專利名稱：：聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種豬胰島移植復(fù)合物的制備方法。
背景技術(shù)：
：豬的胰島素分子與人胰島素分子最為接近，僅有1個氨基酸不同。豬胰島素與人胰島素血糖調(diào)定點(diǎn)相似，豬胰島細(xì)胞能在人血清中存活并增殖，臨床實(shí)驗(yàn)已證明豬胰島可有效、安全的治療人類I型糖尿病。豬胰島組織來源廣泛，是人類i型糖尿病和部分n型糖尿病胰島細(xì)胞移植的主要供體來源。胰島移植成功的關(guān)鍵在于患者是否得到了相當(dāng)數(shù)量的具有活性和功能的豬胰島細(xì)胞。移植前體外培養(yǎng)是保存豬胰島移植物的主要方法，該方法即可以降低豬胰島的免疫原性，又能起到純化胰島、延長移植物保存時間的作用。雖然體外培養(yǎng)技術(shù)不斷發(fā)展，但由于目前體外培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境仍然存在較大差異，因此豬胰島細(xì)胞在體外很難存活、不易在體外培養(yǎng)，大大影響了胰島移植的成功率。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決目前豬胰島體外培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境存在差異，導(dǎo)致豬胰島細(xì)胞在體外很難存活、不易在體外培養(yǎng)的問題，而提供的一種聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物的制備方法。聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物按以下步驟制備一、處理聚羥基乙酸支架，將聚羥基乙酸支架用濃度為10mg/mL的多聚賴氨酸溶液包埋30min，然后放入超凈臺內(nèi)吹干，再浸泡入體積濃度為75%的乙醇溶液中30min，之后用PBS緩沖液沖洗34次，再放入超凈臺內(nèi)吹干，并用紫外燈照射lh;二、三維微重力細(xì)胞培養(yǎng)，將聚羥基乙酸支架放入三維微重力組織細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的組織培養(yǎng)容器中，加入lmL培養(yǎng)基，然后將豬胰島細(xì)胞均勻地放在聚羥基乙酸支架上，再加入RPMI-1640培養(yǎng)液，之后將組織培養(yǎng)容器中的氣泡排空、蓋緊組織培養(yǎng)容器蓋，放入體積分?jǐn)?shù)為95%空氣、5%C02、37。C的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行微重力培養(yǎng)，即得到聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物；其中步驟二中三維微重力組織細(xì)跑培養(yǎng)系統(tǒng)的旋轉(zhuǎn)速度在勻加速的情況下，在24小時中由15r/min增至45r/min，并保持45r/min的轉(zhuǎn)速繼續(xù)培養(yǎng)35天；步驟二中加入的培養(yǎng)基按以下步驟制備先將10.4g的RPMI-1640培養(yǎng)基干粉溶于1L超純水中，再加入濃度為1Ommol/L的Hepes23g，并用NaHC03溶液調(diào)pH值到7.4，濾過除菌后加入超純水體積10%20%胎牛血清，再加入青霉素和鏈霉素使培養(yǎng)基中青霉素終濃度為100U/mL、鏈霉素終濃度為10(^g/mL。聚羥基乙酸(Polyglycolicacid,PGA)是結(jié)構(gòu)最簡單的線性脂肪族聚酯，具有可生物降解性和生物相容性，是一種可體內(nèi)吸收的高分子材料。由于羥基乙酸是機(jī)體代謝的中間產(chǎn)物，在體內(nèi)水解后最終形成二氧化碳和水，而不會在人體組織和器官內(nèi)聚集(特別是不會在重要的人體組織和器官內(nèi)聚集)。多孔的PGA細(xì)胞生物支架有助于豬胰島細(xì)胞黏附生長，從而為豬胰島細(xì)胞體外生存提供支持和附著的空間。本發(fā)明制備的聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物提高了豬胰島細(xì)胞體外培養(yǎng)的質(zhì)量及體外存活的時間，并可改善豬胰島細(xì)胞的活性和分泌胰島素的功能，增加了具有活性和功能的豬胰島細(xì)胞的數(shù)量，從而達(dá)到了提高胰島移植成功率的目的，并為以后的糖尿病治療奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。圖1是具體實(shí)施方式四中聚羥基乙酸支架的IOO倍掃描電鏡圖，圖2是具體實(shí)施方式四中聚羥基乙酸支架的200倍掃描電鏡圖，圖3是具體實(shí)施方式四中聚羥基乙酸支架的300倍掃描電鏡圖，圖4是具體實(shí)施方式四中聚羥基乙酸支架的500倍掃描電鏡圖，圖5是具體實(shí)施方式八制備的聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物的倒置顯微鏡觀察圖，圖6是具體實(shí)施方式八中將聚羥基乙酸支架上的豬胰島細(xì)胞洗脫下來進(jìn)行AO-PI免疫熒光染色后的倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。具體實(shí)施方式一本實(shí)施方式聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物按以下步驟制備一、處理聚羥基乙酸支架，將聚羥基乙酸支架用濃度為10mg/mL的多聚賴氨酸溶液包埋30min，然后放入超凈臺內(nèi)吹干，再浸泡入體積濃度為75%的乙醇溶液中30min，之后用PBS緩沖液沖洗34次，再放入超凈臺內(nèi)吹干，并用紫外燈照射lh;二、三維微重力細(xì)胞培養(yǎng)，將聚羥基乙酸支架放入三維微重力組織細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的組織培養(yǎng)容器中，加入lmL培養(yǎng)基，然后將豬胰島細(xì)胞均勻地放在聚羥基乙酸支架上，再加入RPMI-1640培養(yǎng)液，之后將組織培養(yǎng)容器中的氣泡排空、蓋緊組織培養(yǎng)容器蓋，放入體積分?jǐn)?shù)為95%空氣、5%C02、37"C的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行微重力培養(yǎng)，即得到聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物；其中步驟二中三維微重力組織細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的旋轉(zhuǎn)速度在勻加速的情況下，在24小時中由15r/min增至45r/min，并保持45r/min的轉(zhuǎn)速繼續(xù)培養(yǎng)35天；步驟二中加入的培養(yǎng)基按以下步驟制備先將10.4g的RPMI-1640培養(yǎng)基干粉溶于1L超純水中，再加入濃度為10mmol/L的Hepes23g，并用NaHC03溶液調(diào)pH值到7.4，濾過除菌后加入超純水體積10%20%胎牛血清，再加入青霉素和鏈霉素使培養(yǎng)基中青霉素終濃度為100U/mL、鏈霉素終濃度為100jig/mL。本實(shí)施方式步驟二中使用的三維微重力組織細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)購自于上海易擴(kuò)儀器有限公司。本實(shí)施方式可選用產(chǎn)品名稱為"高密度、高活性、高分化"的三維微重力組織細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)即RCCSTM細(xì)胞生物反應(yīng)。本實(shí)施方式中使用的藥品、試劑和培養(yǎng)基等均容易購得，若無注明則濃度為產(chǎn)品標(biāo)注濃度。在計(jì)算本實(shí)施方式步驟二培養(yǎng)箱中各氣氛體積時空氣氛中所含有的co2忽略不計(jì)，即步驟二培養(yǎng)箱中C02的體積分?jǐn)?shù)(5%)中不包括空氣中原含有的C02。本實(shí)施方式步驟二微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過程中不得有空氣進(jìn)入三維微重力組織細(xì)胞培養(yǎng)容器內(nèi)，否則會由于機(jī)械性的剪切力而損傷細(xì)胞。容器內(nèi)的氣體交換是依靠容器內(nèi)的一個氣體通透膜進(jìn)行的。具體實(shí)施方式二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一的不同點(diǎn)是步驟一多聚賴氨酸溶液中多聚賴氨酸的相對分子質(zhì)量為1.5xl043xl04。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一的不同點(diǎn)是步驟一多聚賴氨酸溶液中多聚賴氨酸的相對分子質(zhì)量為2xl042.5xl04。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一的不同點(diǎn)是步驟一中聚羥基乙酸支架的纖維直徑為1317|mi，網(wǎng)孔直徑為100150pm，孔隙率為96%98%。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。本實(shí)施方式聚羥基乙酸支架的IOO倍掃描電鏡圖(SEM)如圖1所示，聚羥基乙酸支架的200倍掃描電鏡圖(SEM)如圖2所示，聚羥基乙酸支架的300倍掃描電鏡圖(SEM)如圖3所示，聚羥基乙酸支架的500倍掃描電鏡圖(SEM)如圖4所示。具體實(shí)施方式五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一的不同點(diǎn)是步驟一中聚羥基乙酸支架的厚度為12mm，長度為46mm，寬度為46mm。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一的不同點(diǎn)是用質(zhì)量濃度8.4%的NaHC03溶液調(diào)pH。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一的不同點(diǎn)是步驟二中所加入的培養(yǎng)基制備后放于4'C環(huán)境中儲存。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式八本實(shí)施方式聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物按以下步驟制備-一、處理聚羥基乙酸支架，將聚羥基乙酸支架用濃度為10mg/mL、相對分子質(zhì)量為1.5xl043xl04的多聚賴氨酸溶液包埋30min，然后放入超凈臺內(nèi)吹干，再浸泡入體積濃度為75%的乙醇溶液中30min，之后用PBS緩沖液沖洗34次，再放入超凈臺內(nèi)吹干，并用紫外燈照射lh，其中聚羥基乙酸支架的纖維直徑為1416|am，網(wǎng)孔直徑為110140pm，孔隙率為97%,厚度為1.21.8mm，長度為4.55.5mm，寬度為4.55.5mm;二、三維微重力細(xì)胞培養(yǎng)，將聚羥基乙酸支架放入三維微重力組織細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的組織培養(yǎng)容器中，加入lmL培養(yǎng)基，然后將豬胰島細(xì)胞均勻地放在聚羥基乙酸支架上，再加入RPMI-1640培養(yǎng)液，之后將組織培養(yǎng)容器中的氣泡排空、蓋緊組織培養(yǎng)容器蓋，放入體積分?jǐn)?shù)為95%空氣、5%C02、37"C的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行進(jìn)行微重力培養(yǎng)，即得到聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物；其中步驟二中三維微重力組織細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的旋轉(zhuǎn)速度在勻加速的情況下，在24小時中由15r/min增至45r/min，并保持45r/min的轉(zhuǎn)速繼續(xù)培養(yǎng)35天；步驟二中加入的培養(yǎng)基按以下步驟制備先將10.4g的RPMI-1640培養(yǎng)基干粉溶于1L超純水中，再加入濃度為1Ommol/L的Hepes23g，并用質(zhì)量濃度為8.4%的NaHC03溶液調(diào)pH值到7.4，濾過除菌后加入超純水體積20%胎牛血清，再加入青霉素和鏈霉素使培養(yǎng)基中青霉素終濃度為100U/mL、鏈霉素終濃度為100pg/mL?；铙w新生豬的胰腺切取后裝入有400mL低溫Hanks液的胰腺容器內(nèi)，胰腺容器外有兩層無菌塑料袋，塑料袋與胰腺容器之間用鹽水冰屑填充。豬胰腺的冷保存時間不宜超過50分鐘，豬胰腺取出胰腺容器后應(yīng)立即放入層流間進(jìn)行胰腺細(xì)胞的分離與純化。豬胰島細(xì)胞分離與純化①將豬胰腺置于超凈工作臺上，快速修剪胰腺周圍的組織、脂肪、血管及外科被膜，保留固有被膜；②沿著十二指腸找到主胰管，用5G套管針插入，用縫合線將套管針固定；③向套管針內(nèi)注入預(yù)冷的質(zhì)量濃度為0.25n/。的膠原酶V消化液1020mL，使胰腺全部膨脹，胰腺呈淡粉色；④將膨脹的胰腺放入玻璃容器內(nèi)，在38.5土0.5t:水浴中震蕩消化，震速為100120r/min;⑤在消化過程中間歇性加入濃度為O.lmmol/L的NaOH溶液，使消化液pH值維持在7.8左右；⑥從消化20分鐘后開始每間隔4分鐘取樣一次，用雙硫腙(DTZ)染色鏡檢，鏡檢見大部分結(jié)構(gòu)完整的胰島從外分泌組織中脫落出來，立即用4t:、含20%(體積)胎牛血清的Hanks液進(jìn)行終止消化；⑦充分混勻后用30目鋼網(wǎng)過濾，收集消化后胰島細(xì)胞；⑧速度沉降離心法進(jìn)行胰島純化，分別取樣鏡檢計(jì)數(shù)、估計(jì)純度、進(jìn)行生物學(xué)活性及組織學(xué)鑒定。本實(shí)施方式其它與實(shí)施方式一相同。將本實(shí)施方式PGA上的豬胰島細(xì)胞經(jīng)雙硫腙(DTZ)染色，在倒置顯微鏡(invertedmicroscope)下觀察(如圖5所示)可見大量圓形、橢圓形或不規(guī)則形紅色細(xì)胞團(tuán)，觸之易碎，包膜不明顯，也有散在單個染色細(xì)胞；外分泌組織不著色，二者容易區(qū)分。本實(shí)施方式純化后胰島直徑在5040(^m之間，在顯微鏡下計(jì)數(shù)直徑》50pm的胰島細(xì)胞，根據(jù)公式胰島純度=染色胰島數(shù)量/細(xì)胞團(tuán)總數(shù)(染色胰島及未染色胰島)xiooy。，計(jì)算出本實(shí)施方式胰島細(xì)胞純度>80%。共培養(yǎng)本實(shí)施方式制備的聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物，共培養(yǎng)條件如下將己經(jīng)處理及消毒過的PGA細(xì)胞支架放入微重力容器中，加入lmL培養(yǎng)基，然后將豬胰島細(xì)胞緩慢均勻地放在PGA支架上，再加入RPMI-1640培養(yǎng)液，將微重力容器中的氣泡排空，蓋緊容器蓋，與微重力儀器(RCCS)連接，然后放入體積分?jǐn)?shù)為95%空氣、5%C02、37。C的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，并將培養(yǎng)箱外面的操作旋扭打開，培養(yǎng)箱內(nèi)的容器開始旋轉(zhuǎn)，調(diào)整微重力儀器的旋轉(zhuǎn)速度，旋轉(zhuǎn)的速度由慢(15r/分鐘)到快(45r/分鐘)緩慢調(diào)節(jié)，最后速度達(dá)到45r/分鐘，在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)中不得有空氣進(jìn)入，否則會損傷細(xì)胞，經(jīng)過微重力培養(yǎng)PGA-豬胰島復(fù)合物形成。對聚羥基乙酸支架上的豬胰島細(xì)胞進(jìn)行吖啶橙-碘化丙錠(AO-PI)熒光雙染檢測胰島細(xì)胞的活性和生存率，吖啶橙(AO)可使活細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，碘化丙錠(PI)可是死細(xì)胞或正在死亡的細(xì)胞發(fā)出紅色熒光，在倒置熒光顯微鏡下可以觀察到，綠色熒光的活細(xì)胞和紅色熒光的死細(xì)胞，可以鑒定PGA上豬胰島細(xì)胞的活性及生存率。本實(shí)施方式將聚羥基乙酸支架上的豬胰島細(xì)胞洗脫下來進(jìn)行AO-PI免疫熒光染色并進(jìn)行倒置熒光顯微鏡(invertedfluorescencemicroscope)觀察，觀察結(jié)果如圖6所示。從圖6中可以看出綠色熒光的活細(xì)胞(淺色)多，紅色的死細(xì)胞較少，說明豬胰島細(xì)胞在PGA支架上能粘附生長，活性好。應(yīng)用公式胰島生存率=(綠色熒光胰島/紅綠色熒光胰島總數(shù))X100%，可計(jì)算出豬胰島生存率。本實(shí)施方式制備的聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物與無PGA支架豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)組相比，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如表l所示。與無PGA支架豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)組相比本實(shí)施方式豬胰島細(xì)胞生存率統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示;<0.05，本實(shí)施方式中豬胰島細(xì)胞生存率明顯高于無支架組。表l豬胰島細(xì)胞生存率比較(h幼)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*經(jīng)w/汰s，丄amk^檢驗(yàn)與靜止培養(yǎng)比較p<0.05。共培養(yǎng)本實(shí)施方式制備的聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物，應(yīng)用MTT(四唑鹽比色試驗(yàn))檢測本實(shí)施方式PGA支架上豬胰島細(xì)胞的成活性以判斷豬胰島細(xì)胞與PGA支架材料的生物相容性，與無PGA支架豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)組相比，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如表3所示。與無PGA支架豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)組相比本實(shí)施方式的MTT檢測結(jié)果顯示;0.05，說明本實(shí)施方式豬胰島細(xì)胞與PGA支架的生物相容性好。表3豬胰島MTT檢測結(jié)果比較(f土幼)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*經(jīng)w/汰s，丄amkfa檢驗(yàn)與靜止培養(yǎng)比較/<0.05。以上檢測結(jié)果證明，PGA-豬胰島復(fù)合物可明顯提高豬胰島培養(yǎng)的質(zhì)量并延長體外存活的時間，還可改善豬胰島的活性和分泌胰島素的功能，并可獲得一定數(shù)量的具有活性和功能的豬胰島細(xì)胞。說明本實(shí)施方式PGA-豬胰島復(fù)合物是一種理想的治療糖尿病的移植物。權(quán)利要求1、聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物的制備方法，其特征在于聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物按以下步驟制備一、處理聚羥基乙酸支架，將聚羥基乙酸支架用濃度為10mg/mL的多聚賴氨酸溶液包埋30min，然后放入超凈臺內(nèi)吹干，再浸泡入體積濃度為75％的乙醇溶液中30min，之后用PBS緩沖液沖洗3～4次，再放入超凈臺內(nèi)吹干，并用紫外燈照射1h；二、三維微重力細(xì)胞培養(yǎng)，將聚羥基乙酸支架放入三維微重力組織細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的組織培養(yǎng)容器中，加入1mL培養(yǎng)基，然后將豬胰島細(xì)胞均勻地放在聚羥基乙酸支架上，再加入RPMI-1640培養(yǎng)液，之后將組織培養(yǎng)容器中的氣泡排空、蓋緊組織培養(yǎng)容器蓋，放入體積分?jǐn)?shù)為95％空氣、5％CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行微重力培養(yǎng)，即得到聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物；其中步驟二中三維微重力組織細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的旋轉(zhuǎn)速度在勻加速的情況下，在24小時中由15r/min增至45r/min，并保持45r/min的轉(zhuǎn)速繼續(xù)培養(yǎng)3～5天；步驟二中加入的培養(yǎng)基按以下步驟制備先將10.4g的RPMI-1640培養(yǎng)基干粉溶于1L超純水中，再加入濃度為10mmol/L的Hepes2～3g，并用NaHCO3溶液調(diào)pH值到7.4，濾過除菌后加入超純水體積10％～20％胎牛血清，再加入青霉素和鏈霉素使培養(yǎng)基中青霉素終濃度為100U/mL、鏈霉素終濃度為100μg/mL。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物的制備方法，其特征在于步驟一多聚賴氨酸溶液中多聚賴氨酸的相對分子質(zhì)量為1.5xl043xl04。3、根據(jù)權(quán)利要求l或2所述的聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物的制備方法，其特征在于步驟一中聚羥基乙酸支架的纖維直徑為1317)im，網(wǎng)孔直徑為100150pm，孔隙率為96%98%，厚度為12mm，長度為46mm，寬度為46mm。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物的制備方法，其特征在于步驟二中用質(zhì)量濃度8.4%的NaHC03溶液調(diào)pH。5、根據(jù)權(quán)利要求l、2或4所述的聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物的制備方法，其特征在于步驟二中所加入的培養(yǎng)基制備后放于4"C環(huán)境中儲存。全文摘要聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物的制備方法，它涉及一種豬胰島移植復(fù)合物的制備方法。它解決了目前豬胰島體外培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境存在差異，導(dǎo)致豬胰島細(xì)胞在體外很難存活、不易在體外培養(yǎng)的問題。制備方法一、處理聚羥基乙酸支架，二、三維微重力細(xì)胞培養(yǎng)。本發(fā)明制備的聚羥基乙酸-豬胰島復(fù)合物提高了豬胰島細(xì)胞體外培養(yǎng)的質(zhì)量及體外存活的時間，并可改善豬胰島細(xì)胞的活性和分泌胰島素的功能，增加了具有活性和功能的豬胰島細(xì)胞的數(shù)量，從而達(dá)到了提高胰島移植成功率的目的，并為以后的糖尿病治療奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。文檔編號C12N5/06GK101434934SQ20081020980公開日2009年5月20日申請日期2008年12月26日優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日發(fā)明者姜再興,純宋,谷紅波,黃玉東申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)