèi)切酶BpmI消化了前次PCR污染物后，可以有效地顯著減少甚至消除PCR污染物所導(dǎo)致假陽性。實(shí)施例2擴(kuò)增人p53基因外顯子-4序列重復(fù)實(shí)施例l，不同點(diǎn)僅在于用常規(guī)方法抽提的人基因組DNA替換實(shí)施例1中的含有人p53基因外顯子-4片段的市售pSK-p53質(zhì)粒(A)。結(jié)果同樣表明，用IIS型限制性內(nèi)切酶BpmI消化了前次PCR污染物后，可以有效地顯著減少甚至消除PCR污染物所導(dǎo)致假陽性。實(shí)施例3擴(kuò)增人DAPK基因重復(fù)實(shí)施例2，不同點(diǎn)在于本實(shí)施例中檢測對象是人DAPK基因，其長度為1707bp。因此，所用的IIS型限制性內(nèi)切酶為FokI，所用的引物如下正向引物5'-ATTGGATGAGGTTGCCACGCTCCACTA-3，(SEQIDNO:6)反向引物5'-AATGGATGCGCCTCACTGGGAGCAATC-3，(SEQIDNO:7)下劃線部分為FokI酶識別位點(diǎn)Fokl酶切位點(diǎn)為5'…GGATG(N)9…3'3，...CCTAC(N)13...5分別以常規(guī)方法抽提的人基因組DNA(A)或稀釋10000倍的前次PCR產(chǎn)物(B)(污染物)為模板，在體系中加入或者不加入IIS型限制性內(nèi)切酶FokI進(jìn)行PCR反應(yīng)。其中，PCR反應(yīng)體系的pH值為8.4。結(jié)果表明，用IIS型限制性內(nèi)切酶FokI消化了前次PCR污染物后，可以有效地顯著減少甚至消除PCR污染物所導(dǎo)致假陽性。并且，對于長擴(kuò)增產(chǎn)物而言，在添加了IIS型限制性內(nèi)切酶并滅活后，對于長片段PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增幾乎無影響(與未添加IIS型限制性內(nèi)切酶的對照相比)，因此與常規(guī)的UNG酶技術(shù)相比，更為有利。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可11以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表〈110〉上海透景生命科技有限公司<120>—種新型的利用限制性內(nèi)切酶防止PCR污染的方法〈130〉088289〈160>7〈170>PatentInversion3.5〈210>1〈211>279〈212〉DNA〈213〉智人(Homosapiens)〈400〉1tcccccttgccgtcccaagcaatggatgatttgatgctgtccccggacgatattgaacaa60tggttcactgaagacccaggtccagatgaagctcccagaatgccagaggctgctccccgc120gtggcccctgcaccagcagctcctacaccggcggcccctgcaccagccccctcctggccc180ctgtcatcttctgtcccttcccagaaaaccteccagggcagctecggtttccgtctgggc240ttcttgcattctgggacagccaagtctgtgacttgcacg279〈210>2〈211>28<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc—feature〈223〉引物<400>2taactggagcttgccgtcccaagcaatg28〈210>3〈211>31〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>3atactggaggtgcaagtcacagacttggctg31〈210>4〈211>22〈212>DNA120185]〈213〉人工序列0186]〈220〉0187]〈221>misc_feature0188]〈223〉引物0189]〈400>40190]caatggatgatttgatgctgtc0191]〈210>50192]〈211>190193]〈212>DNA0194]〈213〉人工序列.0195]<220>:0196]〈221>misc_feature:0197]〈223〉引物:0198]〈400>5:0199]3g朋gccc3g3cgg朋acc:0200]〈210>6:0201]〈211>27:0202]〈212>DNA:0203]〈213〉人工序列:0204]〈220〉:0205]〈22l>misc—feature:0206]〈223〉引物〈400〉6attggatgaggttgccacgctccacta〈210>7〈211>27〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>7aatggatgcgcctcactgggagc朋tc1權(quán)利要求一種減少聚合酶鏈反應(yīng)PCR假陽性的方法，其特征在于，包括步驟(a)將PCR反應(yīng)體系在IIS型限制性內(nèi)切酶的酶切溫度下保溫一段時(shí)間，從而使得所述的限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)體系中可能存在的污染物，其中，所述的PCR體系含有所述IIS型限制性內(nèi)切酶；(b)滅活PCR反應(yīng)體系中的所述的IIS型限制性內(nèi)切酶，從而獲得IIS型限制性內(nèi)切酶被滅活的PCR反應(yīng)體系；和(c)對步驟(b)獲得的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的污染物是在步驟(a)之前的PCR反應(yīng)中所形成的、且與步驟(c)中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相同的擴(kuò)增產(chǎn)物。3.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中，在酶切溫度下的保溫時(shí)間為5-60分鐘，較佳地10-30分鐘。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的IIS型限制性內(nèi)切酶選自下組AlwI、BbsI、BbvI、BciVI、BpmI、BsaI、BsmAI、BsmFI、EciI、FokI、HgaI、HphI、MboII、或MmeI。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的IIS型限制性內(nèi)切酶選自下組BbvI、BpmI、BsmFI、EciI、FokI、HgaI或MmeI。6.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的PCR體系中含有的PCR引物具有以下特征引物由3'端、5'端以及位于兩端之間的中間區(qū)域所構(gòu)成；引物的3'端為與模板特異性配對或完全互補(bǔ)的互補(bǔ)結(jié)合區(qū)域，互補(bǔ)結(jié)合區(qū)的長度為15-40個(gè)堿基，較佳地為18-30個(gè)堿基，引物的中間區(qū)域?yàn)镮IS型限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，長度為4-6個(gè)堿基；禾口引物的5'端是IIS型限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的保護(hù)區(qū)，長度為2-10個(gè)堿基。7.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，滅活PCR反應(yīng)體系中的所述的IIS型限制性內(nèi)切酶是使得所述的PCR反應(yīng)體系在60-9『C保持1-15分鐘，從而使得不耐熱的IIS型限制性內(nèi)切酶被滅活。8.—種用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的反應(yīng)體系，其特征在于，所述的反應(yīng)體系含有以下組分PCR反應(yīng)緩沖液；進(jìn)行PCR反應(yīng)的原料dATP、dTTP、dCTP和dGTP;正向引物和反向引物；耐熱的PCR聚合酶IIS型限制性內(nèi)切酶并且，其中PCR正向引物和反向引物具有以下特征引物由3'端、5'端以及位于兩端之間的中間區(qū)域所構(gòu)成；引物的3'端為與模板特異性配對或完全互補(bǔ)的互補(bǔ)結(jié)合區(qū)域，互補(bǔ)結(jié)合區(qū)的長度為15-40個(gè)堿基，較佳地為18-30個(gè)堿基，引物的中間區(qū)域?yàn)镮IS型限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，長度為4-6個(gè)堿基；禾口引物的5'端是IIS型限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的保護(hù)區(qū)，長度為2-10個(gè)堿基。9.一種試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括(i)容器，以及位于容器內(nèi)的引物對，所述的引物對包括正向引物和反向引物，正向引物和反向引物具有以下特征引物由3'端、5'端以及位于兩端之間的中間區(qū)域所構(gòu)成；引物的3'端為與模板特異性配對或完全互補(bǔ)的互補(bǔ)結(jié)合區(qū)域，互補(bǔ)結(jié)合區(qū)的長度為15-40個(gè)堿基，較佳地為18-30個(gè)堿基，引物的中間區(qū)域?yàn)镮IS型限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，長度為4-6個(gè)堿基；禾口引物的5'端是IIS型限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的保護(hù)區(qū)，長度為2-10個(gè)堿基；以及(ii)用于告訴用戶按本發(fā)明第一方面中所述方法進(jìn)行PCR檢測從而減少聚合酶鏈反應(yīng)PCR假陽性的說明書。10.—種設(shè)計(jì)聚合酶鏈反應(yīng)的引物的方法，其特征在于，包括步驟(a)根據(jù)待擴(kuò)增的模板，確定待擴(kuò)增區(qū)域所對應(yīng)的核苷酸序列；(b)分析所述的核苷酸序列，并選擇一種在所述核苷酸序列中不存在酶切位點(diǎn)的IIS型限制性內(nèi)切酶；(c)根據(jù)所述的核苷酸序列和所述的IIS型限制性內(nèi)切酶，設(shè)計(jì)具有以下特征的聚合酶鏈反應(yīng)引物，所述的引物包括PCR正向引物和/或反向引物引物由3'端、5'端以及位于兩端之間的中間區(qū)域所構(gòu)成；引物的3'端為與模板特異性配對或完全互補(bǔ)的互補(bǔ)結(jié)合區(qū)域，互補(bǔ)結(jié)合區(qū)的長度為15-40個(gè)堿基，較佳地為18-30個(gè)堿基，引物的中間區(qū)域?yàn)镮IS型限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，長度為4-6個(gè)堿基；禾口引物的5'端是IIS型限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的保護(hù)區(qū)，長度為2-10個(gè)堿基。全文摘要本發(fā)明提供了一種利用限制性內(nèi)切酶防止PCR污染的方法。具體地，本發(fā)明方法包括步驟(a)將PCR反應(yīng)體系在IIS型限制性內(nèi)切酶的酶切溫度下保溫一段時(shí)間，從而消化反應(yīng)體系中可能存在的污染物；(b)滅活I(lǐng)IS型限制性內(nèi)切酶；和(c)對PCR反應(yīng)體系進(jìn)行退火-延伸-變性的循環(huán)，從而獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明可簡便有效地防止前次PCR產(chǎn)物所造成的污染。文檔編號C12Q1/68GK101768629SQ200810208128公開日2010年7月7日申請日期2008年12月29日優(yōu)先權(quán)日2008年12月29日發(fā)明者姚見兒,李久彤,白艷軍,談暢申請人:上海透景生命科技有限公司