專利名稱：一種功能菌群在水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定性的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種功能菌群的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的高速增長(zhǎng)，城市化水平的不斷提高，水污染問題日趨嚴(yán)峻。 水處理系統(tǒng)中生物處理以其成本低、效果好、無二次污染成為水污染治理的主 要手段。但是，對(duì)于難降解有機(jī)化合物而言，傳統(tǒng)的生物處理系統(tǒng)中缺乏存在 有效降解微生物，而且傳統(tǒng)生物處理方法還存在以下缺陷1)降解速率慢；2) 降解效果不穩(wěn)定；3)系統(tǒng)中需較長(zhǎng)時(shí)間才能產(chǎn)生降解性微生物，啟動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)。
直接投加對(duì)目標(biāo)污染物具有特效降解能力的微生物(即功能菌群)是目前 較為常用的技術(shù)手段。功能菌經(jīng)過篩選、培養(yǎng)、馴化之后投入到水處理系統(tǒng)， 可附著在載體上形成生物膜，也可以以游離狀態(tài)存在。功能菌群以目標(biāo)污染物 為唯一碳源和能源，具有反應(yīng)系統(tǒng)啟動(dòng)期短、處理效果穩(wěn)定、降解速度快、處 理效果好等優(yōu)點(diǎn)。在生物水處理系統(tǒng)中科研人員希望功能菌群成為優(yōu)勢(shì)菌種， 但是功能菌群易受外界環(huán)境中物理、化學(xué)、營(yíng)養(yǎng)組成以及其他微生物的影響。
水處理系統(tǒng)中污水(外界環(huán)境)發(fā)生變化會(huì)導(dǎo)致功能菌群優(yōu)勢(shì)降低甚至喪 失，致使水處理系統(tǒng)不穩(wěn)定，影響出水水質(zhì)。因此，對(duì)水處理系統(tǒng)中功能菌群 的穩(wěn)定性進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)，可指導(dǎo)水處理系統(tǒng)工藝的優(yōu)化和調(diào)整，以保證功能菌 群的穩(wěn)定。
目前，對(duì)水處理系統(tǒng)中功能菌群穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)均是采用提取水處理系統(tǒng)中細(xì)
菌的總DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后應(yīng)用于變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析菌群結(jié)構(gòu)。 雖然這種方法能分析水處理系統(tǒng)中的菌群結(jié)構(gòu)，卻不能確定菌群的具體種屬。 由于隨著水處理系統(tǒng)的運(yùn)行功能菌群可能發(fā)生群落演替，而替代功能菌的新優(yōu) 勢(shì)菌可能與原功能菌屬于同一菌種；因此這種方法的檢測(cè)結(jié)果并不可靠。
目前還有人提出將PCR-DGGE測(cè)定后的特異性條帶回收后測(cè)序，通過 BLAST比對(duì)后確定水處理系統(tǒng)中微生物的種屬，但是此方法具有以下缺點(diǎn)
第一、只能確定菌屬仍然無法確定到種，因此對(duì)于功能菌群為伺屬不同種或著替代優(yōu)勢(shì)菌與功能菌同屬情況，難以起到監(jiān)測(cè)的作用；
第二、回收后的條帶通常需經(jīng)過TA克隆后才能進(jìn)行測(cè)序，.因此耗時(shí)長(zhǎng)， 且耗費(fèi)高；
第三、檢測(cè)結(jié)果容易出現(xiàn)失真現(xiàn)象，導(dǎo)致鑒定結(jié)果與實(shí)際不符。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決目前檢測(cè)水處理系統(tǒng)中功能菌群穩(wěn)定性的方法 存在無法確定微生物的菌種，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、耗費(fèi)高，及檢測(cè)結(jié)果易失真的問題， 而提供了一種功能菌群在水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定性的檢測(cè)方法。
功能菌群在水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定性按以下步驟進(jìn)行檢測(cè) 一、提取生物水處
理系統(tǒng)中微生物基因組總DNA; 二、用16srDNAV3區(qū)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增；三、PCR產(chǎn)物與水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品同步進(jìn)行DGGE分析，即 得出檢測(cè)結(jié)果；其中步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品按以下步驟獲得 a、水處理系統(tǒng)功能菌培養(yǎng)后分別固定于活性炭上；b、分別提取水處理系統(tǒng)功 能菌基因組總DNA; c、用16srDNAV3區(qū)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；d、取每 株功能菌PCR產(chǎn)物100pL混合，然后用核酸共沉劑將DNA沉淀析出，冷凍 干燥后-2(TC保存，使用前溶解于100)iLTE緩沖溶液或無菌去離子水中，制成 樣品；e、樣品與全部單一功能菌同步進(jìn)行DGGE分析，樣品條帶與單一功能 菌條帶一一對(duì)應(yīng)為水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品；步驟二中16srDNAV3區(qū)通 用上游引物BSF338的堿基序列為5，-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，， 16s rDNA V3 區(qū)通用下游引物 BSR534 的堿基.序列為 5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG畫3，；步驟二 中16s rDNA V3區(qū)通用引物PCR反應(yīng)體系為50jiL，其中上游引物的濃度為 0.5nmol/L、下游引物的濃度為0.5pmol/L、 dNTP的濃度為200pmol/L、模板 為50ng、 10xPCR Buffer緩沖液為12.5pL、 Pfti DNA聚合酶為2.5U以及余量 的無菌純水；步驟二中16srDNAV3區(qū)通用引物PCR反應(yīng)條件94'C預(yù)變性 5min，然后20個(gè)循環(huán)的降落PCR， 94。C變性30s、退火溫度由65。C開始、每 2個(gè)循環(huán)退火溫度降低1°C、退火lmin、 20個(gè)循環(huán)后退火溫度為55°C、 72°C 延伸lmin，之后10個(gè)循環(huán)94。C變性lmin、 55。C退火min、 72。C延伸lmin， 最后72。C延伸5min;步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟c中16s rDNA V3 區(qū)通用上游引物BSF338 的堿基序列為 5，-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，， 16s rDNA V3區(qū)通用下游引物BSR534 的 堿 基 序 列 為
5，-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3，；步驟三 中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟c中16srDNAV3區(qū)通用引物PCR 反應(yīng)體系為50|iL，其中上游引物的濃度為0.5nmol/L、下游引物的濃度為 0.5pmol/L、 dNTP的濃度為200(imol/L、模板為50ng、 lOxPCR Buffer緩沖液 為12.5pL、 PfliDNA聚合酶為2.5U以及余量的無菌純水；步驟三中水處理系 統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟c中16s rDNA V3區(qū)通用引物PCR反應(yīng)條件 94°C預(yù)變性 5min， 然后20個(gè)循環(huán)的降落PCR， 94t:變性30s、退火溫度由65 。C開始、每2個(gè)循環(huán)退火溫度降低1°C、退火lmin、 20個(gè)循環(huán)后退火溫度為 55°C、 72。C延伸lmin，之后10個(gè)循環(huán)94。C變性lmin、 55。C退火min、 72°C 延伸lmin，最后72'C延伸5min。
本發(fā)明方法能夠確定被測(cè)微生物的菌種，保證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性，其檢 測(cè)結(jié)果能更為合理和有效的指導(dǎo)水處理系統(tǒng)工藝，確保水處理系統(tǒng)出水水質(zhì)。 本發(fā)明方法檢測(cè)耗費(fèi)低，且檢測(cè)時(shí)間短，省去了條帶回收及BLAST比對(duì)的時(shí) 間。而且，本發(fā)明方法檢測(cè)結(jié)果好，條帶明亮清晰，不易失真。


圖1是具體實(shí)施方式
十步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步 驟b中水處理系統(tǒng)中功能菌基因組總DNA提取結(jié)果圖，圖1中"M"泳道標(biāo) 樣為Marker, "1"泳道標(biāo)樣為惡臭假單胞菌，"2"泳道標(biāo)樣為穿孔假單胞菌， "3"泳道標(biāo)樣為枯草芽孢桿菌，"4"泳道標(biāo)樣為不動(dòng)桿菌，"5"泳道標(biāo)樣為 魯菲氏不動(dòng)細(xì)菌，"6"泳道標(biāo)樣為5株混合菌。圖2是具體實(shí)施方式
十步驟三 中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟e中樣品與全部單一功能菌同步 進(jìn)行DGGE分析結(jié)果圖，圖2中"1"泳道標(biāo)樣為樣品(5株功能菌)，"2"泳 道標(biāo)樣為不動(dòng)桿菌，"3"泳道標(biāo)樣為惡臭假單胞菌，"4"泳道標(biāo)樣為魯菲式不 動(dòng)細(xì)菌，"5"泳道標(biāo)樣為穿孔假單胞菌，"6"泳道標(biāo)樣為枯草芽孢桿菌。圖3 是具體實(shí)施方式
十步驟三中PCR產(chǎn)物與水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品同步進(jìn) 行DGGE分析的結(jié)果圖，圖3中"1"泳道標(biāo)樣為水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品，"2"泳道標(biāo)樣為水處理系統(tǒng)微生物PCR產(chǎn)物。圖4是具體實(shí)施方式
十中 常規(guī)細(xì)菌基因組DNA提取方法分別提取水處理系統(tǒng)功能菌基因組總DNA的 結(jié)果圖，圖4中"1"泳道標(biāo)樣為穿孔假單胞菌，"2"泳道標(biāo)樣為惡臭假單胞 菌，"3"泳道標(biāo)樣為不動(dòng)桿菌，"4"泳道標(biāo)樣為魯菲氏不動(dòng)細(xì)菌，"5"泳道標(biāo) 樣為枯草芽孢桿菌，"M"泳道標(biāo)樣為Marker。圖5是具體實(shí)施方式
十中現(xiàn)有 細(xì)菌基因組DNA提取方法分別提取水處理系統(tǒng)功能菌基因組總DNA的結(jié)果 圖，圖5中"1"泳道標(biāo)樣為惡臭假單胞菌，"2"泳道標(biāo)樣為穿孔假單胞菌， "3"泳道標(biāo)樣為枯草芽孢桿菌，"4"泳道標(biāo)樣為不動(dòng)桿菌，"5"泳道標(biāo)樣為 魯菲氏不動(dòng)細(xì)菌，"M"泳道標(biāo)樣為Marker。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方 式間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式功能菌群在水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定性按以下步驟 進(jìn)行檢測(cè) 一、提取生物水處理系統(tǒng)中微生物基因組總DNA; 二、用16srDNA V3區(qū)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；三、PCR產(chǎn)物與水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品 同步進(jìn)行DGGE分析，即得出檢測(cè)結(jié)果；其中步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群 標(biāo)準(zhǔn)樣品按以下步驟獲得a、水處理系統(tǒng)功能菌培養(yǎng)后分別固定于活性炭上； b、分別提取水處理系統(tǒng)功能菌基因組總DNA; c、用16srDNAV3區(qū)通用引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；d、取每株功能菌PCR產(chǎn)物10(HiL混合，然后用核酸共沉 劑將DNA沉淀析出，冷凍干燥后-2(TC保存，使用前溶解于IO(VL TE緩沖溶 液或無菌去離子水中，制成樣品；e、樣品與全部單一功能菌同步進(jìn)行DGGE 分析，樣品條帶與單一功能菌條帶一一對(duì)應(yīng)為水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品； 步驟二中16s rDNA V3區(qū)通用上游引物BSF338的堿基序列為 5，-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，， 16srDNAV3區(qū)通用下游引物BSR534
的 堿 基 序 列 為
5,-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3，；步驟二 中16s rDNA V3區(qū)通用引物PCR反應(yīng)體系為50(iL，其中上游引物的濃度為 0.5|iimol/L、下游引物的濃度為0.5jimol/L、 dNTP的濃度為200pmol/L、模板 為50ng、 10xPCR Buffer緩沖液為12.5卩iL、 PfU DNA聚合酶為2.5U以及余量的無菌純水；步驟二中16srDNAV3區(qū)通用引物PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性 5min，然后20個(gè)循環(huán)的降落PCR， 94'C變性30s、退火溫度由65。C開始、每 2個(gè)循環(huán)退火溫度降低1°C、退火lmin、 20個(gè)循環(huán)后退火溫度為55°C、 72°C 延伸lmin，之后10個(gè)循環(huán)94。C變性lmin、 55。C退火min、 72。C延伸lmin， 最后72。C延伸5min;步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟c中 16s rDNA V3 區(qū)通用上游引物BSF338 的堿基序列為 5，-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，， 16s rDNA V3區(qū)通用下游引物BSR534 的 堿 基 序 列 為
5，-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3，；步驟三 中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟c中16s rDNA V3區(qū)通用引物PCR 反應(yīng)體系為50pL，其中上游引物的濃度為0.5pmol/L、下游引物的濃度為 0.5nmol/L、 dNTP的濃度為20(Himol/L、模板為50ng、 10xPCR Buffer緩沖液 為12.5^iL、 PfUDNA聚合酶為2.5U以及余量的無菌純水；步驟三中水處理系 統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟c中16srDNAV3區(qū)通用引物PCR反應(yīng)條件 94。C預(yù)變性5min，然后20個(gè)循環(huán)的降落PCR， 94。C變性30s、退火溫度由65 'C開始、每2個(gè)循環(huán)退火溫度降低TC、退火lmin、 20個(gè)循環(huán)后退火溫度為 55°C、 72i:延伸lmin，之后10個(gè)循環(huán)94。C變性lmin、 55。C退火min、 72°C 延伸lmin，最后72"C延伸5min。
本實(shí)施方式中步驟三按DGGE操作指南進(jìn)行操作。本實(shí)施方式中步驟三 中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟e與步驟三中DGGE的操作相同。
本實(shí)施方式中生物水處理系統(tǒng)中微生物DGGE分析條帶與水處理系統(tǒng)功 能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品條帶進(jìn)行一一比對(duì)。如水處理系統(tǒng)中微生物條帶能與功能菌群 標(biāo)準(zhǔn)樣品條帶對(duì)應(yīng)，則說明所對(duì)應(yīng)的功能菌存在于水處理系統(tǒng)中；如水處理系 統(tǒng)中微生物條帶沒有對(duì)應(yīng)的功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品條帶，則說明水處理系統(tǒng)中定該 微生物不屬于功能菌群所在菌種，需要水處理系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)整或優(yōu)化。
本實(shí)施方式步驟二中16s rDNA V3區(qū)通用引物PCR反應(yīng)體系中10xPCR Buffer緩沖液中含有MgCl2。
本實(shí)施方式步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟c中16s rDNAV3區(qū)通用引物PCR反應(yīng)體系中10xPCRBuffer緩沖液中含有MgCl2。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟三中水 處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟a水處理系統(tǒng)功能菌培養(yǎng)后分別固定
于活性炭上分別挑選水處理系統(tǒng)功能菌單菌落轉(zhuǎn)入5mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng) l2~16h，然后離心，離心沉淀分別用lmL無菌水重懸，再將重懸液接種于無 菌的活性炭體系中，固定48h;其中活性炭體系由100mL水和10g活性炭組 成。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二的不同點(diǎn)是步驟三中水 處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟b將5g固定有功能菌群的活性炭置于 三角瓶中加入5mL DNA抽提緩沖液進(jìn)行超聲振蕩，然后加入100 濃度為 50mg/mL的蛋白酶K，在37°C、 225r/min的條件下?lián)u床30min，之后加入3mL 質(zhì)量濃度為10%的SDS裂解液，再置于65。C環(huán)境中水浴2h，而后將三角瓶 中的物質(zhì)移入50mL離心管在室溫、12000r/min的條件下離心10min,向離心 上清液中加入等體積的氯仿/異戊醇在12000r/min條件下離心30min，并用體 積濃度為75%乙醇清洗離心沉淀，再將離心沉淀溶解于TE緩沖液，即可得到 功能菌群基因組總DNA。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二相同。
本實(shí)施方式步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟b中超聲 振蕩時(shí)間為10s，超聲振蕩時(shí)間過長(zhǎng)易導(dǎo)致DNA片段斷裂。
本實(shí)施方式步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟b中65°C 水浴過程中每隔15 20min搖動(dòng)三角瓶一次。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟三中水 處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟b中氯仿/異戊醇中氯仿與異戊醇的體 積比為24:1。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟三中水 處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟b中DNA抽提緩沖液中Tris-HCl的濃 度為10Ommol/L、 EDTA的濃度為10Ommol/L、磷酸鹽緩沖液的濃度為 10Ommol/L、 NaCl的濃度為1.5mol/L、 CTAB的濃度為1% (質(zhì)量濃度)；DNA 抽提緩沖液pH值為8.0。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一、二、三、四或五的不同 點(diǎn)是步驟三中DGGE分析中選用濃度為8。/。的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑高濃度端濃度為60%,變性劑低濃度端濃度為30%; DGGE分析在150V電壓、60 。C條件下電泳4h。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一、二、三、四或五相同。 本實(shí)施方式其它操作均與DGGE操作指南相同。
本實(shí)施方式步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟e中的 DGGE操作與步驟三中DGGE操作相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一、二、三、四、五或六的 不同點(diǎn)是步驟一將5g功能菌群負(fù)載載體置于三角瓶中加入5mL DNA抽提 緩沖液進(jìn)行超聲振蕩，然后加入100 濃度為50mg/mL的蛋白酶K，在37 °C、 225r/min的條件下?lián)u床30min，之后加入3mL質(zhì)量濃度為10%的SDS 裂解液，再置于65。C環(huán)境中水浴2h，而后將三角瓶中的物質(zhì)移入50mL離心 管在室溫、12000r/min的條件下離心10min，向離心上清液中加入等體積的氯 仿/異戊醇在12000r/min條件下離心30min，并用體積濃度為75%乙醇清洗離 心沉淀，再將離心沉淀溶解于TE緩沖液，即可得到微生物基因組總DNA。 其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一、二、三、四、五或六相同。
本實(shí)施方式功能菌群若以游離狀態(tài)存在于水處理系統(tǒng)中則用5mL含菌液 替代本實(shí)施方式步驟一中的5g功能菌群負(fù)載載體。
本實(shí)施方式步驟一中超聲振蕩時(shí)間為10s。
本實(shí)施方式步驟一中65。C水浴過程中每隔15 20min搖動(dòng)三角瓶一次。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
七的不同點(diǎn)是步驟一中氯
仿/異戊醇中氯仿與異戊醇的體積比為24:1。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式七相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
七或八的不同點(diǎn)是步驟一
中DNA抽提緩沖液中Tris-HCl的濃度為100mmol/L、 EDTA的濃度為 10Ommol/L、磷酸鹽緩沖液的濃度為10Ommol/L、 NaCl的濃度為1.5mol/L、 CTAB的濃度為1。/。(質(zhì)量濃度)；DNA抽提緩沖液pH值為8.0。其它步驟及 參數(shù)與實(shí)施方式七或八相同。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式水處理系統(tǒng)中功能菌群由不動(dòng)桿菌 (細(xì)WtefeW謂-mcbrellneri )、 魯菲式不動(dòng)細(xì)菌(爿c/"eto6"Clwoffii畫GC subgroup)、惡臭假單胞菌(尸"wfifomo"os-putida-biotype A)、穿孔假單胞菌(/^M(i蘭owas-pertucinogena)、枯草芽孢桿菌(B鎖7/,subtilis)組成；本實(shí) 施方式將5株功能菌(不動(dòng)桿菌、魯菲式不動(dòng)細(xì)菌、惡臭假單胞菌、穿孔假單 胞菌和枯草芽孢桿菌)發(fā)酵后混合固定于活性炭上，固定化后通水洗脫培養(yǎng)基， 之后在水處理系統(tǒng)中運(yùn)行7天，取樣監(jiān)測(cè)功能菌群穩(wěn)定情況。
功能菌群在水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定性按以下步驟進(jìn)行檢測(cè) 一、提取生物水處
理系統(tǒng)中微生物基因組總DNA; 二、用16srDNAV3區(qū)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增；三、PCR產(chǎn)物與水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品同步進(jìn)行DGGE分析，即 得出檢測(cè)結(jié)果(將凝膠銀染后如圖3所示)；其中步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌 群標(biāo)準(zhǔn)樣品按以下步驟獲得a、水處理系統(tǒng)功能菌培養(yǎng)后分別固定于活性炭 上；b、分別提取水處理系統(tǒng)功能菌基因組總DNA (提取結(jié)果如圖1所示)；c、 用16srDNAV3區(qū)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；d、取每株功能菌PCR產(chǎn)物lOOpL 混合，然后用核酸共沉劑將DNA沉淀析出，冷凍干燥后-20。C保存，使用前溶 解于100pLTE緩沖溶液或無菌去離子水中，制成樣品；e、樣品與全部單一功 能菌同步進(jìn)行DGGE分析(分析結(jié)果如圖2所示)樣品條帶與單一功能菌條 帶一一對(duì)應(yīng)，說明是水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品；步驟二中16srDNAV3 區(qū)通用上游引物 BSF338 的堿基序列為 5，-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，， 16srDNAV3區(qū)通用下游引物可以不寫 的 堿 基 序 列 為
5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3，；步驟二 中16s rDNA V3區(qū)通用引物PCR反應(yīng)體系為50jiL，其中上游引物的濃度為 0.5pmol/L、下游引物的濃度為0.5|amol/L、 dNTP的濃度為200jmiol/L、模板 為50ng、 10xPCR Buffer緩沖液為12.5jjL、 Pfb dna聚合酶為2.5U以及余量 的無菌純水；步驟二中16srDNAV3區(qū)通用引物PCR反應(yīng)條件94"C預(yù)變性 5min，然后20個(gè)循環(huán)的降落PCR， 94'C變性30s、退火溫度由65。C開始、每 2個(gè)循環(huán)退火溫度降低1°C、退火lmin、 20個(gè)循環(huán)后退火溫度為55°C、 72°C 延伸lmin，之后10個(gè)循環(huán)94。C變性lmin、 55。C退火min、 72。C延伸lmin， 最后72。C延伸5min;步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟c中 16s rDNA V3 區(qū)通用上游引物BSF338 的堿基序列為 5，-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，， 16s rDNA V3區(qū)通用下游引物BSR534的 堿 基 序 列 為
5 ，畫CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG隱3 ，；步驟三
中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟c中16s rDNA V3區(qū)通用引物PCR 反應(yīng)體系為50pL，其中上游引物的濃度為0.5pmol/L、下游引物的濃度為 0.5pmol/L、 dNTP的濃度為20(Vmol/L、模板為50ng、 10xPCR Buffer緩沖液 為12.5piL、 PfUDNA聚合酶為2.5U以及余量的無菌純水；步驟三中水處理系 統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟c中16srDNAV3區(qū)通用引物PCR反應(yīng)條件 94。C預(yù)變性5min，然后20個(gè)循環(huán)的降落PCR， 94。C變性30s、退火溫度由65 "C開始、每2個(gè)循環(huán)退火溫度降低1°C、退火lmin、 20個(gè)循環(huán)后退火溫度為 55°C、 72。C延伸lmin，之后10個(gè)循環(huán)94。C變性lmin、 55。C退火min、 72°C 延伸lmin，最后72t:延伸5min。
本實(shí)施方式步驟二中16s rDNA V3區(qū)通用引物PCR反應(yīng)體系中10xPCR Buffer緩沖液中含有MgCl2。
本實(shí)施方式步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟c中16s rDNAV3區(qū)通用引物PCR反應(yīng)體系中10xPCRBuffer緩沖液中含有MgCl2。
本實(shí)施方式步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟a水處理 系統(tǒng)功能菌培養(yǎng)后分別固定于活性炭上分別挑選水處理系統(tǒng)功能菌單菌落轉(zhuǎn) 入5mLLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)14h，然后離心，離心沉淀分別用lmL無菌水重懸， 再將重懸液接種于無菌的活性炭體系中，固定48h;其中活性炭體系由lOOmL 水和10g活性炭組成。
本實(shí)施方式步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟b將5g在 水處理系統(tǒng)中運(yùn)行7天的樣品(固定有功能菌群的活性炭)置于三角瓶中加入 5mL DNA抽提緩沖液進(jìn)行超聲振蕩10s，然后加入100 濃度為50mg/mL的 蛋白酶K，在37'C、 225r/min的條件下?lián)u床30min，之后加入3mL質(zhì)量濃度 為10%的SDS裂解液，再置于65"C環(huán)境中水浴2h，水浴過程中每隔15 20min 搖動(dòng)三角瓶一次，而后將三角瓶中的物質(zhì)移入50mL離心管在室溫、12000r/min 的條件下離心10min，向離心上清液中加入等體積的氯仿/異戊醇(體積比為 24:1)在12000r/min條件下離心30min，并用體積濃度為75%乙醇清洗離心沉 淀，再將離心沉淀溶解于TE緩沖液，即可得到功能菌群基因組總DNA。本實(shí)施方式步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟b中DNA 抽提緩沖液中Tris-HCl的濃度為100mmol/L、 EDTA的濃度為100mmol/L、磷 酸鹽緩沖液的濃度為100mmol/L、 NaCl的濃度為1.5mol/L、 CTAB的濃度為 1% (質(zhì)量濃度)；DNA抽提緩沖液pH值為8.0。
本實(shí)施方式步驟三中DGGE分析中選用濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠，變 性劑高濃度端濃度為60%,變性劑低濃度端濃度為30%; DGGE分析在150V 電壓、60。C條件下電泳4h。本實(shí)施方式中步驟三按DGGE操作指南進(jìn)行操作， 其它均與DGGE操作指南相同。本實(shí)施方式步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo) 準(zhǔn)樣品的制備步驟e中的DGGE操作與步驟三中DGGE操作相同。
本實(shí)施方式步驟一將5g負(fù)載有功能菌群的活性炭置于三角瓶中加入5mL DNA抽提緩沖液進(jìn)行超聲振蕩10s，然后加入100 (iL濃度為50mg/mL的蛋白 酶K，在37°C、 225r/min的條件下?lián)u床30min，之后加入3mL質(zhì)量濃度為10% 的SDS裂解液，再置于65"C環(huán)境中水浴2h，水浴過程中每隔15 20min搖動(dòng) 三角瓶一次，而后將三角瓶中的物質(zhì)移入50mL離心管在室溫、12000r/min的 條件下離心10min，向離心上清液中加入等體積的氯仿/異戊醇(體積比為24:1) 在12000r/min條件下離心30min，并用體積濃度為75%乙醇清洗離心沉淀，再 將離心沉淀溶解于TE緩沖液，即可得到微生物基因組總DNA。
本實(shí)施方式步驟一中DNA抽提緩沖液中Tris-HCl的濃度為10Ommol/L、 EDTA的濃度為10Ommol/L、磷酸鹽緩沖液的濃度為10Ommol/L、 NaCl的濃 度為1.5mol/L、 CTAB的濃度為1% (質(zhì)量濃度)；DNA抽提緩沖液pH值為 8.0。 -
圖3檢測(cè)結(jié)果表明除穿孔假單胞菌(第3條)量小穩(wěn)定性差之外，其余功 能菌群生長(zhǎng)正常。本發(fā)明可以直觀觀察出菌群種類變化。
采用常規(guī)細(xì)菌基因組DNA提取方法分別提取水處理系統(tǒng)功能菌基因組總 DNA:
取惡臭假單胞菌、穿孔假單胞菌、枯草芽孢桿菌、不動(dòng)桿菌和魯菲氏不動(dòng) 細(xì)菌單菌落接種于5mLLB培養(yǎng)基中在3(TC條件下培養(yǎng)16 24h后，無菌條件 下取500|aL菌液轉(zhuǎn)入50mL LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)16 24h，溫度為30°C 。50mL 菌液離心后，棄上清，用lmLPBS(100mmol/LNaCl， 0.01g/mlPVP， 20mmol/LEDTA， 50mmol/LTris， pH值為10)緩沖液清洗沉淀，12000r/min離心5min， 取沉淀，加入567nL的TE緩沖液重懸，加入30 質(zhì)量濃度為10%的SDS 和3 )iL濃度為20mg/mL的蛋白酶K混勻，于37 。C溫育lh。之后加入100 )iL 濃度為5mol/L的NaCl溶液，充分混勻，再加入80pL CTAB/NaCl溶液混勻， 于65 。C溫育10min，加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，12000r/min離心4 5min，將上清轉(zhuǎn)入一只新離心管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，離 心5min，將上清轉(zhuǎn)入新離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，醇沉30min， 12000r/min離心5min，棄上清，加入lml75。/。乙醇清洗，棄上清，干燥后，溶 于50pL的TE (10mmol/LTris-Hcl， lmmol/LEDTA， pH值為8.0)緩沖液中。
常規(guī)細(xì)菌基因組DNA提取方法提取水處理系統(tǒng)中功能菌基因組總DNA 的結(jié)果如圖4所示。圖4顯示出提取過程中由于不動(dòng)桿菌和魯菲氏不動(dòng)細(xì)菌以 及兩株假單胞菌菌液粘稠，離心過程中菌體不易沉淀，因此提取效果差，而且 DNA片段嚴(yán)重?cái)嗔选?br> 采用現(xiàn)有細(xì)菌基因組DNA提取方法分別提取水處理系統(tǒng)功能菌基因組總 DNA:
將10g固定有功能菌群的活性炭置于三角瓶中加入12mL DNA抽提緩沖 液進(jìn)行超聲振蕩10s，然后加入100 ^L濃度為100mg/mL的蛋白酶K，在37 °C、 225r/min的條件下?lián)u床30min，之后加入3mL質(zhì)量濃度為10%的SDS 裂解液，再置于65。C環(huán)境中水浴2h，而后將三角瓶中的物質(zhì)移入50mL離心 管在室溫、5000r/min的條件下離心10min，取離心上清液，再向離心沉淀中 再加入4mL質(zhì)量濃度為10%的SDS裂解液振蕩10s，然后置于65"C環(huán)境中 水浴10min，再在室溫、5000r/min的條件下離心10min，合并離心上清液、混 勻，之后加入等體積的氯仿/異戊醇在9000r/min條件下離心30min，并用體積 濃度為75%乙醇清洗離心沉淀，再將離心沉淀溶解于TE緩沖液，即可得到功 能菌群基因組總DNA。
現(xiàn)有細(xì)菌基因組DNA提取方法提取水處理系統(tǒng)中功能菌基因組總DNA 的結(jié)果如圖5所示?，F(xiàn)有細(xì)菌基因組DNA提取方法提取量大，且提取片段整 齊，不斷裂；但步驟繁瑣，而且試劑和樣品用量大。由于該檢測(cè)方法活性炭用 量大，實(shí)際運(yùn)用中會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)器內(nèi)活性炭大量減少，影響水處理效果。序列表
〈110>哈爾濱工業(yè)大學(xué)
〈120〉 一種功能菌群在水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定性的檢測(cè)方法
〈160〉 2
<210〉 1
〈211〉 20
<212> DNA <213〉人工序列
〈220>
〈223〉 16srDNAV3區(qū)通用上游引物BSF338。 <400〉 1
actcctacgg gaggcagcag 20
〈210〉 2 <211> 40 〈212〉腿 〈213〉人工序列
〈220〉
〈223〉 16srDNAV3區(qū)通用下游引物BSR534。 <400〉 2
cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccg 40
權(quán)利要求
1、一種功能菌群在水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定性的檢測(cè)方法，其特征在于功能菌群在水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定性按以下步驟進(jìn)行檢測(cè)一、提取生物水處理系統(tǒng)中微生物基因組總DNA；二、用16s rDNA V3區(qū)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；三、PCR產(chǎn)物與水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品同步進(jìn)行DGGE分析，即得出檢測(cè)結(jié)果；其中步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品按以下步驟獲得a、水處理系統(tǒng)功能菌培養(yǎng)后分別固定于活性炭上；b、分別提取水處理系統(tǒng)功能菌基因組總DNA；c、用16s rDNA V3區(qū)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；d、取每株功能菌PCR產(chǎn)物100μL混合，然后用核酸共沉劑將DNA沉淀析出，冷凍干燥后-20℃保存，使用前溶解于100μL TE緩沖溶液或無菌去離子水中，制成樣品；e、樣品與全部單一功能菌同步進(jìn)行DGGE分析，樣品條帶與單一功能菌條帶一一對(duì)應(yīng)為水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品；步驟二中16s rDNA V3區(qū)通用上游引物BSF338的堿基序列為5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，16s rDNA V3區(qū)通用下游引物BSR534的堿基序列為5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3’；步驟二中16s rDNA V3區(qū)通用引物PCR反應(yīng)體系為50μL，其中上游引物的濃度為0.5μmol/L、下游引物的濃度為0.5μmol/L、dNTP的濃度為200μmol/L、模板為50ng、10×PCR Buffer緩沖液為12.5μL、Pfu DNA聚合酶為2.5U以及余量的無菌純水；步驟二中16s rDNA V3區(qū)通用引物PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min，然后20個(gè)循環(huán)的降落PCR，94℃變性30s、退火溫度由65℃開始、每2個(gè)循環(huán)退火溫度降低1℃、退火1min、20個(gè)循環(huán)后退火溫度為55℃、72℃延伸1min，之后10個(gè)循環(huán)94℃變性1min、55℃退火min、72℃延伸1min，最后72℃延伸5min；步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟c中16s rDNA V3區(qū)通用上游引物BSF338的堿基序列為5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，16s rDNA V3區(qū)通用下游引物BSR534的堿基序列為5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3’；步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟c中16s rDNA V3區(qū)通用引物PCR反應(yīng)體系為50μL，其中上游引物的濃度為0.5μmol/L、下游引物的濃度為0.5μmol/L、dNTP的濃度為200μmol/L、模板為50ng、10×PCR Buffer緩沖液為12.5μL、Pfu DNA聚合酶為2.5U以及余量的無菌純水；步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟c中16s rDNA V3區(qū)通用引物PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min，然后20個(gè)循環(huán)的降落PCR，94℃變性30s、退火溫度由65℃開始、每2個(gè)循環(huán)退火溫度降低1℃、退火1min、20個(gè)循環(huán)后退火溫度為55℃、72℃延伸1min，之后10個(gè)循環(huán)94℃變性1min、55℃退火min、72℃延伸1min，最后72℃延伸5min。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能菌群在水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定性的檢測(cè)方 法，其特征在于步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟a水處理系 統(tǒng)功能菌培養(yǎng)后分別固定于活性炭上分別挑選水處理系統(tǒng)功能菌單菌落轉(zhuǎn)入 5mLLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 16h，然后離心，離心沉淀分別用lmL無菌水重懸， 再將重懸液接種于無菌的活性炭體系中，固定48h;其中活性炭體系由100mL 水和10g活性炭組成。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種功能菌群在水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定性的檢測(cè)方 法，其特征在于步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟b將5g固 定有功能菌群的活性炭置于三角瓶中加入5mL DNA抽提緩沖液進(jìn)行超聲振 蕩，然后加入100nL濃度為50mg/mL的蛋白酶K，在37。C、 225r/min的條件 下?lián)u床30min，之后加入3mL質(zhì)量濃度為10%的SDS裂解液，再置于65°C 環(huán)境中水浴2h，而后將三角瓶中的物質(zhì)移入50mL離心管在室溫、12000r/min 的條件下離心10min，向離心上清液中加入等體積的氯仿/異戊醇在12000r/min 條件下離心30min，并用體積濃度為75%乙醇清洗離心沉淀，再將離心沉淀溶 解于TE緩沖液，即可得到功能菌群基因組總DNA。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種功能菌群在水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定性的檢測(cè)方 法，其特征在于步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟b中氯仿/ 異戊醇中氯仿與異戊醇的體積比為24:1。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種功能菌群在水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定性的檢測(cè)方 法，其特征在于步驟三中水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟b中DNA 抽提緩沖液中Tris-HCl的濃度為10Ommol/L、 EDTA的濃度為10Ommol/L、磷 酸鹽緩沖液的濃度為10Ommol/L、 NaCl的濃度為1.5mol/L、 CTAB的濃度為1% (質(zhì)m濃度)；DNA抽提緩沖液pH值為8.0。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l、 2、 3、 4或5所述的一種功能菌群在水處理系統(tǒng)中穩(wěn) 定性的檢測(cè)方法，其特征在于步驟三中DGGE分析中選用濃度為8%的聚丙烯 酰胺凝膠，變性劑高濃度端濃度為60%,變性劑低濃度端濃度為30%; DGGE 分析在150V電壓、60"C條件下電泳4h。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種功能菌群在水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定性的檢測(cè)方 法，其特征在于步驟一將5g功能菌群負(fù)載載體置于三角瓶中加入5mL DNA 抽提緩沖液進(jìn)行超聲振蕩，然后加入100 jiL濃度為50mg/mL的蛋白酶K，在 37°C、 225r/min的條件下?lián)u床30min，之后加入3mL質(zhì)量濃度為10%的SDS 裂解液，再置于65。C環(huán)境中水浴2h，而后將三角瓶中的物質(zhì)移入50mL離心 管在室溫、12000r/min的條件下離心10min，向離心上清液中加入等體積的氯 仿/異戊醇在12000r/min條件下離心30min，并用體積濃度為75%乙醇清洗離 心沉淀，再將離心沉淀溶解于TE緩沖液，即可得到微生物基因組總DNA。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種功能菌群在水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定性的檢測(cè)方 法，其特征在于步驟一中氯仿/異戊醇中氯仿與異戊醇的體積比為24:1。
9、 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的一種功能菌群在水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定性的檢 測(cè)方法，其特征在于步驟一中DNA抽提緩沖液中Tris-HCl的濃度為 10Ommol/L、 EDTA的濃度為10Ommol/L、磷酸鹽緩沖液的濃度為10Ommol/L、 NaCl的濃度為1.5mol/L、 CTAB的濃度為1°/。(質(zhì)量濃度)；DNA抽提緩沖液 pH值為8.0。
全文摘要
一種功能菌群在水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定性的檢測(cè)方法，它涉及一種功能菌群的檢測(cè)方法。它解決了目前檢測(cè)水處理系統(tǒng)中功能菌群穩(wěn)定性的方法存在無法確定微生物的菌種，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、耗費(fèi)高，及檢測(cè)結(jié)果易失真的問題。檢測(cè)方法一、提取生物水處理系統(tǒng)中微生物基因組總DNA；二、用16s rDNA V3區(qū)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；三、PCR產(chǎn)物與水處理系統(tǒng)功能菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品同步進(jìn)行DGGE分析。本發(fā)明方法能夠確定被測(cè)微生物的菌種，保證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性，其檢測(cè)結(jié)果能更為合理和有效的指導(dǎo)水處理系統(tǒng)工藝，確保水處理系統(tǒng)出水水質(zhì)。本發(fā)明方法檢測(cè)耗費(fèi)低，且檢測(cè)時(shí)間短；而且本發(fā)明方法檢測(cè)結(jié)果好，條帶明亮清晰，不易失真。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101440406SQ200810209800
公開日2009年5月27日 申請(qǐng)日期2008年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日
發(fā)明者張多英, 李偉光, 王廣智, 解豐波, 郜玉楠 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)