專(zhuān)利名稱(chēng)：：表達(dá)以及分泌制管張素和內(nèi)皮抑制素的免疫融合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及制備和使用含有血管生成抑制劑的融合蛋白的方法和組合物。更具體地講，本發(fā)明涉及制備和使用含有免疫球蛋白Fc區(qū)和血管生成抑制劑的稱(chēng)為免疫融合物(immunofusin)的融合蛋白的方法和組合物。
背景技術(shù)：
：人們發(fā)現(xiàn)兩種有效血管生成抑制劑制管張素(O，Reilly等(1994)Cell79:315)和內(nèi)皮抑制素(O'Reilly等(1997)Cell88:277)由原發(fā)性腫瘤天然產(chǎn)生。這兩種蛋白是內(nèi)皮細(xì)胞增生的特異性抑制劑并通過(guò)阻斷血管生成(阻斷供給肺瘤營(yíng)養(yǎng)的新血管的形成)而抑制腫瘤生長(zhǎng)。研究表明，這些血管生成抑制劑甚至在非常高劑量下都是無(wú)毒的，它們可以抑制轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)并可以使原發(fā)性腫瘤退化到顯微休眠狀態(tài)。已鑒定出這兩種抑制劑是非常大的完整分子的蛋白酶解片段。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)制管張素是纖溶酶原的一個(gè)片段，而內(nèi)皮抑制素^M原蛋白XVIII的一個(gè)片段。在癌癥領(lǐng)域人們已非常關(guān)注這兩種蛋白，因?yàn)橐呀?jīng)證實(shí)它們抑制小鼠中的許多不同類(lèi)型腫瘤的生長(zhǎng)，而沒(méi)有明顯的副作用或抗藥性。傳統(tǒng)的化學(xué)治療通常導(dǎo)致主要由癌細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定性引起的獲得性抗藥性。使用血管生成抑制劑的治療不是把癌細(xì)胞作為目標(biāo)而是針對(duì)支持腫瘤生長(zhǎng)的正常內(nèi)皮細(xì)胞。因?yàn)閮?nèi)皮細(xì)胞在遺傳上是穩(wěn)定的，所以血管生成抑制劑治療可減少抗藥性。這些研究表明，釆用內(nèi)皮抑制素的延長(zhǎng)的抗血管生成治療的小鼠不發(fā)生抗藥性。因此，對(duì)小鼠周期性重復(fù)的內(nèi)皮抑制素治療延長(zhǎng)腫瘤休眠期以及停止治療后腫瘤不復(fù)發(fā)(Boehm等(1997)Nature390:404)。盡管用小鼠獲得有希望的結(jié)果，但是仍然不能用大腸桿菌、桿狀病毒、酵母和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)大批量生產(chǎn)臨床級(jí)可溶的、有活性的制管張素和內(nèi)皮抑制素。用大腸桿菌表達(dá)獲得不確定組合物的不溶性蛋白聚集物，不能將這種蛋白注射到人體內(nèi)。其它生產(chǎn)方法諸如桿狀病毒和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)得到非常低水平的重組蛋白(O'Reilly等(1997)Cell88:277)。迄今可以將該低得率表達(dá)系統(tǒng)解釋為制管張素和內(nèi)皮抑制素這兩種是非常大的蛋白內(nèi)部片段。在缺乏從前體分子中切割的殘基時(shí)，該截短蛋白可能沒(méi)有進(jìn)行合適的折疊。例如，制管張素有26個(gè)形成大量二硫鍵的半胱氨酸殘基。在分泌途徑中，制管張素自身的表達(dá)不能提供最適環(huán)境以正確地形成這些大量的二硫4定。此外，以大腸桿菌生產(chǎn)的重組內(nèi)皮抑制素蛋白在透析期間沉淀，可能是由于內(nèi)皮抑制素的疏水性引起(O，Reilly等(1997)Cell88:277)。以其現(xiàn)存形式使用制管張素和內(nèi)皮抑制素主要障礙是不得不將相對(duì)大量的蛋白每天注射，持續(xù)數(shù)星期至數(shù)月以達(dá)到所需的臨床效果。例如，目前在小鼠才莫型中，需要?jiǎng)┝?0mg/kg/天的內(nèi)皮抑制素以證實(shí)最佳藥效(Boehm等(1997)Nature390:404)。已知急需在臨床上試驗(yàn)內(nèi)皮抑制素和制管張素，重要是的得到可以產(chǎn)生大量臨床級(jí)物質(zhì)的生產(chǎn)方法。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，已經(jīng)用來(lái)生產(chǎn)高水平表達(dá)融合蛋白的一種表達(dá)系統(tǒng)是編碼信號(hào)序列、免疫球蛋白Fc區(qū)和靶蛋白的DNA構(gòu)成物。這種構(gòu)成物的融合產(chǎn)物統(tǒng)稱(chēng)為"免疫融合物"。已經(jīng)將幾種靶蛋白成功地表達(dá)為免疫融合物，它們包括IL2、CD26、Tat、Rev、OSF-2、(3IG-H3、IgE受體、PSMA和gpl20。這些表達(dá)構(gòu)成物7>開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利第5,541,087號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利第5,726,044號(hào)，其公開(kāi)內(nèi)容均通過(guò)引用結(jié)合到本文中。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，表達(dá)重組融合蛋白的主要目的一直是試圖對(duì)所述雜種分子賦予新的或有用的特性，例如合適的折疊、增加溶解度、體內(nèi)引導(dǎo)細(xì)胞因子或毒素、Fc受體結(jié)合、補(bǔ)體活化、A蛋白結(jié)合、延長(zhǎng)循環(huán)半壽期和增加穿過(guò)血-腦屏障的能力。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中所產(chǎn)生的重組融合蛋白的實(shí)例包括細(xì)胞因子免疫綴合物(Gillies等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1428;Gillies等(1993)BioconjugateChemistry4:230)、免疫粘附素(Capon等(1989)Nature337:525)、免疫毒素(Chaudhary等(1989)Nature339:394)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子綴合物(Friden等(1993)Science259:373)。上述每個(gè)出版物都通引用結(jié)合到本文中。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供有利于在各種哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中有效地生產(chǎn)和分泌血管生成抑制劑的新的DNA。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供治療哺乳動(dòng)物的方法，該治療方法采用編碼血管生成抑制劑蛋白的核酸或氨基酸序列明確的血管生成抑制劑蛋白，包括非天然的、生物合成或其它人工蛋白諸如合理設(shè)計(jì)產(chǎn)生的蛋白。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的特征是用于制備和使用含有血管生成抑制劑蛋白的融合蛋白的方法和組合物。所述融合蛋白可以促進(jìn)高水平表達(dá)有生物活性的血管生成抑制劑蛋白。然后在給予哺乳動(dòng)物(例如人)之前，可以將血管生成抑制劑蛋白從所述融合蛋白中切下并將其與藥學(xué)上可接受的載體組合?；蛘撸梢詫⒕幋a含有血管生成抑制劑的融合蛋白的核酸序列或氨基酸序列明確的含有血管生成抑制劑的融合蛋白與藥學(xué)上可接受的載體組合，然后給予所述哺乳動(dòng)物。在一方面，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸分子，例如DNA或RNA分子。所述核酸分子編碼信號(hào)序列、免疫球蛋白Fc區(qū)和至少一種耙蛋白，本文也稱(chēng)為血管生成抑制劑蛋白，所述蛋白選自制管張素、內(nèi)皮抑制素、具有制管張素活性的纖溶酶原片段、具有內(nèi)皮抑制素活性的膠原蛋白XVIII片段和它們的組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子從5，到3'方向依次編碼信號(hào)序列、免疫球蛋白Fc區(qū)和靶蛋白序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子從5，到3'方向順序地編碼信號(hào)序列、靶序列和免疫^(guò)^蛋白Fc區(qū)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白Fc區(qū)包括免疫球蛋白鉸鏈區(qū)，而最好是包括至少一個(gè)免疫^(guò)求蛋白重鏈恒定區(qū)，例如免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)第2(CH2)結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)第3(CH3)結(jié)構(gòu)域并且根據(jù)用來(lái)產(chǎn)生Fc區(qū)的免疫^(guò)求蛋白的類(lèi)型，任選包括免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)第4(CH4)結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白Fc區(qū)包括絞鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。在某些情況下，所述免疫J求蛋白Fc區(qū)最好是缺乏至少CH!結(jié)構(gòu)域。盡管所述免疫球蛋白Fc區(qū)可以基于任何免疫球蛋白種類(lèi)，例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，但是優(yōu)選為基于IgG的免疫球蛋白Fc區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以有效地結(jié)合將本發(fā)明的核酸摻入到復(fù)制型表達(dá)載體中，然后可以將其轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的這種核酸序列的宿主細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供包含或者直接通過(guò)多肽鍵或者用多肽接頭的方式，與靶蛋白連接的免疫球蛋白Fc區(qū)的融合蛋白，所述靶蛋白選自制管張素、內(nèi)皮抑制素、具有制管張素活性的纖溶酶原片段、具有內(nèi)皮抑制素活性的膠原蛋白XVIII片段和它們的組合物。可以將所述靶蛋白通過(guò)其C-末端融合到免疫球蛋白Fc區(qū)的N-末端。然而，在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述靶蛋白通過(guò)其N(xiāo)-末端融合到免疫球蛋白Fc區(qū)的C-末端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合蛋白可以包^i4自制管張素、內(nèi)皮抑制素、具有制管張素活性的纖溶酶原片段和具有內(nèi)皮抑制素活性的膠原蛋白XVIII片段的第二靶蛋白。在這種類(lèi)型的構(gòu)成物中，第一和第二革巴蛋白可以是相同或不相同的蛋白。例如，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含第一靶蛋白制管張素、免疫球蛋白Fc區(qū)和第二靶蛋白內(nèi)皮抑制素。可以將第一和第二靶蛋白或者直接地或者用多肽接頭的方連接在一起。另一方面，可以將這兩種靶蛋白或者直接地或者通過(guò)多肽接頭連^f妻到所述免疫5求蛋白Fc區(qū)。在后一種情況下，將第一靶蛋白連接到免疫3求蛋白Fc區(qū)的N-末端，而將第二靶蛋白連接到免疫球蛋白Fc區(qū)的C-末端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩種融合蛋白可以或者通過(guò)共價(jià)鍵(例如二硫鍵或肽鍵)或者通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合產(chǎn)生多聚體蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將兩種融合蛋白通過(guò)半胱氨酸殘基(最好是位于排列在這兩條鏈的免疫球蛋白Fc區(qū)內(nèi)的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)內(nèi))的一個(gè)或多個(gè)二硫鍵共價(jià)結(jié)合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述靶蛋白包含分子量約40kD的纖溶酶原片段，并任選地包含SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述靶蛋白包含具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的膠原蛋白XVIII片段。此外，所述靶蛋白可以是全長(zhǎng)制管張素或內(nèi)皮抑制素或它們的生物活性片段。在制備某些融合蛋白中所述靶蛋白的來(lái)源將取決于所述靶蛋白預(yù)期的用途。例如，如果是將所述靶蛋白給予人，則所述耙蛋白最好是人源靶蛋白。在另一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)包含免疫球蛋白Fc區(qū)和靶蛋白的融合蛋白的方法，所述靶蛋白選自制管張素、內(nèi)皮抑制素、具有制管張素活性的纖溶酶原片段和具有內(nèi)皮抑制素活性的膠原蛋白XVIII片段。所述方法包括步驟(a)提供含有編碼這種融合蛋白的DNA分子(或者有或者沒(méi)有信號(hào)序列)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和(b)培養(yǎng)所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞以生產(chǎn)所述融合蛋白。然后可以將所生產(chǎn)的融合蛋白收集、重折疊，必要時(shí)，采用眾所周知的常規(guī)純化技術(shù)純化，然后在本領(lǐng)域中使用。假設(shè)所述融合蛋白包含在免疫球蛋白Fc區(qū)和所述靶蛋白之間排列的蛋白水解酶切割位點(diǎn)，則可以采用常規(guī)蛋白水解酶將所述靶蛋白從所述融合蛋白中切除，并且必要時(shí)，在使用之前純化。在另一方面，本發(fā)明提供治療需要血管生成抑制劑基本治療的哺乳動(dòng)物(例如人)的方法。例如，設(shè)想可以將本發(fā)明的血管生成抑制劑給予腫瘤患者。用血管生成抑制劑治療可以使腫瘤生長(zhǎng)減慢或停止，并在某些情況下，可以引起腫瘤消退。治療可以包括給予所述哺乳動(dòng)物足量的血管生成抑制劑以使肺瘤生長(zhǎng)減慢或停止。可以以融合蛋白的形式或核酸、最好是與表達(dá)載體有效結(jié)合核酸與藥學(xué)上可接受的載體組合，提供所述血管生成抑制劑。從以下詳細(xì)描述、附圖和權(quán)利要求書(shū)中，本發(fā)明的前面所述和其它目的、特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將更加顯而易見(jiàn)。圖1A-1F是按照本發(fā)明構(gòu)建的典型血管生成抑制劑融合蛋白的示意圖(參見(jiàn)實(shí)施例10-15)。所述圖分別描述了，圖1A，制管張素的Fc-Kringle1;圖1B，制管張素的Fc-內(nèi)部Kringle1;圖1C，制管張素的Fc-內(nèi)皮抑制素-GlySer接頭-內(nèi)部Kringle1;圖1D，制管張素的Fc-內(nèi)皮抑制素-GlySer接頭-Kringle1;圖1E，F(xiàn)c-內(nèi)皮抑制素-GlySer接頭-制管張素；圖1F，制管張素-Fc-內(nèi)皮抑制素。垂直線(xiàn)代表連接排列在所述Fc分子絞鏈區(qū)內(nèi)的連接半胱氨酸殘基(C)任選的二硫鍵。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供融合蛋白，本文是指免疫融合物，所述融合蛋白可用于大批量生產(chǎn)臨床級(jí)血管生成抑制劑。在使用之前，可以將所述血管生成抑制劑從免疫融合物蛋白構(gòu)成物中切下。然而，設(shè)想可以將所述免疫融合物或編碼所述免疫融合物的核酸直接給予需要用血管生成抑制劑治療的哺乳動(dòng)物。因此，本發(fā)明提供包含免疫球蛋白Fc區(qū)和至少一種靶蛋白的融合蛋白，靶蛋白在本文是指血管生成抑制劑。血管生成抑制劑最好是選自制管張素、內(nèi)皮抑制素、具有制管張素活性的纖溶酶原片段、具有內(nèi)皮抑制素活性的膠原蛋白xvm片段。然而，設(shè)想可以將具有血管生成抑制劑活性的其它多肽(目前已知的或以后發(fā)現(xiàn)的)表達(dá)成為本文所述類(lèi)型的融合蛋白。在如圖1A-1F的附圖中，說(shuō)明了體現(xiàn)本發(fā)明蛋白構(gòu)成物的6個(gè)典型的實(shí)施方案。因?yàn)閮?yōu)選為二聚體構(gòu)成物，所以用通過(guò)半胱氨酸在相鄰的亞基之間的一對(duì)二硫鍵交聯(lián)的二聚體進(jìn)行所有說(shuō)明。在所述附圖中，圖示二硫鍵通過(guò)免疫球蛋白鉸鏈區(qū)將兩個(gè)免疫球蛋白Fc部分連接在一起，因此具有這些分子的天然形式的特征。當(dāng)優(yōu)選包括Fc鉸鏈區(qū)的構(gòu)成物并且該構(gòu)成物已經(jīng)顯示有希望作為治療劑的同時(shí)，本發(fā)明設(shè)想可以根據(jù)需要選擇在其它位置上進(jìn)行交聯(lián)。此外，在某些情況下，用于實(shí)施本發(fā)明的二聚體和多聚體可以由非共價(jià)結(jié)合而產(chǎn)生，例如，疏水性相互作用。因?yàn)橥炊垠w構(gòu)成物是本發(fā)明重要的實(shí)施方案，所以圖l說(shuō)明了這樣的構(gòu)成物。應(yīng)當(dāng)認(rèn)為異源二聚體結(jié)構(gòu)也是有用的，但正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，通常難以將它們純化。然而，可以構(gòu)建用于在包包括同源二聚體和異源二聚體的混合物。例如，所述異源二聚體結(jié)構(gòu)的一條鏈可以包含內(nèi)皮抑制素，而另一條鏈則可以包含制管張素。圖1A說(shuō)明按照實(shí)施例10中所述方法生產(chǎn)的二聚體構(gòu)成物。所述二聚體的每個(gè)單體包含包括鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白Fc區(qū)1。直接與Fc區(qū)1的C端連接的是制管張素2的第一Kringle區(qū)，內(nèi)環(huán)和外環(huán)兩種。圖1B顯示包含如圖1A中的相同F(xiàn)c區(qū)的本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案(參見(jiàn)實(shí)施例11)，這時(shí)僅具有與Fc區(qū)1的C末端連接的制管張素3的Kringle1的內(nèi)環(huán)。從圖1C到IE描述了本發(fā)明所述蛋白構(gòu)成物的各種實(shí)施方案，所述蛋白構(gòu)成物包括作為靶蛋白的串聯(lián)排列和接頭連接的多種血管生成抑制劑。圖1C中，所述靶蛋白包含全長(zhǎng)內(nèi)皮抑制素4、多肽接頭5和制管張素3的Kringle1的內(nèi)環(huán)。圖ID圖示蛋白包含如圖1A相同的Fc區(qū)以及包含全長(zhǎng)內(nèi)皮抑制素4、多肽^接頭5和全部Kringle1區(qū)的制管張素(內(nèi)環(huán)和外環(huán)兩種)2的靶蛋白。因?yàn)樽畲驝端蛋白結(jié)構(gòu)域包含全長(zhǎng)拷貝制管張素7中，所以圖1E與圖ID的構(gòu)成物不同。盡管圖lA-lE表示Fc-X型構(gòu)成物，其中X為所述靶蛋白，但是設(shè)想X-Fc型構(gòu)成物也可用于實(shí)施本發(fā)明。此外，設(shè)想本發(fā)明有用的蛋白也可用公式X-Fc-X表示，其中X代表相同或不相同的靶蛋白。圖1F描述了這樣的一種構(gòu)成物，所述構(gòu)成物包含N-至C-端方向的全長(zhǎng)人制管張素7、包括鉸鏈區(qū)的人免疫球蛋白Fc區(qū)6和全長(zhǎng)人內(nèi)皮抑制素結(jié)構(gòu)域4。本文所用的術(shù)語(yǔ)"血管生成抑制劑，，是指減少或抑制哺乳動(dòng)物中的新血管形成的任何多肽鏈。關(guān)于癌癥治療，所述血管生成抑制劑減少或抑制肺瘤內(nèi)或表面、最好是在實(shí)體瘤的里面或表面的新血管形成。設(shè)想釆用眾所周知的多種常用方法可以鑒定有用的血管生成抑制劑。這樣的方法包括，例如牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)^^增生測(cè)定、雞尿嚢絨膜(CAM)測(cè)定或小鼠角膜測(cè)定。然而，優(yōu)選為CAM測(cè)定(參見(jiàn)，例如O'Reilly等(1994)Cell79:315-328和O'Reilly等(1997)Cell88:277-285,其公開(kāi)內(nèi)容均通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。概括地講，從受精三天卵白中取出具有完整卵黃的胚胎，然后置于培養(yǎng)皿中。于37。C、3%C02溫育三天后，將各個(gè)胚胎尿嚢絨膜置于含有推定的血管生成抑制劑的甲基纖維素板中。在溫育約48小時(shí)之后，于顯微鏡下觀察所述尿嚢絨膜以提供抑制區(qū)的證據(jù)。用于實(shí)施本發(fā)明優(yōu)選的血管生成抑制劑包括，例如制管張素(O'Reilly等(1994)Cell79:315-328和美國(guó)專(zhuān)利第5,733,876、5,837，682和5,885,795號(hào))和內(nèi)皮抑制素(O'Reilly等(l997)Cell88:277-285和美國(guó)專(zhuān)利第5,854,205號(hào))。如前所述，制管張素和內(nèi)皮抑制素是內(nèi)皮細(xì)胞增生的特異性抑制劑并能夠通過(guò)阻斷血管生成而抑制腫瘤生長(zhǎng)，即阻斷供給肺瘤營(yíng)養(yǎng)的新血管的形成。已經(jīng)鑒定制管張素為纖溶酶原的蛋白酶解片段(O，Reilly等(1994)Cell79:315-328和美國(guó)專(zhuān)利第5,733,876、5,837,682和5,885，795號(hào)，這些公開(kāi)內(nèi)容都通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。具體地講，制管張素是含有至少三個(gè)纖溶酶原Kringle區(qū)的纖溶酶原的38kDa內(nèi)部片段。已經(jīng)鑒定內(nèi)皮抑制素為膠原蛋白XVIII的蛋白酶解片段(O，Reilly等(1997)Cell88:277-285,其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。具體地講，內(nèi)皮抑制素是膠原蛋白XVIII的20kDaC-末端片段。本文所用的術(shù)語(yǔ)"制管張素"和"內(nèi)皮抑制素"不僅是指全長(zhǎng)蛋白，而且還分別指其變異體和生物活性片段，以及纖溶酶原和膠原蛋白XVIII的生物活性片段。術(shù)語(yǔ)生物活性片段，就制管張素而論是指纖溶酶原或制管張素的任何蛋白片段，根據(jù)CAM測(cè)定所述片段至少具有全長(zhǎng)制管張素活性的30%，更優(yōu)選至少70%和最優(yōu)選至少90%。術(shù)語(yǔ)生物活性片段，就內(nèi)皮抑制素而論是指膠原蛋白XVIII或內(nèi)皮抑制素的任何蛋白片段，根據(jù)CAM測(cè)定所述片段至少具有全長(zhǎng)內(nèi)皮抑制素活性的30%,更優(yōu)選至少70%和最優(yōu)選至少90%。術(shù)語(yǔ)變異體包括特定變異體和等位變異體，以及其它天然產(chǎn)生或非天然產(chǎn)生的變異體，例如由常規(guī)基因工程方法產(chǎn)生的變異體，它們管張素天然產(chǎn)生序列至少70%相似或60%相同，更優(yōu)選至少75%相似或65%相同和最優(yōu)選的80%相似和70%相同。為了確定候選多肽是否與參比多肽具有必不可少的相似性或同一性的百分率，首先將候選氨基酸序列和參比氨基酸序列對(duì)比，所述序列對(duì)比采用Sm池和Waterman(1981)，J.Mol.Biol.147:195-197中戶(hù)斤4葛述的的動(dòng)態(tài)纟扁禾呈算法(dynamicprogrammingalgorithm)禾口Henikoff和Henikoff(1992)"蛋白質(zhì)組件的^J^酸取代矩陣"，Proc.Natl.AcadSci.USA89:10915-10919的圖2中所描述的BLOSUM62取代矩陣。對(duì)于本發(fā)明，缺口插入補(bǔ)償參數(shù)(gapinsertionpenalty)的合適值為-12，而缺口延伸補(bǔ)償參數(shù)(gapextensionpenalty)的合適值為-4。采用Sm池-Waterman算法和BLOSUM62矩陣諸如GCG程序組(OxfordMolecularGroup,Oxford,英國(guó))進(jìn)行序列對(duì)比的計(jì)算機(jī)程序是市場(chǎng)上可得到的并被本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛使用。一旦在候選序列和參比序列之間進(jìn)行了序列對(duì)比，就可以計(jì)算出相似性的百分?jǐn)?shù)。將每條序列的各個(gè)氨基酸按照它們與其它氨基酸的相似性依次比較。如果相對(duì)于兩個(gè)對(duì)比的氨基酸的BLOSUM62矩陣值為零或負(fù)數(shù)，則相似性的配對(duì)數(shù)為0;否則相似性的配對(duì)數(shù)為1.0。相似性的原始數(shù)是序列對(duì)比的氨基酸相似性的配對(duì)數(shù)的總和。然后用較小候選序列或參比序列的氨基酸數(shù)除原始數(shù)，將原始數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。所述標(biāo)準(zhǔn)化原始數(shù)為相似性的百分率?；蛘?，為了計(jì)算同一性的百分率，將每條序列的對(duì)比氨基酸依次進(jìn)行比較。如果所述氨基酸為不相同，同一性配對(duì)數(shù)為0;否則同一性配對(duì)數(shù)為1.0。原始同一性的配對(duì)數(shù)為序列對(duì)比的相同氨基酸的總和。然后用較小候選序列或參比序列中的氨基酸數(shù)除原始數(shù)，將原始數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。所述標(biāo)準(zhǔn)化原始數(shù)為同一性的百分率。為了計(jì)算相似性和同一性的百分率，將插入和缺失忽略不計(jì)。因此，盡管在原始序列對(duì)比中使用缺口補(bǔ)償參數(shù)，但它們不用于本計(jì)算。將本文所公開(kāi)的靶蛋白表達(dá)作為具有免疫球蛋白Fc區(qū)的融合蛋白。已知每個(gè)免疫^(guò)求蛋白重鏈恒定區(qū)由4或5個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。所述結(jié)構(gòu)域依次命名如下CH!-鉸合部-CH2-CH3(-CH4)。所述重鏈結(jié)構(gòu)域的DNA序列在免疫球蛋白種類(lèi)之間存在殘余同源，例如IgG的CH2結(jié)構(gòu)域與IgA和IgD的CH2結(jié)構(gòu)域以及與IgM和IgE的CH3結(jié)構(gòu)域同源。本文所用的術(shù)語(yǔ)"免疫球蛋白Fc區(qū)"不用說(shuō)是指免疫球蛋白鏈恒定區(qū)的羧基端部分，最好是免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)或它們的一部分。例如，免疫球蛋白Fc區(qū)可以包含l)CH!結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，2)CH"吉構(gòu)域和CH2結(jié)構(gòu)域，3)CHi結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，4)CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域或5)兩個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白4交鏈區(qū)的組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在所述DNA構(gòu)成物中所用的Fc區(qū)包括至少免疫球蛋白鉸鏈區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，而最好是缺乏至少CH"吉構(gòu)域。目前衍生重鏈恒定區(qū)的優(yōu)選的免疫^(guò)求蛋白種類(lèi)為IgG(Igy)(y亞類(lèi)1、2、3或4)?？梢允褂闷渌N類(lèi)的免疫球蛋白IgA(Iga)、IgD(IgS)、IgE(Igs)和IgM(Igp)。在美國(guó)專(zhuān)利第5,541,087和5,726,044號(hào)中詳細(xì)地討論了選擇合適免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。從某些免疫球蛋白種類(lèi)和亞類(lèi)中選擇特定免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列以獲得特定的結(jié)果被認(rèn)為是在本領(lǐng)域中的技術(shù)水平內(nèi)。編碼免疫球蛋白Fc區(qū)的DNA構(gòu)成物部分最好是包括至少一部分鉸合部結(jié)構(gòu)域和最好至少一部分Fcy的CH3結(jié)構(gòu)域或在任何IgA、IgD、IgE和IgM中的同源結(jié)構(gòu)域。根據(jù)應(yīng)用情況，人們可以使用人類(lèi)以外的物種例如小鼠或大鼠的恒定區(qū)基因。用作免疫融合物DNA構(gòu)成物中的融合配偶體的Fc區(qū)一般可以來(lái)自任何物種的哺乳動(dòng)物。當(dāng)人們不希望在宿主細(xì)胞或動(dòng)物中激發(fā)抗Fc區(qū)的免疫應(yīng)答時(shí)，所述Fc區(qū)可以得自與宿主細(xì)胞或動(dòng)物的相同物種。例如，當(dāng)宿主動(dòng)物或細(xì)胞是人時(shí)，可以使用人Fc;同樣，當(dāng)宿主動(dòng)物或細(xì)胞是小鼠時(shí)，可以使用鼠Fc。此外，這些恒定區(qū)構(gòu)成物的置換或缺失也將是有作用的，其中置換或缺失所述恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。一個(gè)實(shí)例是引入在CH2區(qū)上段中的氨基酸置換以產(chǎn)生與Fc受體的親和力降低的Fc變異體(Cole等(1997)J.Immunol.159:3613)。其中本領(lǐng)域中的一般技術(shù)人員可以采用眾所周知的分子生物學(xué)技術(shù)制備這樣的構(gòu)成物。使用人Fcyl作為Fc區(qū)序列有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。例如，如果血管生成抑制劑Fc融合蛋白^C用作生物藥物，則Fqd結(jié)構(gòu)域可以對(duì)所述融合蛋白賦予效應(yīng)子功能活性。所述效應(yīng)子功能活性包括生物活性諸如補(bǔ)體活化、涉及抗體的細(xì)胞的細(xì)胞毒性、胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)和增加血清半壽期。Fc結(jié)構(gòu)域還提供通過(guò)抗-FcELISA來(lái)檢測(cè)和通過(guò)結(jié)合到金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)A蛋白("A蛋白")來(lái)純化。然而，在某些應(yīng)用情況下，最好是從Fc區(qū)消除特異性的效應(yīng)子功能，諸如Fc受體結(jié)合或補(bǔ)體活化。就血管生成抑制劑免疫融合物而論，免疫球蛋白Fc融合配偶體的一種功能是有利于血管生成抑制劑蛋白的合適折疊以產(chǎn)生活性血解度。由于該Fc融合配偶體是親水性的，所以血管生成抑制劑免疫融合物溶解性好，與例如大腸桿菌中產(chǎn)生的重組內(nèi)皮抑制素不同(O'Reilly(1997)Cell88:277)。在本文所公開(kāi)的所有實(shí)施例中，都獲得高產(chǎn)率的免疫融合物。血管生抑制劑免疫融合物通常以濃度約30-100fig/ml分泌到培養(yǎng)基中，并可通過(guò)A蛋白層析容易地純化成同質(zhì)性。另外，可以將血管生成抑制劑免疫融合物切割，然后采用常規(guī)純化方法進(jìn)一步純化，采用例如肝素瓊脂糖凝膠法、賴(lài)氨酸瓊脂糖凝膠法或親和純化法。除高水平表達(dá)外，本發(fā)明融合蛋白還顯示較長(zhǎng)的血清半壽期，推測(cè)可能是由于它們的分子大小較大。例如，在小鼠中，人Fc-人制管張素的血清半壽期為33小時(shí)，與之相比人制管張素為4-6小時(shí)(O'Reilly等(1996)NatureMedicine2:689)。相信分子量40kD的制管張素和分子量20kD的內(nèi)皮抑制素都太小以至通過(guò)腎過(guò)濾有效地清除。相比之下，F(xiàn)c-制管張素的二聚體形式和二聚體Fc-內(nèi)皮抑制素分別是145kD和100kD，因?yàn)橛袃蓚€(gè)連接于或者兩個(gè)制管張素分子或者兩個(gè)內(nèi)皮抑制素分子的兩個(gè)免疫球蛋白Fc區(qū)。這樣的二價(jià)體結(jié)構(gòu)與制管張素受體和內(nèi)皮抑制素受體的結(jié)合親和力較高。如果血管生成抑制活性是受體介導(dǎo)的，則Fc融合蛋白比單價(jià)體制管張素或單價(jià)體內(nèi)皮抑制素自身潛在性更有效地抑制腫瘤。此外，如果制管張素和/或內(nèi)皮抑制素屬于二聚體蛋白配體類(lèi)，則Fc對(duì)制管張素或內(nèi)皮抑制素產(chǎn)生的物理性限制使二聚作用成為一種分子內(nèi)過(guò)程，因此，動(dòng)態(tài)平4耔有利于二聚體并增強(qiáng)其與受體的結(jié)合。也可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)將半胱氨酸殘基導(dǎo)入到合適位置的單體上以通過(guò)共價(jià)二硫鍵形成而穩(wěn)定該二聚體。本文所用的術(shù)語(yǔ)"多價(jià)體"是指摻入兩個(gè)或多個(gè)生物學(xué)活性片段的重組分子。形成該多價(jià)體分子的蛋白片段可以通過(guò)多肽肽接頭連接，所述接頭連接組分部分而不會(huì)引起移碼并使每個(gè)分子獨(dú)立起作用。本文所用的術(shù)語(yǔ)"二價(jià)體"是指在本發(fā)明融合構(gòu)成物中含有兩個(gè)靶蛋白的多價(jià)體重組分子，例如Fc-X分子，其中X獨(dú)立地選自制管張素、內(nèi)皮抑制素或它們的變異體。由于有兩個(gè)X部分與免疫^(guò)求蛋白Fc區(qū)(通常其自身是包括至少一部分鉸鏈區(qū)和CH3結(jié)構(gòu)域，以及任選的CH2結(jié)構(gòu)域的重鏈片段的二聚體)融合，因此所述分子為二價(jià)體(參見(jiàn)，例如圖1A)。如果本發(fā)明的融合構(gòu)成物的形式為Fc-X-X，則所產(chǎn)生的Fc二聚體分子為四價(jià)體?？梢酝ㄟ^(guò)肽接頭將形成Fc-X-X分子的這兩種蛋白連接。二價(jià)體分子可以增加所述分子和其受體之間的表觀結(jié)合親和力。例如，F(xiàn)c-內(nèi)皮抑制素的一個(gè)內(nèi)皮抑制素部分可以以一定親和力結(jié)合到細(xì)胞上的受體上，同一Fc-內(nèi)皮抑制素的第二個(gè)內(nèi)皮抑制素部分可以以非常高的親和力(表觀親和力)結(jié)合到相同細(xì)胞上的第二個(gè)受體上。這是因?yàn)榈谝粋€(gè)內(nèi)皮抑制素部分結(jié)合后，第二個(gè)內(nèi)皮抑制素部分與所述受體的物理鄰近效應(yīng)所致。在抗體結(jié)合到抗原的情況下，表觀親和力增加至少104。本文所用的術(shù)語(yǔ)"多聚體"和"多聚體的"是指或者例如通過(guò)共價(jià)性相互作用(例如通過(guò)二硫鍵)共價(jià)地或者例如通過(guò)疏水性相互作用非共價(jià)地使兩條或多條多肽鏈的穩(wěn)定結(jié)合。術(shù)語(yǔ)多聚體包括同源多聚體(其中所述多肽是相同的)以及異源多聚體(其中所述多肽是不相同的)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"二聚體的"是指特異性多聚體分子，其中兩條蛋白多肽鏈通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)性相互作用的穩(wěn)定連接。應(yīng)當(dāng)理解，免疫球蛋白Fc區(qū)Fc片段自身通常為包括至少一部分鉸鏈區(qū)和CH3結(jié)構(gòu)域和任選的CH2結(jié)構(gòu)域的重鏈片段的二聚體。已知許多蛋白配體是以二聚體結(jié)合到它們的受體上。如果蛋白配體X天然地二聚體化，則在Fc-X分子中的X部分將在更大程度上二聚體化，因?yàn)槎垠w形成過(guò)程是濃度依賴(lài)性的。通過(guò)相聯(lián)的免疫球蛋白Fc區(qū)連接的兩個(gè)X部分的物理鄰近效應(yīng)將使二聚體形成成為分子內(nèi)過(guò)程，使動(dòng)態(tài)平衡有利于二聚體形成并增強(qiáng)其結(jié)合到受體上。不用說(shuō)，本發(fā)明采用常規(guī)重組DNA方法來(lái)產(chǎn)生用于實(shí)施本發(fā)明的Fc融合蛋白。所述Fc融合構(gòu)成物最好是在DNA水平上產(chǎn)生，并且將所產(chǎn)生的DNA整合到表達(dá)載體中，然后表達(dá)產(chǎn)生所述免疫融合物。本文所用的術(shù)語(yǔ)"載體"不用說(shuō)是指包含核苷酸序列的任何核酸，所述核苷酸序列可以摻入到宿主細(xì)胞中并重組及整合到所述宿主細(xì)胞基因組中或作為附加體自主復(fù)制。這樣的載體包括線(xiàn)型核酸、質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、RNA載體、病毒載體等。病毒載體非限制性實(shí)例包括反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒。本文所用的術(shù)語(yǔ)靶蛋白的"基因表達(dá)"或"表達(dá)"，不用說(shuō)是指轉(zhuǎn)錄DNA序列、翻譯mRNA轉(zhuǎn)錄物和分泌Fc融合蛋白產(chǎn)物。有用的表達(dá)載體為pdCs(Lo等(1988)ProteinEngineering11:495，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中)，其中Fc-X基因的轉(zhuǎn)錄采用人巨細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子和猿猴病毒40多腺苦酸化信號(hào)。所用的人巨細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子序列和啟動(dòng)子序列得自Boshart等，1985,Cell41:521中提供的核苷酸-601至+7序列，該文獻(xiàn)公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。所述載體也含有突變二氫葉酸還原酶基因作為選擇標(biāo)記(Simonsen和Levinson(1983)Proc.Nat.Acad.Sci.USA80:2495，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中)?？梢杂帽景l(fā)明的DNA序列將合適的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，并且用來(lái)表達(dá)和分泌靶蛋白。目前用于本發(fā)明的優(yōu)選宿主細(xì)胞包括無(wú)限增殖雜交瘤細(xì)胞、NS/0骨髓瘤細(xì)胞、293細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、海拉(Hela)細(xì)胞和COS細(xì)胞。本發(fā)明的融合蛋白最好是用常規(guī)重組DNA方法產(chǎn)生。所述融合蛋白最好是由編碼信號(hào)序列、免疫球蛋白Fc區(qū)和靶蛋白(本文也稱(chēng)為血管生成抑制劑)的DNA分子在宿主細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生。優(yōu)選的構(gòu)成物可以從5，至3，方向編碼信號(hào)序列、免疫J求蛋白Fc區(qū)和靶蛋白?；蛘撸鰳?gòu)成物可以從5，至3，方向編碼信號(hào)序列、靶蛋白和免疫i^蛋白Fc區(qū)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"信號(hào)序列"不用說(shuō)是指肽區(qū)段，所述肽區(qū)段在所述宿主細(xì)胞中引導(dǎo)分泌血管生成抑制劑免疫融合物蛋白并在翻譯后再切除。本發(fā)明的信號(hào)序列是一種多核苷酸，它編碼引發(fā)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)穿過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的氨基酸序列。用于本發(fā)明的信號(hào)序列包括抗體輕鏈信號(hào)序列例如抗體14.18(Gillies等,1989,Jour,ofImmunol.Meth.,125:191-202)、抗體重鏈信號(hào)序列例如MOPC141抗體重鏈信號(hào)序列(Sakano等，1980,Nature286:5774)和本領(lǐng)域中已知的任何其它信號(hào)序列(參見(jiàn)例如，Watson,1984,NucleicAcidsResearch12:5145)。這些參考文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。本領(lǐng)域中，信號(hào)序列的特征已經(jīng)很清楚，并且已知通常含有16-30個(gè)氨基酸殘基，以及可以含有更多或更少的氨基酸殘基。通常信號(hào)肽由三個(gè)區(qū)組成堿性N-端區(qū)、中央疏水區(qū)和更強(qiáng)極性的C-端區(qū)。中央疏水區(qū)含有4-12個(gè)疏水性殘基，在轉(zhuǎn)運(yùn)新生多肽期間，所述疏水性殘基錨定信號(hào)肽穿過(guò)膜脂層雙分子層。引發(fā)后，通常稱(chēng)為信號(hào)肽酶的細(xì)胞酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)酶切信號(hào)肽。潛在的信號(hào)肽切割位點(diǎn)一般在"(-3，-l)規(guī)則(rule)"后，因此，典型信號(hào)肽在位置-1至-3具有少量中性氨基酸殘基，并在該區(qū)域內(nèi)缺乏脯氨酸殘基。信號(hào)肽酶在-1和+1氨基酸之間酶切這樣的一種信號(hào)肽。因此，可以將編碼信號(hào)序列的DNA部分在分泌期間從所述免疫融合蛋白的氨基端切除。這導(dǎo)致分泌由Fc區(qū)和所述耙蛋白組成的免疫融合蛋白。vonHeijne(1986)NucleicAcidsRes.,14:4683對(duì)信號(hào)肽序列進(jìn)行了詳細(xì)討論，其^Hf內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，對(duì)用于本發(fā)明的特定信號(hào)序列的適應(yīng)性可能需要進(jìn)行某些常規(guī)實(shí)驗(yàn)。這種實(shí)驗(yàn)將包括確定信號(hào)序列引導(dǎo)分泌免疫融合物的能力，還要確定所用的序列的最佳構(gòu)型、基因組或cDNA以達(dá)到有效分泌免疫融合物。另外，根據(jù)vonHeijne所述規(guī)則(上述參考文獻(xiàn))，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠產(chǎn)生合成信號(hào)肽，并用常規(guī)實(shí)驗(yàn)測(cè)試這樣的合成信號(hào)序列的效能。信號(hào)序列也稱(chēng)為"信號(hào)肽"、"前導(dǎo)序列"或"前導(dǎo)肽"。所述信號(hào)序列和免疫5求蛋白Fc區(qū)的融合物本文有時(shí)稱(chēng)為分泌盒。用于實(shí)施本發(fā)明的典型分泌盒是從5，至3，方向編碼免疫球蛋輕鏈基因的信號(hào)序列和人免疫球蛋白yl基因的Fqd區(qū)的多核苷酸。免疫球蛋白Fcyl基因的Fcyl區(qū)最好是包括至少一部分鉸合結(jié)構(gòu)域和至少一部分CH3結(jié)構(gòu)域，或者至少部分鉸合結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。編碼所述分泌盒的DNA可以是其基因組構(gòu)型或其cDNA構(gòu)型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述DNA序列編碼所述分泌盒和血管生成抑制劑蛋白之間插入的蛋白酶切割位點(diǎn)。切割位點(diǎn)用于所編碼融合蛋白的蛋白酶剪切，因此從血管生成抑制劑蛋白中分離Fc結(jié)構(gòu)域。本文所用的"蛋白酶切割位點(diǎn)"不用說(shuō)是指通過(guò)蛋白酶或其它蛋白剪切劑優(yōu)先剪切的氨基酸序列。有用的蛋白酶切割位點(diǎn)包括蛋白酶諸如胰蛋白酶、纖溶酶或腸激酶K識(shí)別的氨基酸序列。現(xiàn)在已知許多切割位點(diǎn)/剪切劑對(duì)。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利第5,726,044號(hào)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。其中所述靶蛋白序列是制管張素、內(nèi)皮抑制素或其活性變異體的前體分子，通過(guò)用內(nèi)源蛋白酶諸如彈性蛋白酶或纖溶酶或尿激酶剪切產(chǎn)生所需蛋白產(chǎn)物。本發(fā)明也包括含重組制管張素和內(nèi)皮抑制素或其片段的不同組合的融合蛋白，所述融合蛋白可以大量制備。盡管在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面已證實(shí)有效，但制管張素和內(nèi)皮抑制素怎樣阻斷血管生成的機(jī)制沒(méi)有完全弄清楚。制管張素具有幾種Kringle結(jié)構(gòu)，而內(nèi)皮抑制素具有不同結(jié)構(gòu)的基序，其中每種都可以單獨(dú)引起或促使所述蛋白結(jié)合到內(nèi)皮細(xì)胞，然后發(fā)揮抗血管生成作用。因此，本發(fā)明包括制管張素的生物活性片段(諸如Kringle1、Kringle2、Kringle3及其組合物)和內(nèi)皮抑制素的生物活性片段的靶蛋白，所述生物活性片段與天然產(chǎn)生的全長(zhǎng)制管張素和內(nèi)皮抑制素生理作用相似。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供血管生成抑制劑的雙功能雜種構(gòu)成物。本文所用的雙功能雜種分子或構(gòu)成物是指通過(guò)組合兩種蛋白亞基產(chǎn)生的蛋白，其中所述兩種亞基可以得自不同的蛋白。每種蛋白亞基具有其自身獨(dú)立的功能，所以在所述雜種分子中，該兩種亞基的功能可以是相加或協(xié)同的功能。這樣功能的雜種蛋白使得可以在動(dòng)物才莫型中測(cè)試制管張素和內(nèi)皮抑制素的協(xié)同作用。優(yōu)選的雙功能雜種蛋白包含或者直接串聯(lián)或者通過(guò)多肽接頭串聯(lián)至少兩種不同的血管生成抑制劑。例如，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述靶序列編碼按讀框與至少一部分內(nèi)皮抑制素連接的至少一部分制管張素，而制管張素結(jié)構(gòu)域和內(nèi)皮抑制素結(jié)構(gòu)域均具有抗血管生成活性或血管生成抑制作用。這兩個(gè)單位均可以通過(guò)多肽接頭連接。本文所用的術(shù)語(yǔ)"多狀接頭"不用說(shuō)是指可以將兩個(gè)蛋白質(zhì)或一個(gè)蛋白質(zhì)和一個(gè)Fc區(qū)連接在一起的肽序列。所述多肽接頭最好是包含多種氨基酸諸如甘氨酸和/或絲氨酸。最好是，所述多肽接頭包括一系列長(zhǎng)度約為10-15個(gè)殘基的甘氨酸和絲氨酸的肽。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利第5,258,698號(hào)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。然而，設(shè)想可以通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)法確定所述最佳接頭的長(zhǎng)度和氨基酸組分。發(fā)現(xiàn)如果將制管張素的不同部分表達(dá)作為Fc融合分子，則獲得高水平表達(dá)，推測(cè)可能是因?yàn)镕c部分作為一種載體，幫助所述多肽在C-端正確地折疊。此外，F(xiàn)c區(qū)可以糖基化和在生理pH時(shí)高度帶電，因此Fc區(qū)可以幫助溶解疏水性蛋白。本發(fā)明也提供生產(chǎn)非人類(lèi)物種的制管張素和內(nèi)皮抑制素的Fc融合蛋白的方法。非人類(lèi)血管生成抑制劑融合蛋白對(duì)血管生成抑制劑臨床前期的研究是有作用的，因?yàn)橐环N蛋白質(zhì)藥物效能和毒性研究在對(duì)試驗(yàn)之前必須在動(dòng)物才莫型系統(tǒng)中進(jìn)行。人蛋白可能在小鼠才莫型中不產(chǎn)生作用，因?yàn)樗龅鞍卓赡苷T發(fā)免疫應(yīng)答，和/或具有不同的藥物動(dòng)力學(xué)特征，而扭曲試驗(yàn)結(jié)果。因此，等效鼠蛋白是在小鼠模型中試驗(yàn)的人蛋白最好的替代物。標(biāo)準(zhǔn)Lewis肺癌小鼠模型(O'Reilly等(1997)Cell88:277)用來(lái)比較可溶性人Fc-人制管張素、人Fc-人內(nèi)皮抑制素、鼠Fc-鼠制管張素、鼠Fc-鼠內(nèi)皮抑制素與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的所述不可溶的蛋白。在Lewis肺癌才莫型中在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面，可溶的Fc融合蛋白比用大腸桿菌產(chǎn)生的相應(yīng)蛋白更有效。此外，將實(shí)驗(yàn)小鼠近親交配，其腫瘤是誘發(fā)而不是自發(fā)產(chǎn)生。因此，在小鼠模型中的效能可能與抗人腫瘤的效能無(wú)關(guān)。采用狗的臨床前期研究將提供關(guān)于這些血管生成抑制劑對(duì)自發(fā)性腫瘤的效能更準(zhǔn)確的信息，因?yàn)橛写罅刻烊话l(fā)生的自發(fā)性狗肺瘤。生產(chǎn)本發(fā)明的鼠(mu)Fc-鼠制管張素、鼠Fc-鼠內(nèi)皮抑制素和狗(ca)Fc-狗制管張素、狗Fc-狗內(nèi)皮抑制素的方法將有利于血管生成抑制劑在鼠和狗兩個(gè)系統(tǒng)中的臨床前研究。本發(fā)明提供通過(guò)給予本發(fā)明的DNA、RNA或蛋白治療血管生成'性疾病(conditionmediatedbyangiogenesis)的方法。血管生成'l"生疾病包括，例如實(shí)體瘤；血源性腫瘤(bloodborntumors)、轉(zhuǎn)移瘤、良性瘤包括血管瘤、聽(tīng)神經(jīng)瘤、神經(jīng)纖維瘤、粒性結(jié)膜炎和膿性肉芽腫；類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；牛皮癬；眼部血管生成性疾病(糖尿病性視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、黃斑變性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼)；晶狀體后纖維組織形成、發(fā)紅(mbeosis)、遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張綜合征；心肌血管生成；斑性新血管形成；毛細(xì)管擴(kuò)張；血友病患者關(guān)節(jié)血管纖維瘤和創(chuàng)傷性肉芽；以及內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度或異常刺激、腸粘連、動(dòng)脈石更化、；更皮病性痣痕和月巴大性疤痕即痣痕疙疼。本文公開(kāi)的DNA構(gòu)成物可用于基因治療，其中將內(nèi)皮抑制素基因或制管張素基因通過(guò)各種方式之一傳遞到細(xì)胞中，例如與啟動(dòng)子連接的天然DNA或病毒載體內(nèi)的DNA。進(jìn)入細(xì)胞后，則表達(dá)制管張素基因和/或內(nèi)皮抑制素基因或基因片段，而所述蛋白在體內(nèi)產(chǎn)生以發(fā)揮其正常生物功能。本發(fā)明的DNA構(gòu)成物可高水平表達(dá)所述融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白也可用于治療血管生成性疾病，而且比天然血管生成抑制劑和其它重組血管生成抑制劑具有更好的臨床效果，因?yàn)楸景l(fā)明的血管生成抑制劑免疫融合物比所述其它重組血管生成抑制劑或單獨(dú)的天然血管生成抑制劑具有更長(zhǎng)的血清半壽期。由于所述二價(jià)體和二聚體結(jié)構(gòu)，本發(fā)明的二價(jià)體形式和二聚體形式應(yīng)具有更強(qiáng)的結(jié)合親和力。由于通過(guò)所融合的Fc區(qū)或柔性多肽接頭連接的兩種不同血管生成抑制劑可能的協(xié)同作用，本發(fā)明的雙功能雜種分子可具有更好的臨床效果?？梢詫⒈景l(fā)明的組合物通過(guò)任何合適的方式給予動(dòng)物，所述給藥為直接(例如，局部注射、植入或局部給予組織部位)或全身性(例如胃腸外或口服)給予。如果所述組合物以胃腸外提供，諸如靜脈內(nèi)、皮下、眼、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、頰、直腸、陰道、目艮框內(nèi)、腦內(nèi)、顱內(nèi)、推管內(nèi)、心室內(nèi)、鞘內(nèi)、腦池內(nèi)、嚢內(nèi)、鼻內(nèi)或通過(guò)氣霧劑給予，所述組合物最好是包含部分水或生理上可匹配的液體懸浮液或溶液。因此，所述載體(carrier)或媒介物(vehicle)為生理上可接受的以便除了傳遞所需組合物給患者之外，沒(méi)有另外負(fù)面影響患者的電解質(zhì)和/或容積平衡。用于所述制劑的液體介質(zhì)因此可以包括正常生理鹽水(例如，9.85%NaCl水溶液，0.15M,pH7-7.4)。每次給予所述免疫融合物的劑量范圍優(yōu)選為50ng/m2-lg/m2,更優(yōu)選為5pg/m2-200mg/m2，而最優(yōu)選為0.1mg/m2-50mg/m2。每次給予編碼所述免疫融合物的核酸的劑量范圍優(yōu)選為1pg/m2-100mg/m2，更優(yōu)選為20|ug/m2-10mg/m2，而最優(yōu)選為400]Lig/m2-4mg/m2。然而設(shè)想在本領(lǐng)域技術(shù)水平內(nèi)，通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)法可以很好確定給予的最佳方式和劑量。通過(guò)以下非限制的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1.人Fc-人內(nèi)皮抑制素的表達(dá)按照Lo等的學(xué)說(shuō)((l998)ProteinEngineering11:495),將人內(nèi)皮抑制素表達(dá)作為人Fc-人內(nèi)皮抑制素(huFc-huEndo)融合蛋白。Fc是指人免疫球蛋白Y的Fc片I爻(SEQIDNO:l所示為其DNA序列；SEQIDNO:2所示為其氨基酸序列)。(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR)用來(lái)連接內(nèi)皮抑制素cDNA(SEQIDNO:3;其氨基酸序列7>開(kāi)于SEQIDNO:4中)，用于表達(dá)Fc-Endo融合蛋白。正向引物或者是5，-CCCCGGGTAAACACAGCCACCGCGACTTCC(SEQIDNO:5;所編碼的氨基酸公開(kāi)于SEQIDNO:6中)或者是5，-CAAGCTTCACAGCCACCGCGACTTCC(SEQIDNO:7;所編碼的氨基酸公開(kāi)于SEQIDNO:8中)，其中Xmal位點(diǎn)或HindIII位點(diǎn)后是編碼內(nèi)皮抑制素N-端的序列。具有XmaI位點(diǎn)的引物使內(nèi)皮抑制素cDNA連接到IgGFc區(qū)CH3結(jié)構(gòu)域末端的Xmal位點(diǎn)。具有HindIII位點(diǎn)的S|物使內(nèi)皮抑制素cDNA連接到pdCs-Fc(D4K)載體的HindIII位點(diǎn)，所述載體在所述融合蛋白連接點(diǎn)含有腸激酶識(shí)別位點(diǎn)Asp4-Lys(LaVallie等(1993)J.Biol.Chem.268:23311-23317)。所述反向引物是5，-CCTCGAGCTACTTGGAGGCAGTCATG(SEQIDNO:9)，將所述引物設(shè)計(jì)置于翻譯終止密碼子(STOPcodon)(反密碼子，CTA)緊接在內(nèi)皮抑制素C-端之后，而這之后是XhoI位點(diǎn)。將所述PCR產(chǎn)物克隆并測(cè)序，并將XmaI-XhoI片段連接到XmaI和XhoI消化產(chǎn)生的pdCs-Fc載體上。同樣，將編碼內(nèi)皮抑制素的HindIII-XhoI片段連接到經(jīng)適當(dāng)消化的pdCs-huFc(D4K)載體中。通過(guò)電穿孔NS/0細(xì)胞，隨后在含有100nM氨曱蝶呤的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中選擇，獲得穩(wěn)定表達(dá)Fc-endo或Fc(D4K)-內(nèi)皮抑制素的克隆。通過(guò)抗-人FcELISA(實(shí)施例3)測(cè)定并通過(guò)SDS-PAGE證實(shí)蛋白表達(dá)水平，其顯示約52kD蛋白產(chǎn)物。通過(guò)有限稀釋將最佳生產(chǎn)克隆亞克隆。實(shí)施例2.細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染關(guān)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，通過(guò)質(zhì)粒DNA與磷酸鈣共沉淀(Sambrook等(1989)MolecularCloning-ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NY)或按照供應(yīng)商的方法通過(guò)采用脂轉(zhuǎn)染胺十(LipofectAMINEPlus)(LifeTechnologies,Ga池ersburg,MD)的脂轉(zhuǎn)染，將所述質(zhì)粒引入人腎293細(xì)胞中。為了獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，通過(guò)電穿孔將質(zhì)粒DNA引入小鼠骨髓瘤NS/0細(xì)胞中。將NS/0細(xì)胞生長(zhǎng)于用10%胎牛血清補(bǔ)充的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基中。將約5x106細(xì)胞用PBS洗滌一次，并再次懸浮于0.5mlPBS中。然后將10昭線(xiàn)狀化質(zhì)粒DNA與所述細(xì)胞一起在水上的基因脈沖發(fā)生器容器(GenePulserCuvette)(0.4cm電極缺口(electrodegap)BioRad,Hercules,CA)中溫育10分鐘。采用設(shè)定0.25V和500|iF的基因脈沖發(fā)生器(GenePulser)(BioRad,Hercules,CA)進(jìn)行電穿孔。將它們重新懸浮于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中之后，使細(xì)胞在水上恢復(fù)10分鐘，然后平板接種到兩個(gè)96孔板上。通過(guò)生長(zhǎng)在100nM氨甲蝶呤(MTX)中選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，MTX在轉(zhuǎn)染后2天加入。給所述細(xì)胞每3天更換培養(yǎng)基1次，連續(xù)3次以上，然后在2-3周出現(xiàn)MTX-抗性克隆。通過(guò)抗-FcELISA測(cè)定克隆上清液，以鑒定出高生產(chǎn)克隆。分離高生產(chǎn)克隆，然后在含100nMMTX生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。實(shí)施例3.ELISA方法三種不同的ELISA用來(lái)測(cè)定MTX-抗性克隆上清液和其它試驗(yàn)樣品中的蛋白產(chǎn)物濃度?？?人Fc(huFc)ELISA用來(lái)測(cè)量含人Fc蛋白的量?？?鼠Fc(muFc)抗體和抗-狗Fc(caFc)抗體用于ELISA以分別測(cè)量含鼠-Fc蛋白和含狗-Fc蛋白的量。以下詳細(xì)描述用于抗-人FcELISA的方法。A.包被板用96孑L才反(Nunc誦ImmunoplateMaxiSorp,NalgeNuncInternational,Rochester,NY)，以5(ig/mlAffmiPure山羊抗國(guó)人IgG(H+L)(JacksonImmunoResearchLaboratories,WestGrove,PA)的PBS按100pl/孔包被ELISA板。覆蓋包被板，并于4。C溫育過(guò)夜。然后將板用含0.05%吐溫20的PBS洗滌4次，然后用含1%BSA/l。/。山羊血清的PBS封閉(200jil/孔)。與封閉緩沖液一起于37。C溫育2小時(shí)后，所述板用含0.05%吐溫的PBS洗滌4次，然后將所述板在紙毛巾上吸干。B.與試驗(yàn)樣品和第二抗體一起溫育用樣品緩沖液將試驗(yàn)樣品稀釋到合適濃度，樣品緩沖液為含1%BSA/P/。山羊血清/0.05。/c)吐溫的PBS。用其濃度已知的嵌合抗體(含人Fc)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。為了制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，用所述樣品緩沖液進(jìn)行系列稀釋以得到范圍為125ng/ml-3.9ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將所述稀釋樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品加到所述板(100pl/孔)中，然后將所述板于37。C溫育2小時(shí)。在溫育后，將所述板用含0.05%吐溫的PBS洗滌8次。然后向每個(gè)孔加入100nl第二抗體、結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的抗-人IgG(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.WestGrove,PA)，用樣品緩沖液稀釋約120,000倍。必須對(duì)每批結(jié)合HRP的抗-人IgG測(cè)定第二抗體的準(zhǔn)確稀釋度。于37。C溫育2小時(shí)后。將所述板用含0.05。/。吐溫的PBS洗滌8次。C.顯色將30mg(1片)鄰苯二胺二氫氯化物(OPD)溶解到15ml含新鮮加入的0.03%H202的0.025M檸檬酸/0.05MNa2HP04緩沖液，pH5中，制備底物溶液。將所述底物溶液以100ili1/孔加到所述板中。于室溫在黑暗中使所述板顯色反應(yīng)30分鐘。所述顯色反應(yīng)的時(shí)間可以根據(jù)所述包#皮板的批間差異、第二抗體等而改變。加入4NH2S04(100jal/孔)終止所述反應(yīng)。用均設(shè)定為490nm和650nm的板讀出器讀出所述板，并編程以使490nmOD減去背景650nmOD。用于抗-muFcELISA的方法相似，只是將ELISA板用PBS中0.5|ug/mlAffiniPure山羊#元國(guó)鼠IgG(H+L)(JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA)以100(il/孔進(jìn)行包被；而第二抗體為結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶的山羊抗-muIgG(Fc力(JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA),以1:5000稀釋倍數(shù)使用。對(duì)于抗-caFcELISA，ELISA板同樣用PBS中的5|ug/mlAffiniPure兔抗-狗IgG(Fc片段特異性)(JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA)以100(al/孔進(jìn)行包一皮；而第二抗體為結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶的AffiniPure兔抗-狗IgG(Fc片段特異性)(JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA),以1:5000稀釋倍數(shù)使用。實(shí)施例4.人Fc-人制管張素的表達(dá)基本上按實(shí)施1所述將人制管張素(DNA序列見(jiàn)SEQIDNO:10;氨基酸序列見(jiàn)SEQIDNO:ll)表達(dá)為人Fc-人制管張素(huFc-huAngio)融合蛋白。PCR用來(lái)連接制管張素cDNA(SEQIDNO:3),以用pdCs-huFc或pdCs-huFc(D4K)載體表達(dá)。相應(yīng)的正向引物為5，-CCCCG氨基酸見(jiàn)SEQIDNO:13)和5，-CCCCAAGCTTAAAGTGTATCTCTCAGAG(SEQIDNO:14;所編碼的氨基酸見(jiàn)SEQIDNO:15),其中Xmal位點(diǎn)或HindIII位點(diǎn)之后為編碼制管張素N-端的序列。反向引物是5，-CCCCTCGAGCTACGCTTCTGTTCCTGAGCA(SEQIDNO:16)，設(shè)計(jì)所述引物使翻譯終止密碼子(STOPcodon)(反密碼子，CTA)緊接在制管張素C-端之后，而再后是Xhol位點(diǎn)。將所述PCR產(chǎn)物克隆并測(cè)序，然后將所產(chǎn)生的編碼制管張素的Xmal-Xhol片段和HindIII-XhoI片段分別連接到pdCs-huFc和pdCs-huFc(D4K)載體上。按實(shí)施例2和3所述，選擇并測(cè)定穩(wěn)定表達(dá)huFc-huAngio和huFc(D4K)-huAngio的NS/0克隆。實(shí)施例5.鼠Fc-鼠-內(nèi)皮抑制素的表達(dá)基本上按實(shí)施1所述將鼠內(nèi)皮抑制素(DNA序列見(jiàn)SEQIDNO:17;氨基酸序列見(jiàn)SEQIDNO:18)和鼠Fc(DNA序列見(jiàn)SEQIDNO:19;所編碼的氨基酸見(jiàn)SEQIDNO:20)表達(dá)為鼠Fc-鼠內(nèi)皮抑制素(muFc-muEndo)融合蛋白。PCR用來(lái)連接內(nèi)皮抑制素cDNA(SEQIDNO:4)，以用pdCs-muFc(D4K)載體表達(dá)。正向引物為5，-CCCCAAG酸見(jiàn)SEQIDNO:22)，其中HindIII位點(diǎn)之后為編碼內(nèi)皮抑制素N-端的序列。反向引物為5，-CCCCTCGAGCTATTTGGAGAAAGAGGTC(SEQIDNO:23),設(shè)計(jì)所述引物使翻譯終止密碼子(STOPcodon)(反密碼子，CTA)緊接在內(nèi)皮抑制素C-端之后，而這之后是Xhol位點(diǎn)。將所述PCR產(chǎn)物克隆并測(cè)序，然后將所產(chǎn)生的編碼內(nèi)皮抑制素的HindIII-XhoI片段連接到pdCs-muFc(D4K)載體上。如實(shí)施例2和3中所述，選擇并測(cè)定(抗-muFcELISA)穩(wěn)定表達(dá)muFc(D4K)-muEndo的NS/0克隆。實(shí)施例6.鼠Fc-鼠制管張素的表達(dá)基本上按實(shí)施例所述將鼠制管張素(DNA序列見(jiàn)SEQIDNO:24;氨基酸序列見(jiàn)SEQIDNO:25)表達(dá)為鼠Fc-鼠制管張素(muFc-muAngio)融合蛋白。PCR用來(lái)連接所述制管張素cDNA(SEQIDNO:6)，以便以pdCs-Fc(D4K)載體表達(dá)。正向引物為5，-CCCCAAGCTTGTGTATCTGTCAGAATGTAAGCCCTCCTGTCTCTGAGCA(SEQIDNO:26;所編碼的氨基酸見(jiàn)SEQIDNO:27),其中HindIII位點(diǎn)之后為編碼制管張素N-端的序列。反向引物是5，-CCCCTCGAGCTACCCTCCTGTCTCTGAGCA(SEQIDNO:28),設(shè)計(jì)所述引物使翻譯終止密碼子(STOPcodon)(反密碼子，CTA)緊接在制管張素C-端之后，而這之后是XhoI位點(diǎn)(CTCGAG)。將所述PCR產(chǎn)物克隆并測(cè)序，然后將編碼制管張素的HindIII-XhoI片段連接到pdCs-muFc(D4K)載體上。如實(shí)施例2和3所述，選擇并測(cè)定(抗-muFcELISA)穩(wěn)定表達(dá)muFc(D4K)-muAngio的NS/0克隆。實(shí)施例7.狗FckaFc)的表達(dá)將從狗血中分離的狗外周血單核細(xì)胞(PBMC)用來(lái)制備mRNA。用逆轉(zhuǎn)錄酶和寡聚物(dT)合成第一條cDNA鏈后，釆用正向引物5，-CC碼的氨基酸見(jiàn)SEQIDNO:30)，其中緊靠編碼狗Fc鉸鏈區(qū)序列的上游導(dǎo)入AflII位點(diǎn)；以及反向引物5，-CCTCGAGTCATTTACCCGGGGAATGGGAGAGGGATTTCTG(SEQIDNO:31),其中在狗Fc翻譯終止密碼子(STOPcodon)(反密碼子，TCA)之后導(dǎo)入Xhol位點(diǎn)，進(jìn)行PCR以擴(kuò)增狗Fc(Kazuhiko等，(1992)JP1992040894-A1)。所述反向引物還導(dǎo)入沉默突變以產(chǎn)生Xmal限制酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)有利于通過(guò)接頭-連接物構(gòu)建pdCs-caFc(D4K)載體，然后連接到編碼狗內(nèi)皮抑制素或制管張素的DNA構(gòu)成物上。用同才羊的方法構(gòu)建pdCs-huFc,Lo等(Lo等，ProteinEngineering(1998)11:495)對(duì)其進(jìn)行了詳細(xì)地論述，如下構(gòu)建pdCs-huFc的表達(dá)載體。將編碼狗Fc的AflII-XhoI片段連接到編碼所述輕鏈信號(hào)肽的XbaI-AflII片段以及XbaI-XhoI消化的pdCs載體。所產(chǎn)生的pdCs-caFc表達(dá)載體然后用來(lái)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后約3天，通過(guò)A蛋白層析純化所述上清液。采用結(jié)合過(guò)氧化物酶的兔抗-狗IgG(Fc片段特異性)(JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA)，在SDS-PAGE后再通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析，確定狗Fc(DNA序列見(jiàn)SEQIDNO:32;氨基酸序列見(jiàn)SEQIDNO:33)的表達(dá)。實(shí)施例8.狗Fc-狗內(nèi)皮抑制素的表達(dá)基本按實(shí)施例5所述將狗內(nèi)皮抑制素的編碼序列(DNA序列見(jiàn)SEQIDNO:34;^J^酸序列見(jiàn)SEQIDNO:35)連接到HindIII-XhoI片段上以表達(dá)Fc融合蛋白。在3，端，引入終止密碼子(STOPcodon),例如通過(guò)PCR緊接在編碼C-末端賴(lài)氨酸殘基的密碼子之后引入終止密碼子，而這之后是NotI限制酶切位點(diǎn)。然而在5'端，有一個(gè)DraIII限制酶切位點(diǎn)便于重組?；瘜W(xué)合成一個(gè)HindIII粘端和一個(gè)DraIII粘端組成的寡核苷酸雙鏈體，然后用來(lái)連接編碼其余的狗內(nèi)皮抑制素cDNA的DraIII-XhoI限制性片段。所用的雙鏈體如下所示HindIII5，-AGTGTGGGTCGTCCTGA八GGTCGGCCACGACGTG-5'(SEQ1DNO:38)DraIII在所述雙鏈體中第一個(gè)CAC編碼狗內(nèi)皮抑制素N-端組氨酸殘基。因此編碼狗全長(zhǎng)內(nèi)皮抑制素的Hindlll-Xhol片段可連接到Hindlll-Xhol消化的pdCs-caFc載體(參見(jiàn)實(shí)施例7)用于表達(dá)。如實(shí)施例2和3中所述，選擇并通過(guò)抗-caFcELISA測(cè)定穩(wěn)定表達(dá)caFc-caEndo的NS/0克隆。在SDS-PAGE上分析并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析確定所述蛋白產(chǎn)物。實(shí)施例9.狗Fc-狗制管張素的表達(dá)基本上按以上實(shí)施例所述，連接編碼狗全長(zhǎng)制管張素的cDNA(DNA序列見(jiàn)SEQIDNO:39;氨基酸序列見(jiàn)SEQIDNO:40)以表達(dá)caFc融合蛋白。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在3，端引入終止密碼子(STOPcodon),例如通過(guò)PCR緊接在編碼C-端賴(lài)氨酸殘基的密碼子之后引入終止密碼子，而這之后是NotI限制酶切位點(diǎn)而不是XhoI位點(diǎn)。因?yàn)樵诠分乒軓埶氐腸DNA中有一個(gè)內(nèi)部Xhol限制酶切位點(diǎn)。在5'端，緊接在制管張素N-端的上游按讀框引入HindIII位點(diǎn)。然后將編碼狗全長(zhǎng)制管張素的Hindin-Notl片段連接到HindIII-NotI消化的pdCs-caFc載體(其和3中所述，選擇并通過(guò)抗-caFcELISA測(cè)定穩(wěn)定表達(dá)caFc-caAngio的NS/0克隆。在SDS-PAGE上分析并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析確定所述蛋白產(chǎn)物。實(shí)施例10.鼠制管張素的鼠Fc-Kl的表達(dá)制管張素包含纖溶酶原的5個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域中的前4個(gè)。為了測(cè)定是否任何一個(gè)或幾個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域決定所觀察到的制管張素的抗-血管生成活性，則可產(chǎn)生單個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域或其組合物用于測(cè)試。為了證實(shí)Fc作為融合蛋白配偶體的作用，鼠制管張素的第一個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域(K1)的表達(dá)用以下方式實(shí)現(xiàn)。第一個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域終止于鼠制管張素的Glu-87處(SEQIDNO:25)。在該位置的cDNA中有一個(gè)合適的NsiI限制酶切位點(diǎn)，以便NsiI消化后，將第4個(gè)堿基3，-突出端通過(guò)T4聚合酶去除以產(chǎn)生一個(gè)平端。將翻譯終止密碼子通過(guò)連接到回文接頭TGACTCGAGTCA(SEQIDNO:41)引入緊接在編碼Glu-87的GAA下游，其中所述終止密碼子TGA之后是XhoI位點(diǎn)。然后將編碼該截短制管張素的HindIII-XhoI片段即只是第一個(gè)Kringle，連接到pdCs-muFc(D4K)載體中用于表達(dá)。按抗-muFcELISA和SDS-PAGE分析，在瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)中均獲得高水平表達(dá)。實(shí)施例11.鼠制管張素的鼠Fc-innerKl的表達(dá)Kringle結(jié)構(gòu)域由多個(gè)環(huán)組成，包括外環(huán)和內(nèi)環(huán)。在鼠制管張素的第一個(gè)Kringle中，所述內(nèi)環(huán)明確為Cys55和Cys79,它們?cè)谒霏h(huán)的堿基處一起形成一個(gè)二硫鍵。內(nèi)環(huán)Cys-67與外環(huán)的一個(gè)Cys殘基形成另一個(gè)二硫鍵以產(chǎn)生所述Kringle結(jié)構(gòu)。為了測(cè)試內(nèi)環(huán)是否具有抗-血管生成活性，將它如下表達(dá)為muFc-innerKl(Kringle1)。用編碼第一個(gè)Kringle的DNA片段作模板，具有序列5，GGGCCTTGGAGCTACACTACA(SEQIDNO:42;所編石馬的氨基酸見(jiàn)SEQIDNO:43)的誘變引物用來(lái)通過(guò)PCR使TGC(Cys-67)誘變?yōu)锳GC(Ser)。如果將Kringle1的內(nèi)環(huán)表達(dá)但不表達(dá)其外環(huán)，則這保證Cys-67不形成二硫鍵。具有序列5'GCGGATCCAAGCTTAGTACACATCCCAATGAGGG(SEQIDNO:44;所編石馬的氨基酸見(jiàn)SEQIDNO:45)的上游引物用來(lái)緊接5，Ser-43(AGT)的密碼子按讀框引入HindIII位點(diǎn)。將一個(gè)BamHI位點(diǎn)也引入緊接在HindIII位點(diǎn)的上游。所述BamHI位點(diǎn)用于連接以下實(shí)施例12所示柔性Gly-Ser接頭末端處的BamHI位點(diǎn)。因此，通過(guò)鼠制管張素Glu-87將編碼Ser-43的Hindlll-XholDNA片段連接于pdCs-muFc(D4K)載體用于表達(dá)。用抗-muFcELISA和SDS-PAGE分析，在瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)中均獲得高水平表達(dá)muFc國(guó)innerKl。實(shí)施例12.鼠制管張素的鼠Fc-鼠Endo-GlySer接頭-innerKl的表達(dá)雜種分子鼠Fc-鼠Endo-innerKl包含通過(guò)含甘氨酸和絲氨酸殘基的一個(gè)多肽接頭連接到鼠制管張素第一個(gè)Kringle內(nèi)環(huán)的鼠Fc-鼠Endo。如下裝配所述DNA構(gòu)成物。在鼠內(nèi)皮抑制素cDNA的3，末端有一個(gè)BspHI位點(diǎn)。為了在鼠內(nèi)皮抑制素的C-端引入一個(gè)甘氨酸和絲氨酸殘的柔性接頭，將編碼內(nèi)皮抑制素的540-bpHindIII-BspHI片l殳連才妾到SEQIDNO:46和SEQIDNO:48中公開(kāi)的寡核苷酸形成的重疊寡核苷酸雙鏈體。SEQIDNO:46編碼的氨基酸接頭見(jiàn)SEQIDNO:47。將編碼鼠內(nèi)皮抑制素和Gly-Ser接頭HindIII-BamHI的片段亞克隆到標(biāo)準(zhǔn)克隆載體中。然后將BamHI位點(diǎn)用來(lái)引入編碼實(shí)施例11中的innerKl的BamHI-XhoI片段。將所產(chǎn)生的編碼muEndo-GlySer接頭-innerKl的Hindlll-Xhol片段連接到pdCs-muFc(D4K)載體用于表達(dá)。以抗-muFcELISA和SDS-PAGE分析，在瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)中均獲得高水平表達(dá)muFc-muEndo-GlySer接頭-innerKl。實(shí)施例13.鼠制管張素的鼠Fc-鼠Endo-GlySer接頭-Kl的表達(dá)雜種分子鼠Fc-鼠Endo-Kl包含通過(guò)含甘氨酸和絲酸殘基的多肽接頭連接到鼠制管張素的第一個(gè)Kringle的鼠Fc-鼠Endo。將所述DNA構(gòu)成物如下裝配。將編碼鼠Endo-GlySer接頭的HindIII-BamHI片段的BamHI末端(實(shí)施例12)通過(guò)以下連接物連接到編碼鼠制管張素Kringle1的Hindlll-Xhol片段(實(shí)施例10)。BamHI5，GATCCTCAGGCC(SEQIDNO:49)GAGTCCGGTCGA(SEQIDNO:50)HindIII所述連接物具有一個(gè)HindIII的粘端，連接時(shí)不需要再產(chǎn)生HindIII位點(diǎn)。因此，將所產(chǎn)生的編碼muEndo-GlySer接頭-Kringle1的Hindlll-Xhol片段連接到pdCs-muFc(D4K)載體用于表達(dá)。用抗-muFcELISA和SDS-PAGE分析，在瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)中均獲得高水平表達(dá)muFc-muEndo-GlySer接頭-Kl。實(shí)施例14.鼠Fc-鼠Endo-GlySer接頭-鼠制管張素的表達(dá)雜種分子鼠Fc-鼠Endo-GlySer接頭-鼠制管張素包含通過(guò)含甘氨酸和絲酸殘基的多肽接頭連接到鼠制管張素的鼠Fc-鼠Endo。將所述DNA構(gòu)成物基本上如下裝配。將編碼鼠Endo-GlySer接頭的Hindin-BamHI片段BamHI末端(實(shí)施例12)通過(guò)實(shí)施例13中所述連接物連接到編碼鼠制管張素的Hindlll-Xhol片段。將所產(chǎn)生的編碼鼠Endo-GlySer接頭-鼠制管張素的Hindlll-Xhol片段連接到pdCs-muFc(D4K)載體用于表達(dá)。用抗-muFcELISA和SDS-PAGE分析，在瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)中均獲得高水平表達(dá)鼠Fc-鼠Endo-GlySer接頭-鼠制管張素。實(shí)施例15.人制管張素-人Fc-人Endo的表達(dá)雜種分子人制管張素-人Fc-人Endo包含通過(guò)肽鍵連接到人Fc二人Endo的人制管張素。將所述DNA構(gòu)成物如下裝配。首先通過(guò)PCR產(chǎn)生編碼人制管張素但無(wú)終止密碼子的HindIII-XhoI片段，以使制管張素的最后氨基酸殘基的密碼子緊接著是XhoI位點(diǎn)的CTCGAG。通過(guò)以下AflII-Hindin連接物，將5，末端的HindIII連接到輕鏈信號(hào)肽的Xbal-Affll片段(Lo等，ProteinEngineering(1998)11:495):在連接時(shí)，上述連接物的HindIII粘端不再產(chǎn)生HindIII位點(diǎn)。在3，末端，通過(guò)以下XhoI，-AfIII連接物，將Xhol位點(diǎn)連接到編碼人Fc-人-Endo的AflII-XhoI片段的AfIII位點(diǎn)在連接時(shí)，上述連接物的XhoI粘端不再產(chǎn)生XhoI位點(diǎn)。所產(chǎn)生的編碼信號(hào)肽-人制管張素-人Fc-人內(nèi)皮抑制素的Xbal-Xhol片段克隆到pdCs載體上用于表達(dá)。用抗-muFcELISA和SDS-PAGE分析，在瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)中均獲得高水平表達(dá)。實(shí)施例16.藥物代謝動(dòng)力學(xué)在一組藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究中，將移植100-200mm3Lewis肺腫瘤的C57/BL6小鼠，每只鼠注射720嗎人Fc-人制管張素到其尾靜脈中。根據(jù)O'Reilly所描述的實(shí)際治療方案(O，Reilly(1996)NatureMedicine2:689),選擇在該研究中使用的腫瘤大小和人Fc-人制管張素的劑量。在注射后1/2、1、2、4、8、24和48小時(shí)從眼眶后采取血樣。在抗-人FcELISA后再用蛋白質(zhì)印跡分析分析所述血樣。發(fā)現(xiàn)人Fc-人制管張素的循環(huán)半壽期在小鼠中約為32小時(shí)，而蛋白質(zhì)印跡分析顯示高于90。/q的人-Fc-人制管張素以完整的分子保持循環(huán)。還以200iag/小鼠的劑量在無(wú)腫瘤的Swiss小鼠中重復(fù)所述藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。在這種情況下，發(fā)現(xiàn)人Fc-人制管張素的循環(huán)半壽期約為33小時(shí)。等同實(shí)施方案本發(fā)明可以體現(xiàn)為其它具體的但不偏離其精神或基本特征的形式。因此認(rèn)為前述實(shí)施方案是在所有方面說(shuō)明而不是限制本文所描述的發(fā)明。因此本發(fā)明的范圍由附屬的權(quán)利要求書(shū)限定而不是由以上所述限定，因此本發(fā)明包括在權(quán)利要求書(shū)等同目的和范圍內(nèi)的所有修改。序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>LeuPtoAJLaProI"GluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGinPro115120125cgagaaccacaggtgtacaccctgcccccsteaegggaggagatgaec432ArgGluProGinValTyrThrLeuProProSerArgGlu<51uMetThr130135"0aagaacc的gtcagectgacctgcctggtcaaaggcttctatcccage430LysAsnGinValSerLe。ThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSer145150155160gacategecgtggagtgggagageaatgggcagccggagaacssctac528AspJ丄eAiaValGluTrpGluSerA幼GlyGinProGluAsnAsnTyr165.170175aagaccacgcctcccgtgctggactecgac的ctecttcttcetctat5"6LysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrISO185190ageaagcteaccgtggacSsi:LysThrValAspteatgertecgtgatgcatSerCysSerValMetHisageetctecctgtecccgSetLeuSerI^uSerPro22S230a這gageaggtggcagcagLysSerArgTrpGinGin200gaggetctgcacaaccacGluAlaLeuHisAsnHisggtaaaGlyLysgggaacgtcttc624GlyAsnvalPhe205tacacgcagaag672TyrThrGinLys6%<212>PRT<213>人<400〉2GluProSsrAsp5XiysTharHis10ProProPro15AlaProGluLeuLeu20GlyProSerVal25ProPro30ProLysAspThr35MetlieSerArgThrProGluVal40Thr45CysValValValAsp50ValKisG丄UA鄰ProGiu5560AsnTrpTyrAspGly65ValGl。valHis70AsnAlaLysThrLysProGl\iGluGinSOTyrAsnSerThrTyr85ValValSerValLeuHisGinAspTrpLeuAsn100GlyLysGluTyrLys105Cys丄ysAsn110LeuProA"GluPro130LysAsnGinA^plisAlaLysThtThrProlie(UuThrlieSerI*ysAlaLys120125GinValTyrThrl*euProProSerArg以u(píng)135140ValSerLeuThr,CysLeuValLysC3iyPhei50155ValGluTrpGluSerAsnGlyGinProGlu165170ProProValLeuAspSerAspGlySerPhe1801&5SerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGinGinGly195200205SerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyr210215220SerX/euSerLeuSerProGlyLys225230<31yGinProGluMetThi:tyrProSerAsnAsnTyr175PheLeuTyr190AsnValPheThrGinLys<210〉3<212>DNA<213>人<220><221>CDScm〉(11.(54&)<"3>內(nèi)皮抑制素"00>3cacagecaccgcgacttccagccggtgetc6accfcggttgcgetcaac48HisSerHisAi:gAspPheGinProValLeuHisLeuVaiAlsLeuAsn151015agecccctgtea的cggcatgeggggcateegc的ggecgacttccag96SerProLeuSerGlyGlyMetArgGlylieArgGlyAiaAspPheGin202530tgcttccagcaggcgegggeegtggggctggcgggcaccttccgcgec1"CysPheGinGinAlaArgALavalGlyLeuAlaGlyThrPheArgAla354045ttcctgtectegcgcctgcaggacctgtacrageategtgcgcegtgec192Phsl^uSerSerArgLeuGinAspI^uTyrSetrlieVaiArgArgAlaSO5560gaccgcgcagecgtggteaacetcaaggacgagctgctgttt240AspArgA工aAlaValProlieValAsnLeuLysAspLeuPhe65"O"30cccagetgg《aggetctgttcteaggctctgagggtccgctgaagccc28SProSerTrDGUiAlaLeuPheSerGlySerGluGlyProI^uLysPro"659095柳GlyAlaArg100咖tectttg為CPheAspgacgtcctgAspValX*eu剛110HisPro336tggTrpcccPro115Gin站gagegtgtgg$erValTrpteggaccccS&rAspPro125gggcgc<rtgLeu130gagageSectgt135柳GluThrt的TrpeggscggagArgThrGlu140getAlaccctegSergccAlaGlyGintec150tegctgLeuLe。.哪ggc.aggetcGlyArgl^u15SctgLeug卯GlycsgGinISO480Sei:gecAla柳AlaageSertgcCys165catHisC3CHisgecAlatacTyratxgtgetctgc工:UValLeuCys170attgag175ascagettcMetactThr180gecAlat:cc<210>4<213>人<400>4HisSerHisAspPheGinVal10flisValAlaISAsnSetProLeuSec20GlyGiyMetArgGly25工leArgGlyAlaAsp30PheGlnCysPhsGin35GinJUaArgAla40LeuAlaGlyThr45PheArgAlaPhelieu50Sei:SerArgLeuSerUsVal60AlaAsp65AlaAlaPro70lieVall>eul>ysAspGlu75l*eu80ProTrpAla85LeuSecGlySerGluGlyPro90Leu95ProGlyAlalie100SerPheAspGlyLysAspValLeuArg110HisProThrProGlul*ysS6rV"Trp120HisGiySerAspPro125AsnGlyArglf的SerTyrCysTlu:TrpArgThrGluAlaProSer130135"0AlaThrGlyGinMaSerS抑I^uLeuGlyGIyArgIouLeuGlyGin145150155160SerAiaAlaSerCysHisHisAlaTyrlieValLeuCyslieGlviAsn1SS1701，5SerPheMetThrMaSetLys180<2il>30<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人FoEndo的正向引物<220><221>CDS<222>3),(29)<400>5ccccgggtaaacacsgccaccgcgacttcc30Pro6iyLysHisSerHisArgAsp叱e15<210>6<213>人工序列ProGlyLysHisSerHisArgAspPhei5<210>7<213>人工序列<223>人工序列的栻迷人FoEnclo的正向5l物<221>CDS<222>O,,(2S)<柳:>7csagectcacageI>ysLeuHisSeresccgegacttccHisArgAsp卯e<211:>8<212>PRT<213>人工序列<400>8IeuHisSerHisArgA$pPhe15<211>2S<212>D肌<213>AJ:序列<220><223>人工序列的描迷人FC"eiuio的反向引物cctcgagctacttggaggcagtcatg26<210><212><213>10D諷人<220><221><222><223〉CDS(1)(1089)制管張素<400>10asagtgtatc，cteagagtgcaaga_ct々ggaat卯a(chǎn)aagaactacaga48L也uSerGluCysLysThrGlyAsn(UyLysAsnTyrArg51015gggscgatgtecsaaacaaaaaatggcateacctgtcaaesatggagtGiyThrMetSerl*ysThrI*ysAsnGlylieThrCysGinLysTrpSer20253096tecSetsettctSer35cccProCSCcctPro&gattcteaArgPheSear40cctgetacacacProAlaThrHis45ccctC3ProSet1"gagggactggagtactgcaggsatccagacaacgatcagGiuGlyl*euGluGluAsnTyrCysArgAsnProAspAsnAspProGin505560192gggccctggtgctatactactgatsaaaagagatatgaetactgcGlyProTrpCysTyrThrThrAspProGluLysArgTyrAspTyrCys65"07530240g3CAsp3ttliegaggaaGlutgtatgcatagtggagasaac288CysMstHisCysSerGlyGlu9095tatgacggcaaeatttecaagaceatgtct的actggaatgcc改ggecTyrAspGlyLyslieSerLysThrMetSerGlyLeuGluCysGinAla336100105U0tgggactctcagageccacacgetcatggatacatt<rcttec"AtttTrpAspSerGinSerProflisAlaHisGiyTyrlisProS時(shí)LysPhe115120125384ccaaacaagaacctgaagaagaattactgtcgtaaccccgatsgggagProAsnLysAsnL的LysLysAsnTyrCysArgAsrxProAspArgGlu130135140432ctgeggecttggtgtI>euArgProTrpCys145ttcaccaccgaccccaacaagcgctgggaacttPheThrThrAspProAsnJLysTrpCUu150155480tgcgacateccdcgctgcacaacacctccaccatcttctggtcccaccCysAsplieProArgCysThrThr*ProProProSerSerGiyProThr"51701*75528taccagtgtctgaagggasc吝ggtgaaaactatcgcgggaatgtggetTyrGinCysLeuLysGiyThrGiyGluAsnTyrArgGiyAsnValAlai801851905*6gttaccgtttecg的ValThrValSerGiyi95cacacctgteagcactggagtgcacagacecctHisThrCysGinHisTrpSerAlaGinThrPro200205624caeacacataacaggHisThrHisAsnArg210acaceagaaaacttcccctgcaaaaatttggatThrProGluAsnPheProCysLysAsnLeuAsp215220672gaaaactactgccgcaatcctgacggaaaaagggecccatggtgccatGluAsnTyrCysArgAsnProAspGiyLysArgAlaProTrpCysHis225230"52"720acaacc在acagecaagtgeggtgggagtactgtsagataccgtectgtThrThrAsnSerGinValArgTrpGJLuTyrCysLyslieProSerCys2452S0255768gactectecccagtaAspSetserProVaL260tecacggaacaattggetcccacagcaccscctSerThrGluGinLeuAlaProThrAlaProPro2S5"0816gagetaacccctgtggtccsggactgctaccatggtgatggacagageGluThrProValValGinAspCysTyrHisGiyAspGiyGinSer2752802858"tsccgaggcacatecTyffirgGiyTharSer290tecaccacc:aecacaggaaagaagtgtcagtctSerThrThrThrThrGiyLysLysCysGinSer295300912tggteatctatgac&ccacacc的caccagaagaccccagaaaactacTrpSetSerMetThrProaisArgHisGinLysThePro<UuAsnTyr305310"5320ceaaatgetggectgacaatgaactactgcaggaatccagatgecgatProAsnAlaGiyLeuThrMetAsiiTyrCysArgAsnProAspAlaAsp32S330335aaaggcccctggtgtt;ttaccacagaceccagegtcaggtgggagtac柳10081056<formula>formulaseeoriginaldocumentpage42</formula>ThrThrAsnSerGinVaiArgTrpGlu245CysJLysProSerCys255AspSerSerProValSer260Thr(JluGloLeuAla270ProProGluLieuThrProValVal275GinAspCysHisGlyGlyGinSerTyrArg290GiyThrSerSerThrThrThr235ThrGlyLysLysCysGloTrp305SerSerMetThrPro310HisArgHisGinIiy-Thr315ProGlu320AlaGlyLeuThr325MetAsnTyrCys330ProAsp幼o(hù)>《nAspGiyProTrpCysPhe340ThrThrAspMSProSerVaJlArgTrp350AsnLeuLysI*ysCysSerGlyThrGluAla3553S0<210>12<211>29<2i2>Dim<213>人工序列<223:>人工序列的描述人Fc-Anglo的正向51物<221>CDS<222>(3)-，《29)<400>12ccccgggtaagaaagtgtatetcteagag29ProGlyLysLysValTyi:sex:Glu15<210>13<2i2>PRT<213>A^序列ProGlyLysLysValTyrLeuSerGlu<210>14<211>28《212>加A<213>人工序列<223>人工序列的描迷人FoAftgiu的正向引物<220><221>CDS(28)"00>Pro14ctt:assgtgtatetcteagagLeuLysValTyrSerG丄u23<211;>15<213>人工序列<備〉15ProLysL的LysValTyrLeuSerGiu15<213>30人工序列<220><223>人工序列的描述人Fc-Awiu的反向引物cccctcgagct"gct:tc;tgttcctgages30<212><213>552小家鼠<220><221><223>CDS內(nèi)皮抑制素<400>"catactcatcaggacHisThrJUsGinAspThrProctgtct:LeuSerGly20tttcagexsagtgetccacctggtggcactgaac48PheGinProValLeuHisLeuValAlaLeuA加1015的catgcgtggtatecgt的agcagatttccag96GlyMetArgGlylieArgGiyAlaAspPheGin2530tgcttccagcaageccgagecgtggggctgtegggcacctteegggetCysPheGinGinAlaArgAlaValGlyLedSerGlyTjir的eArgAla354045〕"ttcctgtectctaggctgcaggatetctstage3tc-tg印ccgtget192PheSec5arArgLeuGinAspl*euTyrSerlieValArgArgMa505560gace的的gtetgtgcccategtcaa<:ctgaaggacg在ggtgetatct240AspAirgGlySerValProlieVaiAsnLeuLysAspGluValLuSer仍，07580cccagetgggactecctgttttct訴cteccagggtcaagtgcaaccc288ProSerTrpAspSerPheSerGlySerGinGlyGinVslGinPro859095g的gecogoatettttcttttggcagagatgtcctgagaesccca336GlyAlaArgI丄豕PheSerPheAspGly'ArgAspValLeuArgHisPro工00105110gectggccgcagaagagegtatggcacggcteggaccccagtgggegg384AlaTrpProGinLy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O576accgtgtctgggaaaacctgtcsgegct的agtgagcaaacccctcatThrValSerGlyLysThrCysGinArgT;rpSsrGluGinThrProHis195200205624aggcacaaca的acaccagaaaattt:cccctgcaaaaatctggaagagArgHisAsnArgThrProGluAsnPheProCysLysAsnLeuGluGlu210215220672aaetactgceggaacccagat的agaaactgetccctggtgctatAsnTyj:CysArgAsnProAspGlyGluThrAlaProTrpCysTyrThr225230235240"20actgacagecagctgaggtgggagtactgtgagsttccatectgcgagThrAspSer*GinLeuArgTrpGluTyi*CysGlulieProSerCysGlu245250255758tecteagcateaceagaccagteagattecteagttccaccageggagSerSerAlaSerProAspGinSerAspSerSerValProProGluGlu260265270616caaacacctgtggtccaggaatgctaccagagegatg卯cagagetatGinThrProValValGinGluCysTyrGinAspGlyGinSerTyr2"280285864eggggtacategtecactaccateacagggaagaagtgccagtggArgGlyThrSerSei:ThrThrlieThrGiyLysLysCysGinSecTrp，295300912gcagetatgAlaAlaMet305ProC3CHis310aggcattegaagArgHisSerLysThr315ProgagaacPhePro320柳gatgetggcttggag3tgaactactgcaggaacccggatggtgacaagAspAlaGlyL抑GluMetZVsnTyrCysArgAsnProAspGlyAspLys325330335ggcccttggtgctacaccactgacccgagegtc柳egggastactgcGlyProTrpCysTyi:ThrThrAspProSerVal納TtpGluTyrCys340"5350aacctgaageggteagagacaggagggAsnLeuArgCysSerGluThrGlyGly355360'1C56<211>362<212>PRT<213>小家鼠VaiTyj:LeuTheMetSetThePhe35GlyLeuGlu50ProTrpCys65lieProGluGluGlyAspSerG丄rt115SerLysAsn130ArgProTrpAsplieProGinCysIjBUThrVa丄SerArgHisAsnAsnTyrCys225ThrAspSerSerSerAlaGlDThrPro275SerGluCysLysThrGlylieGlyAsnGlyTyrArgGiyAirgThrLygSerGlyValAlaCysGinLysTrpGlyAla202530H土sValPr。AsnTyrSerProSearThrHisAsnGiu4045GluAsnTyrCysArgAsnPro55TyrThrThrAspProAspLys70CysGluG丄uGluCysMetTyr8590lieSer乙ysThrMetSerGly1C0105SerProHisAlaHisGlyTyr120LeuLysMetAsnTyrCysJUs135AspAsnAsp<UuGinGlygoArgTyrAspTyrCysAsn7580CysSexGlyGiuLysTyrAspCysGinAisTrp110lieProAlal*ysPhePro125AsnProAspGlyGluPro140CysPheThrThrAspProThrLysArgT卬(51uTyrCys150155160ArgCysThrThrProProProProProSerPi:oThrTyr'1S5170175LysGlyArgGlyGluAsnTyrArgGiyThrVaJLSerVali80185190GlyLysThrCysGinArgTrpSer<3i。GinThi:ProJUs200.20SArgThrProGluAsnPheProCysLysAsnLeuGluGiu21S220ArgAsnProAsp<31yGluThtAlaProTrpCysTyrThr230235240(SinLeuArgTrpGluTyrCysGlulieProSerCysGiu245250255SerProAspGinSerAspS&rSarValProProGluGlu260265270ValValGinGluCysTyrGinSerAspGl'yGinTyr280285ArgGlyThrSerSerThrThrUeThirGlyLysLysCysGinSerTfp290235300AUAUMet305AspAlaG上yProAsn:I>euTip35SHieProHisArgHis310GluMetAsnTyr325TyrThrThrAspXi的Cys340ArgCysPro345liysThzProGluAsnPhePro313320ArgAsnProAspGlyAspLys33033SSerValArgTrpGluTyrCys350CysSerGluThrGlyGly360<210><2U><212>OWA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述小鼠FoAngia的正向引物<220><221>CDS<222><2)-,(49)"00>26ccccaa9cttgtgtatctgteagaatgtaag31ProLysLeuValTyrLeuSerGiuCysLys1510<210>27<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>27ProLysLeuValTyrLeuSerGl\iCysLys1SID<23Jl>30<m>DNA<213>人工序列<220><:223>人工序列的描述')、鼠FoAngio的反向引物cccctcigagctaccctcctgtetetgagca30<21i>29DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述狗Fc的正向引物<221>CDS<222>(29)ccttaagcLeuSergaaaatggaagagttcctcgcGlizAsnGlyArgValProA"29<2i0>30<213>人工序列<400>30LeuSerGluAsnGlyArgValProArg<210>31<212>卿<213>人工序列<223>人工序列的描迷狗Fc的瓦向引物<400>31tttacccggggaat的gaga的gatttctg40<210>32<2J_3>家犬OCDS<222>(1).,<702|"00>32gaaaatggaagagttcctcgcccacctgattgtcceaaatgcccagcc48AsnGl_yArgValProArgProProAspCysProLysCysProAla151015ectg貼stgctggga的gcctteggtcttcatetttcccccgaasccc96ProGluMetI^u(SlyProSerValPhsliePheProProLysPro202530aaggscaccetcttgattgeccgsaoacctgaggtcacatgtgtggtg1"LysAspThrLeuLeulieAlaArgThrProGluValThrCyaV"Val354045gt:ggatctgggacca諷agaccctgaggtgcagateagetggttcgtgValAspLeuGlyProGluAspProCUuValGinlieSerTrpPheVal505560192gacggtaagcagatgcaaacagecaagactcagcctAspGlyLysGinMetGinThi:AlaLysThrGinPro657075cgtgaggagcagArgGluGluGin80240ttcast的cacetsccgtgtggtcagtgtcetccccattgggcaccagE"heAsnGiyThrTyrArgValValSerValLeuProlieGiyHisGin859035238gactggetc3ag的gaagcagttcacgtgcaaagtcsacaacaaagecAspTrpLeuLysG丄yLysGinPheThrCysLysValAsnAsnLysAla100105110336etcccatecccgategagaggaccatetecaaggecagagggcaggecLeuFroSrPrd工leGluArgThrlieSej:LysAlaArgGiyGinAlaU5120125'384catcagcccagtgtgtatgtcctgccgccatecegggaggag"gageHisGinProSerValTyrValProProSerArgGluGluLeuSer130135"0432asgsacacagtcagettgseatgcctg3tcaaagacttcttcccacctLysAsnThrValSerLeuThrCysLeulisLysAspPhePheProPro14515015510綱gacattgatgtggagtg<gcagagesatggacagcaggagcctgagageAsplieAspVaiGluTrpGinSsrAsnGlyGinGinGluProGiuSer165170m528aagtsccgca"accccgccccagctggacgaggacgggtectacttcLysTyrArgThrThrProProGinLe。AspGluAspGlySerTyrPhe180185"0576ctgtacageaagetctctgtggacaagagecgctggcageggggagacLeuTyrSerLysLeuSerV"AspI^ysSerArgTrpGinArgG3_yAsp195200205624accttcatatgt柳gtgatgcatgaagetetacacTtu:PhelieCysAlaValMetHisGUiAlaHis21021S220cagaastecetcteccactctcGgggtaaaGinLy$Se￡LeuSerHisSet:ProGlyLys225230aacescAsnHis。2102<210>33<2U>234<212>￡RT<213>參犬<40O>33GluAsn<31y納ValProArgProProAspCysProLysCysProAla1015ProGluMetLeuGlyGlyProSerValPhell奪HiePro2025V3lAspAspHisLysAspLysLeuThrGin225AspThe35AspLeu50AsnGlyTrpLieuProSetGinPro130AsnThrlieAspTyrAj:gPhelie210Laul^uIJLeGlyP:s:oGluMetG工n70ThrTyrArgliysGlyI/ys100ProlieGluAlaArgThrGluVal40AspProG丄uValThr;UaLysThrSerValTyrV3lSerLeu150ValGluTrpThrThrProLysLeuSerCysAlaVaiLeuSerHis230Va丄Va工GinPhe120ValLeu90I丄eSerProProThrCysLeu工leGinProG化AsnGly170LeuAsp185ValAsp200MetHis215GluAlaSerProGlyLysGinlieSOThrSecGinPro75LeuProlieSerArg"0155GinAspGin125GluGluGluAspGiyArgAspGin205LeuHisAsn220ProtysPro30CysValValTrpPheVaiGluGluGin80GlyHis<Un9SAsnIiysAlaGlyGinAlaGlulieuSerPheProProProGluSer175SerTyrPheArgGly鄉(xiāng)HisTyi:Thr<T210>34<2U>552<213>家犬<221>CDS<222>(1),(5S2><223>內(nèi)皮抑制素"00>34cacacecaccaggacttccagccggtgct9cacctggtggecctgaacJUsThrHisGinAspPheGinProValLeuHisLeuValAlaAsnX51015ageccgcagccgggc卯catgcgaggcateeggggagcggacttccagSerProGinProGlyGly晚tArgGiylieArgAlaAspPheGin20253096tgcttccagcaggcgcgcgccgcg的gct<jgccggcaccttcc卯gccCysPhe<5inGinAlaArgAlaAlaGlyl*euAlaGiyThrPhe^VrgAia3540451"ttcctgtegtegeggctgcag訴cetcPheLeuSerSerArgL$uOlnAspLeu5055tacagestcgtgcgccgcgccTyrSerlieValArgArgAla$0192gaccgcaceggggtgcccgtcgtcaac.ctcagggacgaggtgetcttcAspArgThrGl_yValProValValAsnLeuArgAspGluValLeiiPhe65707580240cccagetgggaggccttatfcctegggcProSerTrpGiuAlaLeuPheSerGly85tecgagggccagetgaagcccSerGluGlyGloLeuLysPro9095288ggggcccgcatettctctttcgacggcsgagatgtcctgcagcaccccGlyAlaAxgliePheSerPheAspGlyArgA鄰valLeuGinHisPro100105110336gccAlatggccceggaagagegtgtggcacggctecgaccccagegggcgcTrpProArgLysSea:ValTrpHisGlySerAspProSerGlyArg115120125384cgcctgaccgacagetactgcgagacgtggeggacggaggccccggcgArgLeuThrAspSerTyrCye<U。ThrTrpArgThrGluAlaPi:oAla130135140432gccact:gggcaggcgtegtegctgctggcgggcaggctgctggagcag;UsThr*GlyGinJUaSerSerLeuLeuAlaGlyArgLeuLeuGluGin145150155160480gaggccgcgagetgccgecaegccttcgtggtgetctgcatogagaacGluAlaAlaSerCysArgHisAlaPheVaiValLeuCys工leGluAsn165m528agegtcatgacctecttctecaagSerValMetThrSerheSerLys180552<210>35<211>184<213>家犬<400>35HisThrHisGinAspPheGinProValLeuHisLeuValAlaLeuAsnSerProGinProGlyGlyMetArgGlylieArg<UyAlaAspPheGin202530Cy3PheG丄nGinAUArgAlaAla(UyLeuAlaGlyThrPheArgAls354045Ph&L的SerSerArgL的GinAspLauTyrSerILsVaiAr^JUa503560AspArgThrGlyValProValValA3nLe。ArgGluValLeuPhe65707580ProSerTrpGluJUaLeuPheSerGlySerGluGiyGinLeul<ysPro853095GlyAlaArgliePheSerPheAspGlyArgAspValL&uGJLnHisProioo;105uo120ProSerGlyArg125HisGlySerAspTyrCysGluThrTrpAirgThrGluAlaProAlaAlaTrpProArgLy3115ArgLeuThrAspSer130135AlaThrGlyGinAlaSerSerl^u1"150GluAlaAlaSearCysArgHisAlaSej:ValMetThrSerPheSexLys180140LeuAlaGlyArgLeuLeuGluGin155160PheV"ValCysIi(SJLuAan170175<210>36<2U>41<212>DMA<213>人工序列<220><223>人工序列的描逸Hindm/Dmin接頭上鏈<220><221>CDS(41)<柳>36cttcacacccaccaggacttccagccggtgctgcacetgLeuHisThrHisGinAspE*hs(UnProVaiLeuHisL的，51041<210〉"<2U>13<212>PRT<213>人工序列"00>37、、LeuHisThrHiaGinA印PheGinProValL的HisU。1510'<210>3B<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列的描迷Himl瓜/Dnim接頭下鏈<400>38gtgcagcaccggctggaagtcctggtgggt34<210>39<212>DWA<213>家大<221>CDS<m>u》.'<223>人工序列(107"atatatcttlieLeuteagag5tgc:CysaagsetLysThrggaaatgggGlyAsnGly10aaaacctacagggggLysThrTyrArgGiy1543accatggecaa.aacga的aatgatgttgc<:tgtcaaaaatggagtgacThtMetAlaLysThrLysAsnA沖VaiAiaCysGinLysTrpSerAsp2025309633tccg35C3CHis333cct:33CtAtAsnTyr40acgcctgagThrFroGl。aagcaccccttggagliysJUsProLeuGlu45144柳Glyctg50gagGlugag貼cAsntatTyrtgcetggCysArg55sac.cct卵cAsnProAspBacg&cgagaacgggAsnAspdluAsndiy60192ccctggtgctacaccaeaaaccca.gacgtgaggttcgactactgcaacProTrpCysTyrThrThrAsnProAspValArgPheTy工CysAsn仍"75SO240sttccagaatgtgaagaggaatgtatgcattgc3gtggggaaaattatliePro(3iuCyaCUuGluGiuCysMetHisCyaSei:GlyGluAsmTyr8590$5238gagggcaaaatttecaagacaaagtctggaetcgagtgccaagectggG丄uGayLyslieSerLysThxrLysSerGlyGluCysGinAlaTip1001051103363scA卯tctS會(huì)rGin1153CCProcat:HisgetAlaHis120gg為tat3ttGlyTyrlieccttecaaatt"tccaProS虹LysPhProJL'25334age&agaacttgaagatgaattactgccgtaaccctgatggggagSerLysAsnLeuLysMetAsnTyrCysArgAsnProAspGlyGluPro130135"0432ArgProM5tggtgttt:cTrpCysPhsaceatggatcccaacaaaThrMetAspProAsnLys150155cgctggg的ttetgtArgTrpGiuPheCys160480gscattccccgctgtacsacaccaccaccccct卯cccaacgtacAsplieProArgCysThrThrProProProProSerGlyProThrTyr1651701*75528cagtgtctg的caga的ggagagetaccga卿aaggtgtecgtcGinCysLeuI*ysGlyArgGlyGluSerTyrArgGlyLysValSerVal180185130576actgtcThrVsltctggetSerGlyHis195acatgtcsgGin200HistggsgtgssTcpSei:GluGinThf205ProHis624aagcacaaca的accccagaa&&cttccctfcgcaaaaetttggatgaaLysHisAsnArgThrProGiuAsnPheProCysLysAsnLeuAspGlu210215220672aactactgtcgcaaccctgatggagaaseagetccatggtgctacacaAsnTyrCysArgAsnProAspGlyGJLuThrAlaProTrpcysTyrThr225230235240720accaaeagtgaggtga的tgggaacactgccagattccgteetgtgagThrAsnSearGluVaiArgTrp(5丄uHisCysGinliePro5erCysGLu245250255tectctccaataaccseagaatatSerSerProlieThrThrGluTyr260ttggatgecccagetteagtgccaLeuAspAlaProAlaSerValPro270816cctgaacaaactcctgtggtcProGiuGinTiifProValValG丄n2*75280gagtgctacescGluCysTyrHis的caat285柳cagGlyGinsgttatcgaggcacateatecactactstcacaggaaga3aatgtcagSerTyrArgGLyThrSerSerThrThrlieThrGlyArgLysCysGin290295300tcttggteatctatgseaccacacS6rTrpSerSerMetThrProHis305310ttcecggaggetggcctgacaatgPheProGluAlaGlyLeuThrMet325cgaestgagaagaccccagascac;u:gHisGluLysThrPj:oGluHis315320aactactgcaggaateccgae<gccAsnTyrCysArgAsnProAspAla330335gac3asiagecctt的tgttacaccaccgaeccctctgrt:gcgctgg柳AspLysSerProTrpCysTyrThrThrAspProSerValArgTrpG丄u340345350ttctgtaacttgagaaaat;gcPheCysAsnLeuArgLysCys3558"S12<2il>359<212>PRT家犬<400>40工"Tyr!^uSerGiuCysLysThrGlyAsnGlyIiysThrTyrArgGly151015ThrMetAlaLys20AsnSerProHis35Glyl*euGluGlu50ProTrpCysTyi:lieProGluCysGluGlyLyslie100AsnSerGinThr115SerTLysAsriLeu130ArgProTrpCysJL45AsplieProArgThrLysAsnAspValAlaCys25353erProProAsnTyj:ThrProGlu40TyrCysArgAsnProAsp55ThrAsnProAspValArg7075Gl\iGluCysMet:HisCys90LysThrLys5erGlyJbeuHisAlaHisGlyTyrlie120MetMilTyrCysArgA幼135GinCysLeuLys180ThrValSerGly135LysHisAsnArg210AsnTyi:CysTVrg225ThrAsnSerGluSerSerProlie260GlyHisVal2"Gin!>ysTrpSerAsp30LysHisProLeuG3lu45AsnAspGluAsnGly60PheAspTyrCysAsnSerG丄yGluAsnTy工95GluCysGinAlaTj:p110ProSecLysPh$Pro125ProA^pGlyGluPro140ThrMetAspProAsnLysArgTrpGluPheCys150155160Thr7hrProProProProSerGlyProThrTyr"0175ArgGlyGluSei:TytArgGlyLysValSerVal185"0ThrCysGinHisTrpSerGluGinThrProHis200205ProGluAshPheProCysLysAsnLeuAspGlu21S220Ero卿GiyGluThrAlaProT印CysTyrThr230235240ArgTrpGiuHisCysGinlieProSerCysGlu250255ThrThrGluTyr乙euA印AlaProAlaSecPro2S5270ProGluGinThrProVaJValGinGluCysTyrHisGlyAsnGlyGir，275280285S$rTyrArgGlyThrSejrThj:ThrlieThrGlyArgLysCysGin290295300SerTrpSerSerMetThrProHisArgHisGluLysThrProGluHis305310315320PhsProGluAlaGlyLeuThrMetAsnTyrCysArgAsnProAspAla325330335AspLysSerProTrpCysTyrThrThrAspProSerValAxgTrpGlu3^0345350PheCysAsnLeuArgl*ysCys355<:2L0>"<2L1>12<213>人工序列<220><223>人工序列的描述其中終止密碼子TGA后為Xhol終點(diǎn)的回丈接頭<400>41d0>42<2U>21<213>人工序列<220><22》人工序列的描述用于鼠制管張素的誘變引物<221>CDS<222>(1){211"00>42gggectt的agetacactacaGlyProTrpSsrTyrThrThr<210>"<211>7PUT<213>人工序列<400)43GlyProTrp3erTyrThrThr<210>44<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><^3〉人工序列的描迷用于在鼠制管張素中導(dǎo)入IfincfflI的引物<220><221>CDS<222>(9)"P2><400〉"gcggatccaagcttagtacscatcccaatgag34I>ysLeu3erThrHisProAsnGlu<210>45<212>PRT<213>人工序列<400>45LysLeuSerThrHisProAsnGlu15<210>"<2U>59<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描迷B印HI/Bamffl接頭上鏈<220><221>CDS<222>(2)-,<5B)catgacctctttcteeaaategagegggggcagegggggcggaggcage"MetThrSerPheSearLysSerSezGlyGiySerGlyGlyGlyGlySerL51015卿gggggcgGlyGlyGly<210>47<2U>19《213>人工序到<400)47MetThrSerPhe$erLysSerSer<UyGlySei:GlyGlyGlyGiySerlS1015GiyGiyGly<210>43<2:u><213>人工序列<220><223>人工序列的描迷BspHI/BamHI接頭下鏈<柳>40gatccgcccccgccgctgcctccgcccccgctgcccccgctcgatttggagaaagaggt59D肌>，人工序列<220><223>人工序列的描述BamHI/Hittdm接頭上鏈<220><221〉CDS<222>"00>"tecteaggec12SerSerGly<210><21》<213>50l之人工序列<220>人工序列的描述BamHl/Hhuim接頭下鏈<210>51<2U>D肌<213>人工序列<223>人工序列的描述Aim/ffiniini接頭上鏈<220><222>CDS<400>51tta3gcggccrLeuSerdy<211>10<213>人工序列<223>人工序列的描述Atin/Hiniini接頭下鏈<400>52agctgggcgc10<210>53<2ll>U<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描迷XhoI/AflII接頭上鏈<220><221>CDS<222>口)..U"<400>53tcgactccgscAspSe;cGly<210>54<211>U<212>D船<213>人工序列<220><223>人工序列的描述XhoI/Afln接頭下鏈<柳>5權(quán)利要求1.具有血管生成抑制劑活性的同源二聚體融合蛋白，該融合蛋白包含免疫球蛋白Fc區(qū)和靶蛋白，其中所述Fc區(qū)包含鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，并且所述靶蛋白具有內(nèi)皮抑制素的血管生成抑制劑活性，并且是膠原蛋白XVIII片段，并且與所述Fc區(qū)的N-末端或C-末端連接。2.權(quán)利要求1的同源二聚體融合蛋白，其中所述靶蛋白是內(nèi)皮抑制素或其生物活性片段。3.權(quán)利要求2的同源二聚體融合蛋白，其中所述靶蛋白包含SEQIDN0:4所示氨基酸序列。4.權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)的同源二聚體融合蛋白，其中所述靶蛋白與Fc區(qū)的C-末端連接。5.權(quán)利要求1、2或3的同源二聚體融合蛋白，進(jìn)一步包含第二靶蛋白，其是纖溶酶原片段或膠原蛋白XVIII片段，并且具有制管張素或內(nèi)皮抑制素的血管生成抑制劑活性。6.權(quán)利要求5的同源二聚體融合蛋白，其中所述第二靶蛋白是內(nèi)皮抑制素或制管張素或它們的生物活性片段。7.權(quán)利要求5或6的同源二聚體融合蛋白，其中所述第二靶蛋白通過(guò)多肽接頭與所述第一靶蛋白連接。8.權(quán)利要求7的同源二聚體融合蛋白，其中所述第一靶蛋白與Fc區(qū)的N-末端連接，并且所述第二靶蛋白與Fc區(qū)的C-末端連接。9.權(quán)利要求5-8的任一項(xiàng)的同源二聚體融合蛋白，其中所述第一靶蛋白為制管張素，并且所述第二靶蛋白為內(nèi)皮抑制素或其生物活性片段。10.權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的同源二聚體融合蛋白，其中所述免疫球蛋白是IgGl。11.編碼信號(hào)序列和權(quán)利要求1-10的任一項(xiàng)的融合蛋白的DNA分子。12.用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的可復(fù)制的表達(dá)載體，包含權(quán)利要求11的DNA。13.制備權(quán)利要求1-10的任一項(xiàng)的同源二聚體融合蛋白的方法，包括以下步驟(a)用權(quán)利要求12的載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，(b)培養(yǎng)所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞以產(chǎn)生所述融合蛋白，和(c)分離所述融合蛋白。全文摘要本發(fā)明涉及表達(dá)以及分泌制管張素和內(nèi)皮抑制素的免疫融合物。具體地，所公開(kāi)的內(nèi)容為編碼一種免疫球蛋白Fc-血管生成抑制劑融合蛋白的核苷酸序列，例如DNA序列或RNA序列。所述血管生成抑制劑可以是制管張素、內(nèi)皮抑制素、具有制管張素活性的纖溶酶原片段或具有內(nèi)皮抑制素活性的膠原蛋白XVIII片段?？梢詫⑺龊塑账嵝蛄胁迦氲胶线m的表達(dá)載體中并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。此外所公開(kāi)的內(nèi)容還有通過(guò)表達(dá)這種核苷酸序列生產(chǎn)一系列免疫球蛋白Fc-血管生成抑制劑融合蛋白。所公開(kāi)的內(nèi)容還有使用這種核苷酸序列和融合蛋白治療血管生成性疾病的方法。文檔編號(hào)C12P21/02GK101386651SQ20081021065公開(kāi)日2009年3月18日申請(qǐng)日期1999年8月25日優(yōu)先權(quán)日1998年8月25日發(fā)明者K·-M·羅,S·D·吉利斯,Y·李申請(qǐng)人:默克專(zhuān)利股份公司