專利名稱：用來(lái)處理分析物的設(shè)備及其使用方法
用來(lái)，分析物的設(shè)備 及其鵬方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用來(lái)處理分析物的設(shè)備和使用所述設(shè)備處理和/或檢測(cè)分析物 的方法。
分析物像生物M進(jìn)入實(shí)際設(shè)備的生物酶驅(qū)動(dòng)處理的運(yùn)輸，對(duì)于像在生物 傳感、即時(shí)診斷和健康保健方面的應(yīng)用成為一個(gè)^^越重要的問(wèn)題。具體的應(yīng)
用例子是便攜式DNA測(cè)序，^t個(gè)體化用藥、用于非常早期疾病檢測(cè)的單分子 級(jí)的醫(yī)學(xué)診斷和靈i^極高的生物危害化合物、藥物和環(huán)境敏感性化合物的檢 測(cè)是必要的。
在人工環(huán)境里存在著許多與分析物,處理和檢觀啲實(shí)5見(jiàn)有關(guān)的挑戰(zhàn)，例 如，像在微流回路中的無(wú)機(jī)表面上。
,處理最關(guān)鍵的問(wèn)題之一，像在人工結(jié)構(gòu)里面的DNA消化，是將^ 運(yùn)輸和使它停留在所希望的位置，在該位置酶促處理后緊接著將發(fā)生一個(gè)分析 步驟。另外一個(gè)重要問(wèn)題是用新鮮的好替代已分析的肝(反復(fù)鵬和檢測(cè))。 通常ttM過(guò)分析物預(yù)濃縮來(lái)提高檢測(cè)限。并且在多數(shù)生物應(yīng)用中，處理和檢 觀涉驟必須在液相狀態(tài)下進(jìn)行，使酶在表面壁上非特異性吸附和, 成為一個(gè) 突出的問(wèn)題。
幾種像在極微和微流結(jié)構(gòu)中特異性固定定位點(diǎn)和DNA肝共價(jià)或非共價(jià) 固定在那些所定義的定位點(diǎn)上的結(jié)合方法已經(jīng)被研究，(S.Matsuum等人, Nucleic Acid Research 29,16(2001)e79; S.Katsura等人1st Annual International 正EE"EMBS Special Topic Conference On Microtechnologies In Medicine & Biology (2000) Lyon, France)。然而，也發(fā)現(xiàn)在DNA ^iif壁上的非特異性吸附和DNA 在定位點(diǎn)或者太弱(非共價(jià))或者不可逆(共價(jià))的結(jié)合使這種方法不具吸引 力。
激光阱也能被用來(lái)在微流結(jié)構(gòu)里面定位和固定珠-DNA組fKK. Ddire等人, J Biotech. 86 (2001) 225-236;丄Stephan等人J Biotech. 86 (2001) 255-267; U. Keyser等人Nature Physics 2 (2006) 473477)。然而，這樣的步驟需要大量硬件，
不適合便攜式的解決辦法。
由Washizu等人發(fā)表的方法描述了使用交流電場(chǎng)將DNA ^ 捕獲和共價(jià) 粘附在鋁電豐肚。DNA獸,申展并被酶辦^S(T. Yamamoto等人正EETmas. on Industry Appl.， 36， 4 (2000) 1010-1017)。但是，這種方法的主要缺點(diǎn)是DNA沿 著電極結(jié)合在特定位置的可靠性和重復(fù)性。
美國(guó)專利US 2003/0064400 Al描述了J15iiM珠-DNA組件將DNA定位
在微^a道內(nèi)。這些珠的定位只^m過(guò)將珠捕獲在'i^i道和極小通道的交叉處 實(shí)現(xiàn)的。然而，鵬的結(jié)構(gòu)和尺寸很容易由于珠的聚集而導(dǎo)致堵塞。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于處理分析物的改進(jìn)的設(shè)備。本發(fā)明另 外一個(gè)目的是提供允許固定單分析物分子并且將其定位在它們的檢領(lǐng)IJ/分析點(diǎn)附 近的設(shè)備。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供允許預(yù)濃縮分析物來(lái)提高檢測(cè)限和檢測(cè) 器靈敏度的方法和設(shè)備。
本發(fā)明的目的Jiilil處理分析物的設(shè)備來(lái)實(shí)現(xiàn)的，該設(shè)備包括包括基底， 所述基底是單片材料并且包含 通道系統(tǒng)，所述通道系統(tǒng)具有
至少一個(gè)第一類型通道，所述第一鄉(xiāng)通道的尺寸是深度和寬度為l拜到
lmm，
至少一個(gè)第二，通道，所述第二lllMil道與所述第一，通道是流體相 連的，所述第二鄉(xiāng)通道的深度和寬度為lnm至iJ2000nm，所鄉(xiāng)一類型鵬流 入所述第二鄉(xiāng)通道，
分析物處理或釋放區(qū)域，所述區(qū),成在所，一類型通道流入所述第二 類型通道的位置，
以及與所述第二類型通道是流體相連的的檢測(cè)器，所述檢測(cè)器與所述分析物處 理或釋放區(qū)鄉(xiāng)目隔開(kāi)。
tti^i也，所述^^不是復(fù)合基底。
在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備進(jìn)一步包括肯灘結(jié)合分析物的載體 顆粒，以及肖辦在所述第一類型鵬內(nèi)運(yùn)輸所述載體顆粒的在所i^lit系統(tǒng)內(nèi) 的線ij,其中，tmtfe，所述載體顆粒尺寸是在0.1nm到lmm的范圍內(nèi)，雌 訓(xùn)nm至lj5fim。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一類型通道的尺寸是所述載體顆粒尺寸的至少5倍寬和深。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一鄉(xiāng)通道的尺寸是深度為10Mm到20Mm,寬 度為10拜到200拜，并E^述載體顆粒的尺寸是在小于或等于2miti的范圍內(nèi)。
雌地，所述分析物處理離放區(qū)域有錐形結(jié)構(gòu)，其中所鵬縣統(tǒng)的橫 截面從所述第一，通道到所述第二^通道以不,梯度^^地減小。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二鄉(xiāng)通道的尺寸范圍是深度和寬度為100nm 到800nm。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二類型通道的尺寸范圍是從大于到
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一類型通道另外還包括阻礙結(jié)構(gòu)，所述阻礙結(jié) 構(gòu)在所述第一類型通道中防止物質(zhì)例如溶劑和載體顆粒的未阻礙流動(dòng)，其中， 優(yōu)選地，所述阻礙結(jié)構(gòu)是被放進(jìn)所述第一類型通道中的正方形、三角形和圓形物質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體顆粒是球形、立方體形、平行化(paralkliped)
或不規(guī)則皿。
^ife，所述第一l^fflit的長(zhǎng)度范圍是從lmm到10cm，所述第二KIM 通道的長(zhǎng)度范圍是從lnm至ijlmm, tt^tfe勝100nm到IOO拜。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測(cè)器與所述分析物處理區(qū)域有一距離，所淑巨 離在lnm到1000Mm的范圍內(nèi)，■ 5nm至lj 1罔。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測(cè)器選自生物孔蛋白、Ait^米孔、納隙傳感 器、電化學(xué)傳緣光譜傳繊、質(zhì)譜傳感器、拉曼光譜傳麟和FTIR光譜傳繊。
在一個(gè)實(shí)駄案中，根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備進(jìn)一步包括引Mn/或維持凝訴卩所 述載體顆粒M所述通道系統(tǒng)流動(dòng)的設(shè)備，其中，,地，所述引A^P/或維持 流動(dòng)的設(shè)備在所述總訴卩/^^述載體顆粒上施加電力、磁力、電磁力或流胸力。
在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備進(jìn)一步包括在所述分析物處理， 放區(qū)域固定所述載體顆粒的裝置，其中，i^fe，所述固定體在所述翻訴o/ ^^f述載體顆粒上施力口電力、磁力、電磁力或流胸力。
在一個(gè)實(shí)駄案中，其中所述基底是由選自硅、1化硅、玻璃、聚合物
例如pdms、聚碳酸酯、pe、硅氧烷的材料制成的，并且所i^iii^統(tǒng)Jiii31 電子束記M、蝕刻術(shù)、模塑、聚焦離子束蝕刻術(shù)、激光燒蝕術(shù)、壓花制成 的，其中所述基底是由聚合物或聚合物組合制成的，并且所述基底是使用
模板(master)通過(guò)模塑或壓花所述聚合物形成單片材料，在所述模板里， 提供了所M道系統(tǒng)的負(fù)象。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體顆粒是由選自二氧化硅、三氧化二鋁，金屬 性的和/或有磁性的材料例如Au、 Ag、 Pd、 Pt、 Al、 Ti、 Fe、 Ni,陶瓷和聚糊 例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、三聚氰胺、聚交酯、 葡聚糖的材料制成的。
在一個(gè)實(shí) 案中，所述載體顆^腿一步包括分析物結(jié)合基團(tuán)，所述基團(tuán) 與所述分析物上的相應(yīng)載體顆粒結(jié)合基團(tuán)相互作用，其中，雌地，其中一對(duì) 分析物-結(jié)合基團(tuán)和相應(yīng)的載體顆粒結(jié)合基團(tuán)選自生物素/(鏈霉)抗生物素蛋白、 抗彬抗原、，醇變體、鎳/His6、凝集素/糖、谷胱甘肽/谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移 酶，NH2/COOH/環(huán)氧基共價(jià)鍵合、以髙親合力結(jié)合來(lái)自各種物種的不同 種類和子類免疫球蛋白的Fe片段的蛋白A、 G，氫鍵，或基于DNA堿基 雜交、適體(aptamer)結(jié)合例如蛋白質(zhì)-DNA/RNA相互作用、膠原/膠原 結(jié)合蛋白，Dig/抗洋地黃毒苷，或者基于激素結(jié)合，或者基于其它靜電、 離子和/或共價(jià)相互作用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所^I道系統(tǒng)在所^1道的表面被修飾，所述修 飾;M5i應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)以M^分析物在表面上的非特異性吸附而實(shí)現(xiàn)的，其中， tti^地，所述改變是i!31液相沉積或氣相沉積來(lái)實(shí)現(xiàn)的，i^氣相沉積，更優(yōu) 選硅烷的氣相沉積。
在一個(gè)實(shí) 案中，其中所^Mit的所述表面選自聚，例如PDMS和二 氧化硅，其中，優(yōu)選地，所述《射布題過(guò)將所述表面暴露于具有化學(xué)端基例如 甲基、氨基、氟或硫醇基的^化合物或?qū)⑹杷鶊F(tuán)暴露于所述通道表面 的其它種類分子來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備進(jìn)一步包括在所述分析物處理或釋 放區(qū)i^人所述載體顆f嫌^^f述分析物的體，其中，雌地，釋^;;f述分析 物的裝置基于所述分析物從所述載體顆粒的光誘導(dǎo)釋放、電場(chǎng)誘導(dǎo)釋放、溫 度誘導(dǎo)釋放、化學(xué)反應(yīng)或生化反應(yīng)例如與輔因子的生化反應(yīng)、酶介導(dǎo)誘導(dǎo)的
1
釋放，來(lái)實(shí)施這樣的釋放。
在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備進(jìn)一步包皿過(guò)化學(xué)反應(yīng)例如裂解
成更小的片段或結(jié)構(gòu)單元，而進(jìn)一步^hS所述分析物的裝置，其中，優(yōu)選地， 所述M:化學(xué)反應(yīng)進(jìn)一步處理所述分析物的^a是載體珠，在所述載體珠上固 定有化學(xué)劑，,酶。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分析物選自核酸例如單鏈、雙鏈DNA、 RNA、 蛋白質(zhì)、多肽、藥物以及在環(huán)境條件下是氣態(tài)或液態(tài)的其他肝、生物學(xué)或環(huán) 境上有害的分子。
本發(fā)明的目的也^131 1和/或檢測(cè)分析物的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的，所述方^ 括以下步驟-
一將分析物結(jié)合在如上定義的載體顆粒上，
—通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的所i&ilil系統(tǒng)，將所述載體顆粒和結(jié)合到其上 的分析物運(yùn)輸?shù)剿鲈O(shè)備的所述分析物,，放區(qū)^，
一將所述載體顆粒和結(jié)合到其上的分析物固定在所述分析物處理，放區(qū)
域上'
—通鵬用光、電場(chǎng)、磁場(chǎng)、電磁場(chǎng)、熱或冷，艦過(guò)實(shí)施化學(xué)或生4機(jī) 解反應(yīng)例如j頓酶，如核酸酶、蛋白酶例如ExoI、 Exoffl、 Sfol、 Xbal和其它
限制酶的化學(xué)或生《機(jī)解反應(yīng)，^^f述載體顆ai:釋方處;f述分析物，
和/^ ^行化學(xué)或生^ 反應(yīng)例如4頓酶，如核酸酶、蛋白鵬咖Exo I、 Exom、 Sfol、 Xbal和其它限制酶的化學(xué)或生1^^反應(yīng)，來(lái)4zbS^f述分析 物，
一將所述釋放的分析物^^述處理過(guò)的分析物^述釋放且處理過(guò)的分析 物運(yùn)輸?shù)剿鰴z測(cè)器上，
—使用如上定義的檢測(cè)，測(cè)所述釋放的分析物或所述處理過(guò)的分析物或 所述釋放且處理過(guò)的分析物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括^^ 述分析物已經(jīng)被釋 放和/或處理后/A^f述分析物M辦放區(qū)域去除所述載體顆粒的步驟。
雌地，所述運(yùn)輸步驟和所述去除步驟是利用所述裝置來(lái)實(shí)施的，以便引 A^/或維持如上所定義的鋭訴卩載體顆粒的流動(dòng)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述固定步驟是313i^述分析物處理或釋放區(qū)域的尺
寸或通過(guò)如上定義的所述固定所述載體顆粒的^置，或者通過(guò)二者的組合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
1Mi也，l柳所述檢測(cè)器的檢測(cè)步驟題過(guò)光學(xué)檢測(cè)、化學(xué)檢測(cè)、電檢測(cè)、 磁檢測(cè)、電化學(xué)檢測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分析物是核酸，所述處理分析物的步驟是所述核 酸的,降解，所述檢測(cè)所述處理過(guò)的分析物的步驟包括單核苷酸或核苷酸堿 基的檢測(cè)，以說(shuō)明所述核酸的序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 ^過(guò)將載體珠加入到所3^1道系統(tǒng)中 來(lái)實(shí)現(xiàn)的，在所Mii上，固定有用于,隨的載體珠酶。
本發(fā)明的目的也可以通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的生產(chǎn)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，包括以下 步驟
—提供具有有如上所定義的所m道系統(tǒng)的負(fù)象的模板 一使用所述模板和聚合物材料或適合形成聚合物的材料來(lái)模塑或壓花所 述基底，從而獲得所述的作為單片材料的基底，所述基底包含所述通道系統(tǒng)。
優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步包括以下步驟-一用平板例如玻璃板覆蓋所述通道系統(tǒng)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述模板的所述通道系統(tǒng)的負(fù)象是通過(guò)選自電 子束記錄術(shù)、蝕刻術(shù)、離子束蝕刻術(shù)、激光燒蝕術(shù)、光刻技術(shù)和這些技術(shù) 的組合的方法形成的。
這里被用與基底有關(guān)的術(shù)語(yǔ)'單片材料'意思是一種特定情況，其中該 基底是被制成作為一個(gè)單片材料。例如美國(guó)專利US2003/0064400描述 了一種里面有不同尺寸通道的系統(tǒng)的設(shè)備的制造，其中，每一類型的通 道被限定成不同的基底，并且這些基底被按序組合例如膠合在一起。這 樣組裝的基底此處也稱為'復(fù)合基底'，并且根據(jù)本發(fā)明的基底不是這樣的 '復(fù)合基底'。更確切地，在這里使用的術(shù)語(yǔ)'單片'，意思是一個(gè)特定情況， 其中，有一個(gè)由一片材料制成的單一基底，該一片材料不包括不同部分 或組分組裝在一起，例如通過(guò)膠合或其它機(jī)械連接。更確切地，在根據(jù) 本發(fā)明的基底中，有一個(gè)單片材料，該材料里面存在通道系統(tǒng)。這里有 時(shí)也指通道系統(tǒng)'被嵌在所述基底里'。與根據(jù)本發(fā)明的'單一基底'或'整體
基底'或'非復(fù)合基底'相反，在美國(guó)專利US2003/0064400中有超過(guò)一個(gè)的 基底或者'復(fù)合基底'。在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的基 底是由單片材料或單片材料形成的，該材料在優(yōu)選實(shí)施方案中是由一種 聚合物或幾種聚合物的結(jié)合制成的，并且是通過(guò)使用一個(gè)適當(dāng)?shù)哪０鍓?花這樣的聚合物形成的，其中，通道系統(tǒng)的負(fù)象事先已經(jīng)形成。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，這樣的適當(dāng)模板也用來(lái)壓花例如熱壓花成聚合物材料。 本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道怎么形成一個(gè)適當(dāng)?shù)哪０?，例如由一個(gè)硅片或 二氧化硅片幵始，使用適當(dāng)?shù)某练e和去除步驟順序，例如，電子束記錄術(shù)、 蝕刻術(shù)、聚焦離子束蝕刻術(shù)、激光燒蝕術(shù)和其它照相平版印刷技術(shù)，以產(chǎn) 生所述通道系統(tǒng)。怎么形成適當(dāng)模板的例子以后會(huì)在本申請(qǐng)中給出。
在這里使用的術(shù)語(yǔ)'通道系統(tǒng)'意思是指是流體相連的的通道網(wǎng)絡(luò)。術(shù) 語(yǔ)'是流體相連的'的意思是兩個(gè)通道之間的空間關(guān)系，該關(guān)系要求物質(zhì)例 如液體，可以從一個(gè)通道運(yùn)輸或流動(dòng)到另一個(gè)通道。
'第一類型通道'意思是指一種特定類型的通道，該通道的特征是其深 度和寬度的尺寸范圍是從lMm到lmm。這樣的通道的長(zhǎng)度可以變化。這
種'第一類型通道'在這里指的是'微通道'。
'第二類型通道，意思是指另外一種類型的通道，該通道的特征是有更 小的尺寸，即其深度和寬度的尺寸范圍是從lnm到2000nm。再者，這樣
是通道的長(zhǎng)度也可以變化。這種'第二類型通道'在這里有時(shí)指的是'納米 通道，。'第一類型'和'第二類型'通道相互可是流體相連的。
在這里使用的術(shù)語(yǔ)'所述第二類型通道被嵌在所述第一類型通道里'， 意思是指一個(gè)空間布局，這里第二類型通道完全被所述第一通道包住。
在這里使用的'分析物處理或釋放區(qū)域'意思是指在該區(qū)域里，第一類 型通道形成以流體連接到第二類型通道，以致通過(guò)該通道系統(tǒng)的流動(dòng)路 徑的截面區(qū)域從第一類型通道尺寸減少到第二類型通道尺寸。這個(gè)"分析 物處理或釋放區(qū)域"在這里有時(shí)也指',納(micro-tonano)的轉(zhuǎn)變或收縮'。
在這個(gè)分析物處理或釋放區(qū)域里，通常將其上結(jié)合有分析物的載體顆粒 固定，以使該分析物可以被釋放和/或進(jìn)一步處理。通常，這樣的進(jìn)一步 處理在分析物仍然結(jié)合在載體顆粒上或分析物在所述第二類型通道(納 米通道)中時(shí)就會(huì)發(fā)生。優(yōu)選地，這個(gè)分析物處理或釋放區(qū)域具有'錐形
結(jié)構(gòu)'，并且流動(dòng)路徑的截面區(qū)域的減少或者以間斷的梯級(jí)或者以連續(xù)的 形式實(shí)現(xiàn)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，第一類型通道深度和寬度至少是所述載
體顆粒的尺寸的5倍。這已經(jīng)被證明在避免載體顆粒的堵塞和聚集時(shí)取 得了特別好的結(jié)果。同樣，第二類型通道的尺寸與載體顆粒的尺寸一樣 或比載體顆粒的尺寸小，以致防止載體顆粒進(jìn)入第二類型通道。然而， 被結(jié)合在載體顆粒上的分析物可以進(jìn)入所述第二類型通道，并且，可以 繼續(xù)發(fā)生下一步驟例如化學(xué)處理。
這里關(guān)于通道系統(tǒng)使用的術(shù)語(yǔ)'錐形結(jié)構(gòu)'意思是指一個(gè)特定情況，其 中通道寬度/直徑/截面從第一類型通道減少到第二類型通道。這樣的減少 可以是逐漸的或可以是以梯級(jí)的形式。這樣的錐形結(jié)構(gòu)可以使用上述的 蝕刻和沉積技術(shù)以及其他光刻技術(shù)，通過(guò)在模板上產(chǎn)生適當(dāng)?shù)倪@樣錐形 的負(fù)象來(lái)獲得。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)講，也很清楚在所述第一類型通道范圍內(nèi)的流動(dòng)模式
會(huì)由于引入'阻礙結(jié)構(gòu)'穀膨響，例如斷^^的(部分)壁、正方形、長(zhǎng)方 形、圓形的物質(zhì)被鵬所述第一鄉(xiāng)鵬的流動(dòng)路徑。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，通道系統(tǒng)的表面，，第一，Mit^二類型通道 或兩者的表面，可以M將通道表面暴露于氣相，化合物而改變。發(fā)明者已
經(jīng)發(fā)現(xiàn)這會(huì)減少表面上分析物的非特異性吸附。3!51^樣的改變，通道的表面 可以，適度的疏水，與水的接觸角大約為60°。優(yōu)選的氣相沉積，例如在氣相 中硅烷化，能確保第二類型通道(納糊道)表面也被改變。在特別雌的實(shí) 施方案中，硅烷化合物具有甲基基團(tuán)，該基團(tuán)大大減少了在表面上分析物例如 核酸的非特異性吸附，同時(shí)避免了雙鏈核酸的固定(不希望的)。
也可能改變通道的表面的液相沉積，是不雌的，因?yàn)榻?jīng)常在納米級(jí)的范 圍內(nèi)它不接3ffil道系統(tǒng)的特性，并且通常它依靠有機(jī)翻IJ的存在(形 相)， 有機(jī)溶劑與大多數(shù)根據(jù)本發(fā)明將要被用于基底的聚合物例如聚二甲基硅氧烷 (PDMS)不相容。
使用根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備可以預(yù)濃縮分析物，以便接下，過(guò)根據(jù)本發(fā)明的 檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)。因此，可以提高檢測(cè)器的靈鵬，并且提高檢測(cè)器的檢測(cè)限。
所述分析物的檢測(cè)ffl31許多裝置，行，最明顯的是生物孔蛋白、Ai^納 米孔、納隙傳感器，電化學(xué)傳感器。
這些傳感器的讀出,用電的。就生物孔蛋白或A3t納米子L^講，將一個(gè) 電壓橫加于孔上(如附圖5a所示)。所施加的電勢(shì)驅(qū)動(dòng)離子電Mil該孔，并 且像DNA^Sff變酶之類的物體ilii該孔，離子電流^>片刻(例如Akeson 等人，Me決o必jbr c/wracteriz/"g cft/p/ex "wc/e/c ac/dwo/ea//es,專禾!j U S 6936433 B 2 ， 2005; experimentally shown for DNA bases by Y Astier, O. Braha^ and H. Bayley, 7bwm/M /ecw/e 納we"c/"g: Z)/w"她"峭ca"ow <
5""g/"e^i2af尸rate/" A^fwo/ oAi 五(7w&pec/vw說(shuō)a A/o/ecw/ary4db/7fe/;丄Am. Chem. Soc., 128(5), pp, 1705-1710,(2006))。
就納隙傳繊來(lái)講，分子艦一個(gè)1 3nm寬的電極縫隙。已經(jīng)出版的觀 點(diǎn)預(yù)測(cè)流過(guò)1 3nm的隧道電流能被正在轉(zhuǎn)變分子的獨(dú)特介電性質(zhì)所調(diào)整 (theoretically predicted by J. Lagerqvist M. Zwolak^ M. Di Ventre "Fast DNA Sequencing via Transverse Electronic Transport", Nano Lett. 6 (4) (2006) 779-782; M. Zwol成M. Di Ventre "Electronic Signature of DNA Nucleotides via Transverse Transport", Nano Lett. 5 (3) (2005) 421>424)。
可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)^^^道系統(tǒng)內(nèi)運(yùn),體顆粒的溶劑可以是水、水溶液、 有機(jī)鋭,如乙醇、丙醇及其混，、有機(jī)翻IJ與水的混合物等等。
根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備進(jìn)一 步包括"弓I入或維持溶劑流il31所述通道系統(tǒng)的裝 置"，禾口"將所述載體顆粒固定在所述分析物處理，放區(qū)域的體"。這些^S 通常都禾擁電或磁場(chǎng)或電磁場(chǎng)或者僅運(yùn)用流體動(dòng)力。最簡(jiǎn)單地來(lái)講，這樣的裝 置可以是泵或者注射器，通31it用它們^^就會(huì)^E通3i31道。可選擇地，這 樣的裝置可以是磁鐵或者一組放在適當(dāng)位置的電極，該位置可以是所m道系 統(tǒng)或所述分析物處理或釋放區(qū)域內(nèi)部或周圍。
這里j頓的術(shù)語(yǔ)'施加電、磁或電磁力'意思是指應(yīng)用電、磁或電磁場(chǎng)。流 體動(dòng)力也可以通過(guò)應(yīng)用壓力差來(lái)施加。
分析物在載體顆粒上的附著，過(guò)在所述載體顆粒上的分析物結(jié)合基團(tuán)和 所述分析物上相應(yīng)的載體顆粒結(jié)合基團(tuán)之間獲得的鏈接來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
單位載體顆粒上分析物的數(shù)量可以在O到x之間變化，這里，在優(yōu)選實(shí)施 方案中，x大于或等于l ，并且x受分析物的濃度和載體表面上的特定分析物的 最大可能聚集密度所影響。分析物的數(shù)量可以皿存在的分析物濃度自動(dòng)地調(diào)
整。對(duì)核酸測(cè)序例如DNA測(cè)序來(lái)講，雌^m體上一個(gè)分析物，這可以在核
酸-載體組合步驟中M;小心調(diào)整核酸濃度而實(shí)現(xiàn)。然而，在其它實(shí)施方案中，x
可以大于l，例如氣相檢測(cè)應(yīng)用。
分析物從所述載體顆粒的釋放可以Sil光誘導(dǎo)、Mil^用電場(chǎng)的誘導(dǎo)、溫 度誘導(dǎo)或通過(guò)化學(xué)反應(yīng)的誘導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)。同樣，進(jìn)一步的處理可以M3i化學(xué)g 來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，分析物通過(guò)加AiS當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)劑或酶,可以,成更小的碎片。 更具體地，就酶隨來(lái)講，這樣的,可以MM加入適當(dāng)?shù)妮o因子被引發(fā)，沒(méi) 有輔因子酶還不肖跑作用。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，m^置可以被使用，例如用于諸如DNA之類 的核酸的測(cè)序目的，因此單核苷敏核苷酸 肯灘以在分析繊酸范圍內(nèi)出現(xiàn) 的順序被檢測(cè)。
在這個(gè)測(cè)序設(shè)備的一個(gè)實(shí) 案中，珠-核酸組件，即被固定在珠上的核酸,
在從微至納轉(zhuǎn)變中被捕獲，并且固定僅僅il3i^個(gè)轉(zhuǎn)變的尺寸禾n/^i3l應(yīng)用電 或磁或電磁場(chǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)?？梢允褂秒姌O施加電場(chǎng)。核酸的酶IW通過(guò)加入適當(dāng)?shù)?核酸外切酶的輔因子而開(kāi)始，該核酸外切酶也加到反應(yīng)混合物中。釋放的 基團(tuán)使用分子檢測(cè)器在納米通道末端檢測(cè)。在一個(gè)替換型實(shí)施方案中， 核酸外切酶可以與單獨(dú)的珠相連，該珠可能是用流體動(dòng)力(微至納轉(zhuǎn)變)、 電、磁或電磁場(chǎng)在第二類型通道內(nèi)被捕獲。核酸進(jìn)一步與珠鍵合，并且 也用流體動(dòng)力、電、磁或電磁場(chǎng)被捕獲。攜帶酶的珠和攜帶核酸的珠可 以有不同的尺寸。這個(gè)替換型實(shí)施方案的優(yōu)點(diǎn)是酶和檢測(cè)器之間的距離 保持常數(shù)，因?yàn)橹楸还潭ㄔ诹髀穬?nèi)某一位置。核酸載體珠和酶之間的距 離需要通過(guò)外部的場(chǎng)例如磁、電或電磁場(chǎng)或通過(guò)流動(dòng)來(lái)控制。這個(gè)替換
型實(shí)施如圖5c所示。 下面參考附圖，其中
附

圖1示出了用載體在臨近^檢測(cè)，獲、運(yùn)輸和釋放分析物的方法的
示意附圖2示出了用載條臨近分子檢測(cè)娜獲、運(yùn)輸和釋放分析物的方法的 示意圖。在這里，分析物在檢測(cè)前被處衝
附圖3示出了肖灘捕獲單個(gè)載體的錐形的微至納轉(zhuǎn)變； 附圖4示出了替換載體的示意附圖5a和圖5b示出了通過(guò)利用沐DNA裝配體用于測(cè)序DNA的設(shè)備総， 該組合被捕獲在鵬納的收縮部位里(有或沒(méi)有電場(chǎng)電極。DNA的酶,M: 加入輔因子幵始并且釋放基團(tuán)M31^ffl^f檢測(cè)皿測(cè)。圖5c示出了將酶固定 在載體珠表面的可選辦法；
附圖6示出了在玻i^面上溶液中DNA-珠裝配體的熒光圖像； 附圖7a示出了模板制作的工藝步驟，圖7b顯示了所制成的模板結(jié)構(gòu)在硅 片上的掃描電鏡(SEM)圖像，該硅片接著被用于聚二甲基硅氧烷模塑以實(shí) 現(xiàn)微至納轉(zhuǎn)變；
附圖8顯示了 16Mm似-DNA在微^it表面上的非特異性吸附減少的熒 光圖像，該通道表面通過(guò)氣相硅烷化用甲基三乙氧基硅垸覆蓋，(a)沒(méi)有硅 烷化，(b)硅烷化；
附圖9顯示了微至納轉(zhuǎn)變和DNA-,配體被捕獲在500nm寬的Sif里。 該DNA ^TM31流,力伸皿A^米流體Sit;
附圖10顯示了一個(gè)DNA-麟配體加入到己經(jīng)被捕獲的聚集體中的熒光圖
像；
附圖lla和附圖lib顯示了用直流電場(chǎng)操縱所捕獲的DNA的熒光圖像。附 圖1 lc顯示了J151相反的流體動(dòng)力流動(dòng)進(jìn)行的操縱。A顯示了一個(gè)長(zhǎng)IO脾的 標(biāo)尺；
附圖12顯示了在750nm寬的納^Jlil里，在H)s (上面的壁面)，tl-5min (中間的壁面)，t2-10min (較低的壁面)時(shí)，捕獲的DNA用核酸外切酶降 解的熒光圖像；
附圖13顯示了降解的DNA片斷在納米通道出口處聚集的熒光圖像 (對(duì)照白圓圈，壁面1 4顯示了不同的時(shí)間點(diǎn))；
附圖14a-c顯示了在納米通道里酶降解的結(jié)果，通道的寬度分別是 500nm、 750nm、 1薩、1.5jjm和2jjm，時(shí)間分別是t-Oh、 t=2h、 t=16h (壁
面從頂部到底部)；
附圖15a和附圖15b顯示了更多數(shù)量的珠-DNA組合體的捕獲熒光圖 像，導(dǎo)致了在納米通道內(nèi)部較高的DNA濃度
附圖16a和附圖16b顯示了在納米通道內(nèi)通過(guò)使用SFOI酶將靠近珠 上固定點(diǎn)的DNA切斷的單個(gè)DNA鏈釋放的熒光圖像；
附圖17顯示了沿著納米通道收縮部分的實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明通過(guò)參考下面的例子進(jìn)一步進(jìn)行描述，這些是試圖說(shuō)明而不 是限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
DNA測(cè)序
這個(gè)例子描述了如何在微流結(jié)構(gòu)中^^棘乙烯珠捕獲DNA舒，如何 將珠-DNA組合體運(yùn)輸?shù)絕ba點(diǎn)，如何在所希望的位置捕獲它們，以及最后如何 ^^酶處理該DNA。酶)l,地釋放m，該,被TO^子檢測(cè)器并且被按序 分析。
附圖5a/b描述了一個(gè)設(shè)備概念的實(shí)例。在捕獲了被生物素酶改性的核酸鏈， 例如通過(guò)使用涂上一層鏈霉素的聚苯乙烯珠的DNA鏈以后，該裝配體被驅(qū)動(dòng) ( 流體動(dòng)力流動(dòng)或電 場(chǎng))i4A微流至納流的轉(zhuǎn)變結(jié)構(gòu)(*斜己1)。在這 個(gè)步驟里，酶(由黑點(diǎn)表示)被加入到該裝配體中，而酶的輔因子還不絲(標(biāo) 記2)。該裝配體接著被捕獲，或者i!51外部和優(yōu)選的不均勻電自場(chǎng)捕獲，或 者在象鵬納錐形轉(zhuǎn)變的結(jié)構(gòu)阻礙里捕獲(標(biāo)記3)。核酸，例如DNA,艦 ^ffl流體動(dòng)力流動(dòng)或者使用電場(chǎng)朝著檢測(cè)點(diǎn)伸展(標(biāo)記4)。 一種可能的延伸是 把其它物體(像珠、大M、蛋白質(zhì))附在核酸例如DNA的末端或支干上以進(jìn) 一步支撐伸展過(guò)程。這些物體可以被磁或電場(chǎng)接近。
艦加入輔因子(例如Mg2"，單鵬的,和釋放幵始了 (l祝5 )。帶 負(fù)電荷的單堿基或者通過(guò)流體動(dòng)力流動(dòng)或者通過(guò)電場(chǎng)被朝著分子檢測(cè)器驅(qū)動(dòng) (標(biāo)記6)。分子檢測(cè)器可以競(jìng)近發(fā)表的單OT檢測(cè)器，尤其像蛋白質(zhì)基納米 孔(US6936433B2)、孑L-蛋白與肝適配器的結(jié)合(YAstier等人J.Am.Chem. Soc., 128,5 (2006) 1705-1710)、 Ai^l米孔(C. Dekker， NatureN加otechnology 2 (2007) 209-215 )和納隙基傳麟(J. Lagerqvist等人Nano Lett., 6,4 (2006) 779-782; M. Zwolak and M. Di Ventra^ Nano Lett., 5， 3 (2005) 421424)。每一個(gè)鵬的信號(hào) 接著齢被紀(jì)錄并EJ頓序齢被排列。
在另一個(gè)實(shí)施例中，核酸-麟配體，例如DNA-麟配術(shù)皮捕獲在錐形的微 至納收縮部，沒(méi)有酶附著在DNA上。接著在核酸例如DNA伸^itA納^l道 后，通過(guò)加入酶和輔因子Mg2+,降解步驟開(kāi)始了。
附圖5c顯示了一個(gè)實(shí)例，其中，用于處理的酶被固定在載體顆粒表面上。
核酸,酶，例如DNA ,酶，會(huì)灘ilil生物素與抗生物素蛋白連接、 織，結(jié)合、適體結(jié)合、通娜、馬來(lái)艦胺、還原的半胱氨酸、戊二醛或 硫醇的直接偶聯(lián)被結(jié)合到載體珠上，優(yōu)選在載體和酶之間用隔離分子來(lái)減 少載體表面上的酶降解。攜帶載體的酶通過(guò)電場(chǎng)或磁場(chǎng)被捕獲在第二收 縮部(標(biāo)記0)。優(yōu)選地，酶載體珠比DNA載體珠略小。通過(guò)與上述提 到的相同過(guò)程，DNA被插入納米通道里(標(biāo)記3),并且DNA直接朝向 固定酶的位置。當(dāng)DNA的末端接近酶時(shí)，如果在溶液中存在輔因子(標(biāo) 記5)，并且DNA片段可以到達(dá)分子檢測(cè)器(標(biāo)記6),那么降解就開(kāi)始 了 (標(biāo)記4)。
如附圖5b所示，當(dāng)降解發(fā)生時(shí)，通過(guò)使用輔助電極，可能將DNA 載體珠成功地安置在離酶較近的地方。也能夠想象一旦DNA附著到其中 一個(gè)酶上，DNA載體就將從酶載體上彈回，留下還未處理的DNA片段 松弛成一個(gè)環(huán)狀。
當(dāng)降解幵始時(shí)，DNA也可能完全從載體珠上釋放(例如酶促的， 通過(guò)光、熱等)。
下面描述附圖5a顯示的概念的實(shí)現(xiàn)。 附圖6顯示了玻璃表面上溶液中的DNA-珠裝配體。 生物素化寡核苷酸與在噬菌體 i-DNA的右(一個(gè))末端(48，502個(gè)堿 基對(duì)(bp);Sigma)的12-核苷酸懸臂(overhang)雜交?；パa(bǔ)和重疊的寡核苷 酸(5，-GGG-CGG-CGA-CCT-3，)在5'磷酸化并且在3'進(jìn)行生物素標(biāo)記(從 Eurogentec購(gòu)買)。入-DNA與寡核苷酸以摩爾比1:1000混合，并且在50'C 下雜交1小時(shí)，接著在16'C下在連接酶緩沖溶液(Invitrogen)中與DNA 連接酶(Invitrogen)連接過(guò)夜。沒(méi)有雜交的過(guò)量低聚物通過(guò)過(guò)濾除去。 提純的生物素改性的DNA在(C下于137mMPBS緩沖液(PH7.4)中貯存。 生物素VDNA被固定在涂有鏈霉抗生物素蛋白的聚苯乙烯(PS)珠 (Polyscience，Inc)上，直徑為1.8)om。聚苯乙烯顆粒與DNA鏈的比率是 1:1000。該混和物在室溫下在低體積1M PBS緩沖液中搖動(dòng)72小時(shí)。該 DNA裝配體在4'C下貯存在1MPBS緩沖液中。在微流體設(shè)備中使用DNA 裝配體以前，該DNA按1:50比例稀釋，并且用YOYO-l(Molecular Probes) 在室溫下以1:2染料/bp比率(或?yàn)?:10，如果在第一試驗(yàn)時(shí)沒(méi)有稀釋)
的條件下染色1小時(shí)。
附圖7a示出了模板結(jié)構(gòu)(用于接下來(lái)單層基底的制作)的制作步驟，圖 7b顯示了一個(gè)在硅片上制成的模板結(jié)構(gòu)的例子，該硅片用于PDMS模塑以制 成根據(jù)本發(fā)明具有MiI和納米通道的基底。
(IOO)帶有1000nm熱生長(zhǎng)氧化物的硅片在2000rpm用PMMA_MA 抗蝕刻劑(resist)覆蓋。用50kV的電子束記錄儀(ebeam writer)使從 100nm到2Mm不同寬度范圍的納米結(jié)構(gòu)暴露于PMMA(步驟A)。在PMMA 顯影劑顯影3分鐘以后，30nm厚的鉻層熱氣化在PMMA罩上(步驟B)。 在升高(lift-off) 6 12小時(shí)后(步驟C)，使用反應(yīng)性離子蝕刻設(shè)備和 CHF3/Ar氣體混和物將該片蝕刻幾分鐘，達(dá)到蝕刻的深度在200 500nm 之間(步驟D)。在一個(gè)60秒的鉻罩濕化學(xué)蝕刻步驟(步驟E)以后， SU8基于環(huán)氧基的UV抗蝕刻劑(Microresisits， Germany)以3000rpm 被旋轉(zhuǎn)到該結(jié)構(gòu)上(步驟F)，使抗蝕刻層的厚度大約為10拜。在65'C 下烘焙該抗蝕刻層2分鐘以后，再在9(TC下烘焙5分鐘，將該層暴露在 UV下22秒，在65'C下后烘1分鐘，再在95'C下后烘2鐘，就形成了微 通道。顯影步驟在SU8顯影劑(Microresisits， Germany)中進(jìn)行2分鐘， 接下來(lái)用異丙醇漂洗(步驟G)。最終形成的模板結(jié)構(gòu)的掃描電鏡的圖像 如附圖7b所示。
在分壓大約為4毫巴下，使用(十三氟-l,l，2,2-四氫辛基)-三氯硅烷使
該模板在氣相中氟代硅烷化45分鐘。這層能很好的作為下面模塑步驟里
的抗粘層。
PDMS elastomer (Stygard 184, Dow Chemicals)與PDMS固化劑按 10:1比例混合，在模板上使其孔化(pored)并在65'C下固化10小時(shí)。 在從模板上釋放固化的PDMS后，將PDMS片切成片。并且打出來(lái)進(jìn)和 出的孑L 。該P(yáng)DMS沿著玻璃載玻片在PlasmaLab 80 (Oxfordlnstruments,Germany)中活化10秒鐘，條件是在70W, 120mtorrt， 氧氣流量為50sccm。
在這以后，將玻璃載玻片和PDMS片對(duì)齊，并且輕輕地壓在一起， 這導(dǎo)致了在PDMS與玻璃之間不可逆的結(jié)合。為了將電極包括在流體設(shè) 備里，微焊接的鉻/金電極附著在滑動(dòng)蓋板上，該滑動(dòng)蓋板臨近流體通道。
為了使電極鍍?cè)谕ǖ郎?，需要適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)校準(zhǔn)。
為了減少DNA分子在設(shè)備表面上的非特異性吸附，給結(jié)合的設(shè)備填 充甲基三乙氧基硅烷氣體，該甲基三乙氧基硅烷通過(guò)在12(TC時(shí)加熱硅烷 溶液30分鐘變成氣相。附圖8a示出了DNA分子在剛結(jié)合、未處理的玻 璃表面的吸附；然而附圖8b顯示了對(duì)于甲基硅垸化玻璃表面的情況在相 似的條件下吸附?jīng)]有發(fā)生。
附圖9顯示了微到納轉(zhuǎn)變和DNA-珠裝配體被捕獲的例子。該DNA好伸 MiSA^)米流體通道。附圖10顯示了 DNA-,配體加入到已經(jīng)被捕獲的組合 體中。
附圖lla和附圖lib顯示了用直流電場(chǎng)操縱捕獲的DNA。這里，在鍍鉻/ 金重疊電極(微裝配在滑動(dòng)蓋板上，該滑動(dòng)蓋板臨近微流體結(jié)構(gòu))上的最 大直流電壓是2伏特，PBS緩沖液濃度是70mM。
附圖llc顯示了Mii相反的流胸力流動(dòng)進(jìn)行的操縱。
附圖12顯示了在750nm寬的納;))6iiM,在H)s, tl-5min, t2-10min時(shí)， 用核酸外切酶(Exoin)降解捕獲的DNA。
在捕獲一些珠-DNA裝配體后，1M PBS裝配緩沖、^沒(méi)有輔因子Mg^ 的酶緩沖、 tt置換(NES1, New England BioLabs, New EnglancMJSA)。核酸外 切酶(New England BioLabs, New England^ USA)以1U/…濃度加入。在這個(gè) 階段，沒(méi)有降解被看見(jiàn)。在與酶緩沖液一起加入濃度為lOmM的鎂之后， 在大約10分鐘的時(shí)間里所有的X-DNA都降解了 。
附圖13顯示了降解的DNA片斷在納米通道出口處的聚集，分子檢 測(cè)器應(yīng)該安裝在這個(gè)位置(對(duì)照白圓圈)。
附圖17顯示了平面納米孔檢測(cè)器的實(shí)現(xiàn)。入口顯示了在鉻罩里30nm 收縮部的掃描電鏡圖像，這也用來(lái)確定在二氧化硅模板上納米通道結(jié)構(gòu) (附圖7a中的步驟C和步驟D)。在PDMS模塑和與玻璃結(jié)合后，本發(fā) 明者能證實(shí)像這么小的收縮部能被運(yùn)輸?shù)絇DMS結(jié)構(gòu)內(nèi)，并且仍可以用 含有FITC染料的水溶液填充(附圖n)。在這個(gè)概念里，由可移動(dòng)的物 體形成的收縮部的暫時(shí)堵塞能通過(guò)監(jiān)測(cè)通過(guò)收縮部的離子電流來(lái)測(cè)量。
這些步驟以后，用過(guò)的和空載的載體珠能從微納轉(zhuǎn)變中被釋放，該 釋放是通過(guò)例如應(yīng)用電、磁場(chǎng)、機(jī)械振蕩或者通過(guò)反向流體動(dòng)力流動(dòng)實(shí) 現(xiàn)的(附圖llc)。
實(shí)施例2
結(jié)構(gòu)尺寸對(duì)酶活性的影響
本發(fā)明者已經(jīng)觀察到DNA降解過(guò)程看起來(lái)在較寬通道里比在非常 狹窄的通道里更有效。附圖14a-c顯示了使用Xba酶(New England BioLabs， New England, USA)對(duì)捕獲的DNA分子的DNA降解實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。附圖14a 顯示了在t=0時(shí)的情況，接著在加入Xba I以后，在大約中心位置 (24508bp)裂解了 i-DNA。能夠很清楚的看到，2小時(shí)以后，在較寬通 道(即大于lMm)內(nèi)(圖14b)，降解進(jìn)行的很好，而在狹窄的通道(小 于或等于l^im)里，幾乎沒(méi)有發(fā)生變化。附圖14c顯示了 16小時(shí)以后的 情況，在這里幾乎所有的DNA鏈都顯示了同樣的長(zhǎng)度，這說(shuō)明狹窄通道 內(nèi)降解活性相當(dāng)?shù)汀ｏ@然，Xbal抗空間限制更敏感。
本發(fā)明者重復(fù)觀察到在狹窄通道里的DNA分子在酶降解步驟后仍 然很長(zhǎng)，并斷定對(duì)通道尺寸的細(xì)心結(jié)構(gòu)控制對(duì)調(diào)整酶活性有用。
實(shí)施例3
在液相中分子預(yù)濃縮和運(yùn)輸?shù)綑z測(cè)點(diǎn)
在這個(gè)實(shí)施例中，我們證明了通過(guò)在臨近從,納轉(zhuǎn)變處捕獲超過(guò)一 個(gè)的載體，DNA分子的濃度可以局部升高。附圖15a顯示了僅僅一些在 微到納轉(zhuǎn)變處捕獲的珠-DNA裝配體，引起了在納米通道里一定的熒光強(qiáng) 度。附圖15b顯示了一會(huì)以后的同一通道。更多的珠被捕獲，導(dǎo)致了局 部更高的DNA濃度，這從更強(qiáng)的熒光可以得出。
實(shí)施例4
通過(guò)使用酶從珠上釋放分析物(DNA)
在這個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明者證明了在珠-DNA組合體在臨近從微至納 轉(zhuǎn)變處被捕獲后DNA分子的完全釋放。這里，使用Sfol酶(NewEngland BioLabs，NewEngl肌(UJSA),該酶在靠近珠的固定點(diǎn)處切幵了X-DNA。附 圖16a顯示了初始捕獲的珠-DNA裝配體，附圖16b顯示了在如箭頭所標(biāo) 記的通道里DNA鏈的酶引發(fā)的釋放后相同的位置。
在說(shuō)明書、權(quán)利要求和/或附圖中公開(kāi)的本發(fā)明的特征可以是分別的 和其中任意結(jié)合的，以其不同形式用于理解本發(fā)明的材料。
權(quán)利要求
1、一種用于處理分析物的設(shè)備，其包括基底，所述基底是單片材料并且包含通道系統(tǒng)，所述通道系統(tǒng)具有至少一個(gè)第一類型通道，所述第一類型通道的尺寸是深度和寬度為1μm到1mm，至少一個(gè)第二類型通道，所述第二類型通道與所述第一類型通道是流體相連的，所述第二類型通道的深度和寬度為1nm到2000nm，所述第一類型通道流入所述第二類型通道，分析物處理或釋放區(qū)域，所述區(qū)域形成在所述第一類型通道流入所述第二類型通道的位置，以及與所述第二類型通道是流體相連的的檢測(cè)器，所述檢測(cè)器與所述分析物處理或釋放區(qū)域相隔開(kāi)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1的設(shè)備，所述基底不是復(fù)合基底。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1 2任一權(quán)利要求的設(shè)備，進(jìn)一步包括冑辦結(jié)合分析物 的載體顆粒，以及能夠在所述第一類型iiii內(nèi)運(yùn)輸所述載體顆粒的在所m道 系統(tǒng)內(nèi)的，ij。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3的設(shè)備，其中所述載體顆粒的尺寸為O.lnm到l鵬的， i^為100nm至ij5Mm。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1 4任一權(quán)禾腰求的設(shè)備，其中所述第一鄉(xiāng)通道的尺 寸是所述載體顆粒尺寸的至少5倍寬和深。
6、 根據(jù)前述任何一權(quán)利要求的設(shè)備，其中所述第一類型鵬的尺寸是深度 為10拜到20拜，寬度為10拜到200拜，并^g^f述載體顆粒的尺寸是在小于 或等于2^m的范圍內(nèi)。
7、 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)禾腰求的設(shè)備，其中所述分析物鵬或釋放區(qū)域有錐 形結(jié)構(gòu)，其中所述通道系統(tǒng)的橫截面從所述第一，通道到所述第二類型皿 以不連續(xù)梯度或連續(xù)地減小。
8、 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)禾腰求的設(shè)備，其中所述第二鄉(xiāng)鵬的尺寸是深度 和寬度為100nm到800nm。
9、 根據(jù)權(quán)禾腰求1 7任一權(quán)利要求的設(shè)備，其中所述第二鄉(xiāng)通道的尺 寸范圍是從大于lMm到2拜。
10、 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的設(shè)備，其中所述第一，通道另外還包括 阻礙結(jié)構(gòu)，所述阻礙結(jié)構(gòu)在所述第一鄉(xiāng)通道中防止物質(zhì)例如翻卿載體顆粒 的未阻礙流動(dòng)。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10的設(shè)備，其中所述阻礙結(jié)構(gòu)是被^i^f述第一，通 道中的正方形、三角形、圓形物質(zhì)。
12、 根據(jù)權(quán)禾腰求3 11任一權(quán)利要求的設(shè)備，其中所述載體顆粒是球形 的、立方體形的、平行皿或不規(guī)則形狀。
13、 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的設(shè)備，其中所述第一類型通道的長(zhǎng)度為 lmm到10cm，并且所述第二^通道的長(zhǎng)度為lnm到lmm，優(yōu)選為100nm到 100,
14、 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的設(shè)備，其中所述檢測(cè)器與所述分析物處理 區(qū)域有一距離，所淑巨離為lnm至ij 1000Mm， 1M為5nm至iJlMm。
15、 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的設(shè)備，其中戶，檢測(cè)器選自生物孔蛋白、 人造納米孔、納隙傳感器、電化學(xué)傳感器、光譜傳感器、質(zhì)譜傳感器、拉曼光 譜傳 和FTIR光譜傳繊。
16、 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)禾腰求的設(shè)備，其進(jìn)一步包括引A!P/或維持翻訴口 載體顆粒Mil^^I3I系統(tǒng)流動(dòng)的裝置。
17、 根據(jù)權(quán)利要求16的設(shè)備，其中所述引A^卩/或維持流動(dòng)的裝置在所述 、歸訴卩/^^ 述載體顆粒上施加電力、磁力、電磁力或流體動(dòng)力。
18、 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的設(shè)備，其進(jìn)一步包括^E^述分析物處理或 釋放區(qū)域固定所述載體顆粒的裝置。
19、 根據(jù)權(quán)利要求18的設(shè)備，其中戶脫固定體^^f述翻訴卩/^^述載 體顆粒上施加電力、磁力、電磁力或流胸力。
20、 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的設(shè)備，其中所述基底是由選自硅、二氧化 硅、玻璃、聚合物例如PDMS、聚碳酸酯、PE、硅敏的材料制成的，并且所 述鵬系統(tǒng)是通過(guò)電子束記錄術(shù)、蝕刻術(shù)、模塑、聚焦離子束蝕刻術(shù)、激光 燒蝕術(shù)、壓花制成的。
21、 根據(jù)權(quán)利要求20的設(shè)備，其中所述基底是由聚合物或聚合物組合 制成的，并且所述基底是使用模板通過(guò)模塑或壓花所述聚合物形成單片材料，^;;f述模板里，提供了所艦縣統(tǒng)的負(fù)象。
22、 根據(jù)權(quán)禾腰求3 21任一權(quán)利要求的設(shè)備，其中所述載體顆粒是由選 自二氧化硅、三氧化二鋁，金屬性的禾P/或有磁性的材料例如Au、 Ag、 Pd、 Pt、 Al、 Ti、 Fe、 Ni，陶瓷和聚，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯、 聚四氟乙烯、三聚鄉(xiāng)、聚交酯、葡聚糖的材料制成的。
23、 根據(jù)權(quán)利要求3 22任一項(xiàng)的設(shè)備，其中所述載體顆粒進(jìn)一步包括分 析物結(jié)合基團(tuán)，所述基團(tuán)與所述分析物上的相應(yīng)載體顆粒結(jié)合基團(tuán)相互作用。
24、 根據(jù)權(quán)利要求23的設(shè)備，其中一對(duì)分析銀結(jié)合基團(tuán)和相應(yīng)的載體顆 粒結(jié)合基團(tuán)選自生物素/(鏈霉)抗生物素蛋白、抗像抗原、皿醇變體、像His6、 凝集素/糖、谷胱甘肽/谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，NH2/COOH/環(huán)氧基共價(jià)鍵合、 以高親合力結(jié)合來(lái)自各種物種的不同種類和子類免疫球蛋白的Fe片段的 蛋白A、G，氫鍵，或基于DNA堿基雜交、適體結(jié)合例如蛋白質(zhì)-DNA/RNA 相互作用、膠原/膠原結(jié)合蛋白，Dig/抗洋地黃毒苷，或者基于激素結(jié)合， 或者基于其它靜電、離子和/或共價(jià)相互作用。
25、 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的設(shè)備，其中所^Mit系統(tǒng)^^3^I道的表 面被修飾，所述修飾^I過(guò)應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)以減少分析物在表面上的非特異性吸 附而實(shí)現(xiàn)的。
26、 根據(jù)權(quán)利要求25的設(shè)備，其中所銜,JM31液相沉積或氣相沉積， i^氣相沉積，更,皿的氣相沉積來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
27、 根據(jù)權(quán)利要求25 26任一項(xiàng)的設(shè)備，其中所^1道的所述表面選自聚 合物例如PDMS和二氧化硅。
28、 根據(jù)權(quán)利要求27的設(shè)備，其中所述修飾;1JM;將所述表面暴露于具有 化學(xué)端基例如甲基、氨基、氟或硫醇基的硅烷化合物或?qū)⑹杷鶊F(tuán)暴露于 所述通道表面的其它種類分子來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
29、 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)禾腰求的設(shè)備，其進(jìn)一步包括柳述分析物鵬或 釋放區(qū)域A^f述載體顆粒釋^^述分析物的^S。
30、 根據(jù)權(quán)利要求29的設(shè)備，其中釋^^f述分析物的裝置基于所述分析 物從所述載體顆粒的光誘導(dǎo)釋放、電場(chǎng)誘導(dǎo)釋放、MJS誘導(dǎo)釋放、化學(xué)反應(yīng) 或生化反應(yīng)例如與輔因子的生化反應(yīng)、酶介導(dǎo)誘導(dǎo)的釋放，來(lái)實(shí)施這樣的 釋放。
31、 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的設(shè)備，其進(jìn)一步包括il31化學(xué)反應(yīng)例如裂 解成更小的片段或結(jié)構(gòu)單元，而進(jìn)一步^H所述分析物的裝置。
32、 根據(jù)權(quán)利要求31的設(shè)備，其中所^iii化學(xué)反應(yīng)進(jìn)一步處a^述分析物的裝置是載體珠，在所述載體珠上固定有化學(xué)劑，皿酶。
33、 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的設(shè)備，其中所述分析物選自核酸例如單鏈、 雙鏈DNA、 RNA、蛋白質(zhì)、多肽、藥物以及在環(huán)境剝牛下是氣態(tài)g^態(tài)的其他、生物學(xué)或環(huán)境上有害的^F。
34、 一種處理和/或檢測(cè)分析物的方法，所述方法包括以下步驟 —將分析物結(jié)合在如權(quán)利要求3 33任一項(xiàng)所述的載體顆粒上，—通過(guò)權(quán)利要求1 33任一項(xiàng)的設(shè)備的所^lit系統(tǒng)，將所述載體顆粒和結(jié)合到其上的分析物運(yùn)輸?shù)剿鲈O(shè)備的戶;M分析物處理^放區(qū)域上， 一將所述載體顆粒和結(jié)合到其上的分析物固定在戶;M分析物處理，放區(qū)域上，—通過(guò)應(yīng)用光、電場(chǎng)、磁場(chǎng)、電磁場(chǎng)、熱或冷，^!3i實(shí)施化學(xué)或生艦 解反應(yīng)例如1頓酶，如核酸酶、蛋白酶例如ExoI、 Exoffl、 Sfol、 Xbal和其它 限制酶的化學(xué)或生傾解反應(yīng)，A^萬(wàn)述載體顆粒上釋^M述分析物，和/^1^行化學(xué)或生^^反應(yīng)例如{頓酶，如核酸酶、蛋白,i洳Exo I、 Exoffl、 Sfol、 Xba I和其它P艮制酶的化學(xué)或生^f反應(yīng)，來(lái)^bSI^述分析 物，—將所述釋放的分析物激; 述處理過(guò)的分析物^0f述釋aa處理過(guò)的分析 物運(yùn)輸?shù)剿鰴z測(cè)器上H頓權(quán)禾腰求1 33任一項(xiàng)所述的檢測(cè)器檢測(cè)戶服釋放的分析物^^f述處理過(guò)的分析物^^述釋放且，過(guò)的分析物。
35、 根據(jù)權(quán)利要求34的方法，所述方法進(jìn)一步包括在所述分析物已經(jīng)被釋 放和/或處理后從所述分析物處理，放區(qū)域去除所述載體顆粒的步驟。
36、 根據(jù)權(quán)利要求34 35任一項(xiàng)的方法，其中所述的運(yùn)輸步驟和所述去除 步驟是利用權(quán)利要求16 33任一項(xiàng)所述的引A!P/或維持總卿載體顆粒的流 動(dòng)的裝置^行的。
37、 根據(jù)權(quán)利要求34 36任一項(xiàng)的方法，其中m^固定步驟Jiil31所述分 析物鵬離放區(qū)域的尺寸^1權(quán)禾腰求18 33任一項(xiàng)戶脫的所述固定所述載體顆粒的^g,或者M(jìn);二者的組合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
38、 根據(jù)權(quán)利要求34 37任一項(xiàng)的方法，其中j頓所述檢測(cè)器的檢澳涉驟 是通過(guò)光學(xué)檢測(cè)、化學(xué)檢測(cè)、電檢測(cè)、磁檢測(cè)、電化學(xué)檢測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
39、 根據(jù)權(quán)利要求34 38任一項(xiàng)的方法，其中所述分析物是核酸，所述處理分析物的步驟是所述核酸的,降解，所述檢測(cè)所述處理過(guò)的分析物的步驟 包括單核苷酸或核苷酸堿基的檢測(cè)，以說(shuō)明所述核酸的序列。
40、 根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述,隨Jiilil將載體珠加入到所 ^Mit系統(tǒng)中來(lái)實(shí)現(xiàn)的，^^ ^Mit上，固定有用于 的載體繊。
41、 一種制造權(quán)禾腰求1 33任一項(xiàng)的設(shè)備的方法，所述方魏括以下步驟—提供模板，所述模版具有權(quán)利要求1 33任一項(xiàng)所述的所^Mit系統(tǒng)的負(fù)象，一使用所述模板和聚合物材料或適合形成聚合物的材料來(lái)模塑或壓花所 述基底，從而獲得所述作為單片材料的基底，所述基底包括所述通道系統(tǒng)。
42、 根據(jù)權(quán)利要求41的方法，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟 一用平板例如玻璃板，覆蓋所述通道系統(tǒng)。
43、 根據(jù)權(quán)利要求41 42任一項(xiàng)的方法，其中所述模板的所述通道系統(tǒng) 的負(fù)象是通過(guò)選自電子束記錄術(shù)、蝕刻術(shù)、離子束蝕刻術(shù)、激光燒蝕術(shù)、 光刻技術(shù)和這些技術(shù)的組合的方法形成的。
全文摘要
本發(fā)明涉及用來(lái)處理分析物的設(shè)備及其使用方法。所述設(shè)備包括包含通道系統(tǒng)的基底，所述通道系統(tǒng)具有至少一個(gè)第一類型通道和至少一個(gè)第二類型通道；分析物處理或釋放區(qū)域；以及與所述第二類型通道是流體相連的的檢測(cè)器。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK101393090SQ200810210378
公開(kāi)日2009年3月25日 申請(qǐng)日期2008年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月22日
發(fā)明者C·巴斯奎因, I·霍斯帕克, O·哈尼克, 安田章夫 申請(qǐng)人:索尼德國(guó)有限責(zé)任公司