專利名稱：：變異型螢火蟲熒光素酶的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種特征為對ATP的活性和對dATP的活性之比(dATP/ATP)比野生型低的變異型螢火蟲焚光素酶(熒光素酶)及其基因、含有上述基因的重組載體、及上述變異型熒光素酶的活性評價方法。
背景技術：
：在測定DNA堿基序列的測序法中，基于Sanger法的測序法被廣泛利用。在該方法中，使引物與DNA模板結(jié)合，以該引物的3，末端為起點通過DNA聚合酶摻入雙脫氧核糖核苷酸(dNTP:dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，與此同時進行新的DM的合成反應。此時，在反應系統(tǒng)中預先少量加入4種不同的熒光物質(zhì)標記的脫氧核糖核苷酸(ddNTP:ddATP,ddGTP，ddCTP，ddTTP)。當在反應過程中摻入ddNTP時，合成反應在此處停止，產(chǎn)生各種大小的DNA片段。對應于在該產(chǎn)物中摻入的ddNTP的種類，因為摻入了不同的熒光物質(zhì)，通過使之變性為單鏈后進行電泳，進行片段大小分離，能夠測定模板DNA的堿基序列。分析人類全DM堿基序列的基因組計劃中便是基于Sanger法進行測序分析的。該計劃中還使用新型的毛細管電泳的測序分析裝置，據(jù)此可實現(xiàn)分析自動化、高速化，分析大量的DNA堿基序列成為可能。近年來，以廉價而快速的進行大量DNA堿基序列的分析為目的，基于各種各樣的原理的測序分析法的開發(fā)在廣泛的開展中。例如454Lifesciences公司開發(fā)的在配置于流式細胞儀上的小珠子上進行測序反應，可同時分析多個堿基序列的系統(tǒng)的大規(guī)模并行高速測序技術，已經(jīng)作為產(chǎn)品進行開始銷售。在上述大規(guī)模并行高速測序技術中使用的測序法的原理之一中有在該方法中，使DNA模板與引物結(jié)合后，依次加入4種dNTP進行通過DNA聚合酶進行的延長反應。此時加入與模板匹配的dNTP時發(fā)生延長反應，與此相伴產(chǎn)生焦磷酸(PPi)。此處產(chǎn)生的PPi通過ATP硫酸化酶等轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP。進一步以ATP為底物引起焚光素酶的熒光反應。如發(fā)光即表示摻入了匹配的dNTP，形成了模板的堿基序列已知的組合。另一方面，作為在該反應系統(tǒng)中使用的酶之一的熒光素酶，因其具有催化發(fā)光反應的特殊性質(zhì)，除了測序分析，還被利用于基于ATP的定量的細菌數(shù)檢測、細胞增殖檢測、測定基因轉(zhuǎn)錄活性的機器人自動化檢測、細胞內(nèi)標記.酶的高敏感度檢測等各種檢測系統(tǒng)中。另外，該熒光反應的利用還可以應用于細胞、培養(yǎng)組織、固體水平，^吏該酶成為在熒光成像領域內(nèi)不可欠缺的工業(yè)上重要的酶之一。因此，以工業(yè)上更進一步的應用為目標，進行著各種變異型熒光素酶的開發(fā)。例如有通過氨基酸序列的替換增強熒光強度的熒光素酶的報道(專利文獻l)，其記載有將第419到428位的氨基酸中至少1個替換為具有在該氨基酸的分子量以上的分子量的非極性氨基酸(丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)時增加發(fā)光強度。另外還有提高了熱穩(wěn)定性(專利文獻2~5)、獲得針對表面活性劑的耐性(專利文獻6)、提高底物親和性(專利文獻7~9)、改變發(fā)光波長(專利文獻10~11)、提高熒光的持續(xù)性(專利文獻12)等變異型熒光素酶的報道。特開2007-97577號特許第3048466號特開2000-197487號特表平9-510610號特表2003-518912號特開平ll-239493號國際公開第99/02697號專利文獻l專利文獻2專利文獻3專利文獻4專利文獻5專利文獻6專利文獻7專利文獻8:特表平1Q-512750號專利文獻9:特表2001-518799號專利文獻l0:特許第2666561號專利文獻l1:特表2003-512071號專利文獻l2:特開2000-197484號
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明欲解決的課題底物的dATP的使用受到限制。當dATP比較弱時，由于它作為熒光素酶的底物發(fā)揮作用，即使在聚合酶引發(fā)的延長反應時未發(fā)生摻入也可檢測出熒光信號，妨礙了正確的測序信號的分析。為了解決該問題，利用類似物以具有作為聚合酶的底物的作用的，但并不具有作為熒光素酶的底物作用的dATPocS來代替dATP(專利第3510272號)。但是，由于dATPocS與dATP相比，作為聚合酶的底物的摻入效率低，因此成為使測序分析整體的反應效率降低的原因。因此，為避免該問題的出現(xiàn)，改變熒光素酶的底物特異性，使其不與dATP反應而只以ATP為底物進行反應的策略被認為是有效的方法。熒光素酶的發(fā)光反應模式已證明大致可分為2階段進行。在第1階間體，放出焦磷酸。接下來的第2階段，酶與該中間體進行反應，生成AMP和二氧化碳的同時生成處于激發(fā)狀態(tài)的氧化熒光素，該產(chǎn)物向基態(tài)躍遷時發(fā)出可見光。通常該發(fā)光反應以ATP為底物進行，dATP與ATP的結(jié)構(gòu)非常類似，dATP也作為熒光素酶的底物被識別進行發(fā)光反應。為了研究熒光素酶的結(jié)構(gòu)和活性的關系，迄今為止已經(jīng)在若干小組中進行了熒光素酶蛋白質(zhì)的X射線結(jié)構(gòu)分析。北美螢火蟲熒光素的立體結(jié)構(gòu)(Structure1996，Vo14，287-298)或源氏螢熒光素酶和蟲熒光酰AMP中間體類似物之間的復合物的立體結(jié)構(gòu)等已經(jīng)被闡明(Nature2006，Vol440，372-376)。從該立體結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果看，證明了與從變異型源氏螢熒光素酶中見到的黃綠色熒光到紅色熒光的變化相關的，第286位的絲氨酸替換為天冬酰胺的變異是熒光顏色改變的直接原因。以這些公知的熒光素酶立體結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)為基礎進行判斷，可推測可能在作為底物的ATP的糖部分的2，位及3，位的羥基與北美螢火蟲熒光素的第422位的天冬氨酸(Asp)之間形成了氬鍵。另外一方面，ATP和dATP結(jié)構(gòu)不同之處只在于2，位的羥基(2'-0H基)在dATP中替換為氫(2'-H)。因此通過將該第422位的Asp(Asp422)替換為其它氨基酸，有可能改變熒光素酶轉(zhuǎn)向dATP的反應性。因此本發(fā)明者們制作了將Asp422替換為其它氨基酸的變異體，測定了它們的ATP活性。但是，證明了上述變異性熒光素酶對ATP的活性完全消失。因此，證明Asp422是對于熒光素酶不可或缺的序列，證明Asp422的氨基酸替換對于實現(xiàn)在維持對ATP活性的同時降低對dATP的活性是不可能的。即，本發(fā)明的課題為，提供一種能夠在維持對ATP活性的同時，只降低對dATP活性的變異型熒光素酶。解決方法為了解決上述課題，考慮的策略為在本發(fā)明中第422位的天冬氨酸(Asp422)保持原樣，進行了相鄰的421位的甘氨酸(Gly421)氨基酸的替換，使得Asp422附近的結(jié)構(gòu)發(fā)生傾斜，降低對于dATP的活性。由于甘氨酸(Gly)在側(cè)鏈部分只具有氫，結(jié)構(gòu)的自由度大，是對主鏈的結(jié)構(gòu)影響力很高的氨基酸。因此通過改變Gly421，改變含有Asp422的附近的結(jié)構(gòu)，可以推測底物反應性的變化。因此，改變編碼Gly421的堿基序列，制作19種各氨基酸替換的變異性熒光素酶，以dATP或ATP作為底物測定其活性。結(jié)果成功獲得對dATP的活性和對ATP的活性的比率(dATP/ATP)比野生型熒光素酶降低的變異型熒光素酶。即，本發(fā)明涉及一種變異型熒光素酶，是與野生型熒光素酶相比，S!螢火蟲熒光素酶，其特征為，通過同源性分析，與野生型北美螢火蟲(Photinuspyralis)熒光素酶的氨基酸序列上421位的甘氨酸相當?shù)奶囟ㄎ恢玫陌被岜粯O性氨基酸替換。作為本發(fā)明的變異型熒光素酶之一的實施形態(tài)，可舉出例如具有野生型北美螢火蟲(Photinuspyralis)熒光素酶的氨基酸序列上421另外，作為另一種實施形態(tài)，還可以舉出具有野生型源氏螢(Luciolacruciata)熒光素酶或野生型平家螢(Luciolalateralis)熒光素酶的氨基酸堿基序列上423位的甘氨酸被極性氨基酸所替換的氨基酸序列的變異型熒光素酶。且替換的極性氨基酸分類為以下的(a)(b)2個種類。組替換為絲氨酸(Ser)、賴氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、組氨酸(His);(b)"dATP活性比率降低(1/3以下)且維持ATP活性(不足1/2，1/3以上)"組替換為精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明中的變異型焚光素酶的基因、含有上述基因的重組載體。此外，本發(fā)明提供了本發(fā)明的變異型熒光素酶的活性評價方法。該方法中包含以下步驟合成與野生型螢火蟲熒光素酶相比，對dATP活性與對ATP的活性的比率(dATP/ATP)降低的變異型安火蟲熒光素酶的步驟、從合成的變異型螢火蟲熒光素酶除去內(nèi)生性ATP，并純化的步驟、及分別測定純化的變異型螢火蟲熒光素酶對于ATP和dATP的活性的在上述方法中，作為對dATP活性與對ATP的活性的比率(dATP/ATP)與野生型熒光素酶相比降低了的變異型熒光素酶，可舉出上述變異性熒光素酶，其優(yōu)選在無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中合成。發(fā)明的效果本發(fā)明的變異型熒光素酶，由于與野生型相比對dATP活性與對ATP的活性的比率(dATP/ATP)降低，因此在利用了它的焦磷酸測序中，可以使用dATP作為DNA聚合酶的底物。圖l是根據(jù)氨基酸本身的性質(zhì)進行分類的圖。圖2是表示本發(fā)明的熒光素酶的活性測定法的整體流程的圖。圖3測定合成的熒光素酶的相對ATP和dATP的活性的圖表。(A)野生型熒光素酶；(B)變異型熒光素酶(Gly421Ser)。具體實施方式以下對本發(fā)明進行詳細說明。1.變異型熒光素酶本發(fā)明的變異型熒光素酶為具有野生型北美螢火蟲熒光素酶的氨基酸序列上421位的甘氨酸(Gly421)相當?shù)奈恢玫陌被岜粯O性氨基酸替換的氨基酸序列，在該野生型中，對dATP活性與對ATP的活性的比率(dATP/ATP)降低的變異型熒光素酶。本發(fā)明中的"北美螢火蟲"學名為Photinuspyralis，該野生型熒光素酶的基因序列及氨基酸序列注冊于作為公共的數(shù)據(jù)庫的GenBank中,AccessionNo.M15077(序列編號29:c腿)及AAA29795(序列編號30)。本發(fā)明中的"與野生型北美螢火蟲熒光素酶的氨基酸序列的421位的甘氨酸相當?shù)奈恢玫陌被?基于同源性分析而特指。該部位上與Gly相鄰存在有Asp，替換為上述Gly的極性氨基酸的位置與北美螢火蟲熒光素酶相同，改變了相鄰的Asp附近的結(jié)構(gòu)，可改變底物反應特性，使得在維持對于ATP的活性的同時，只降低對于dATP的活性。需要說明的是，可利用例如Limpan-Pearson法等任意公知的同源分析法作為同源性分析。例如，來源于源氏螢(Luciolacruciata)、平家螢(Luciolalateralis)的熒光素酶(分另'J為GenBankAccessionNo.M26194及X66919)時，北美螢火蟲熒光素酶的第421位的甘氨酸，相當于在各熒光素酶的該氨基酸序列的第423位的甘氨酸。本發(fā)明中涉及的"極性氨基酸"指絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)、半胱氨酸(Cys)、組氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)這11種。雖然變異型熒光素酶中對dATP的活性降低，但維持原來的ATP活性是必要的，雙方的值的平衡非常重要。上述極性氨基酸替換對應dATP活性比降低和維持ATP活性，分類為以下的(a)(b)2個種類(a)"dATP活性比降低(1/2以下)且維持ATP活性(1/2以上)"組替換為絲氨酸(Ser)、賴氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、組氨酸(His);(b)"dATP活性比降低(1/3以下)且維持ATP活性(不足1/2,1/3以上)，，組替換為精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)。此處的"活性，，指ATP或dATP在鎂離子、蟲熒光素的存在下，與熒光素酶發(fā)生反應，測定熒光時的熒光強度的最大值。"dATP活性比率降低"指測定熒光素酶對dATP活性與對ATP的活性的比率(dATP/ATP)，以百分率(％)表示的值與野生型熒光素酶相比變異型熒光素酶的值降低。因此，"dATP活性比降低(1/2以下)"指與野生型熒光素酶相比dATP活性比率降低至l/2以下，"dATP活性比降低(1/3以下)"指與野生型熒光素酶相比dATP活性比率降低至l/3以下。"維持ATP活性"指野生型熒光素酶的ATP活性在變異型焚光素酶中被多少程度的維持下來，合成變異型熒光素酶以后，測定該粗合成液中含有的熒光素酶的ATP活性，與合成野生型熒光素酶進行比較評價。因此，"維持ATP活性(1/2以上)"指該ATP活性維持在野生型的1/2以上，"維持ATP活性(不足1/2，1/3以上)"指本ATP活性維持在不足野生型的1/2，且在l/3以上。(a)組為與"dATP活性比率"相比，將"維持ATP活性"設為重點而分類的組，與第421位的氨基酸相當?shù)腉ly替換為Ser的變異型(Gly421Ser)為最優(yōu)選的形態(tài)。(b)組為與"維持ATP活性"相比將"dATP活性比率"設為重點而分類的組，與第421位的氨基酸相當?shù)腉ly替換為Asn的變異型(Gly421Asn)為最優(yōu)選的形態(tài)。且"dATP活性比率"的測定中，純化合成的熒光素酶，在完全除去合成反應溶液中含有的內(nèi)生性ATP等可能成為熒光素酶的底物的成分后進行測定是必要的。另一方面，"維持ATP活性"的判定中，使用熒光素酶純化前的粗合成液的一部分(5mL左右)。此時，ATP的活性不是以熒光素酶的合成量相當?shù)闹敌拚幕钚灾?，是包含合成的熒光素酶具有的活性和合成容易程?合成能)的2個重要因素的值。通常，合成在氨基酸中導入變異的蛋白質(zhì)與野生型蛋白質(zhì)相比其合成量是變動的。在變異型蛋白質(zhì)中多有熱穩(wěn)定性或折疊效率降低，合成量降低的情況，希望有一種在將來以重組生產(chǎn)為目的時合成能降低小的變異型蛋白質(zhì)?？傊?，該ATP活性評價法適合于對熱穩(wěn)定性低、折疊效率差的蟲熒光蛋白酶的評價。圖1中總結(jié)了本發(fā)明相關的氨基酸取代。上述的極性氨基酸中劃有下劃線。屬于(a)組的氨基酸以在右側(cè)(a)的印記表示，屬于(b)組的氨基酸以在右側(cè)的(b)的印記表示。2.變異型螢火蟲熒光素酶基因本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的變異型熒光素酶的基因。在該基因的堿基序列中，對應于變異型北美螢火蟲熒光素酶的第421位的Gly的氨基酸的堿基序列被編碼極性氨基酸的堿基序列所取代。例如，在源氏螢、平家螢中編碼第423位的Gly的氨基酸被極性氨基酸所取代的堿基序列。堿基序列的取代，可通過在野生型的熒光素酶基因中導入位點特異性變異來進行。位點特異性變異的導入也可使用已知的任意方法，例如Invitrogen公司的GeneTailor定點突變系統(tǒng)等市售的試劑盒進行實施。3.變異型焚光素酶重組DNA載體本發(fā)明還提供一種在上述變異性熒光素酶基因中摻入栽體DNA的重組載體。作為上述質(zhì)粒DNA，可舉出大腸桿菌質(zhì)粒(例如pBR322、pBR325、pUC18、pUC119等)、枯草菌來源的質(zhì)粒(例如pUB110、pTP5等)、酵母來源的質(zhì)粒(例如YEpl3、YEp24、YCp50、pYE52等)等，嗜菌體DM可舉出M13噬菌體、入噬菌體等。在上述栽體中摻入本發(fā)明的基因采用下述方法，首先使用適當?shù)南拗菩悦盖袛嗉兓腄NA，摻入至栽體DNA的適當?shù)南拗菩悦盖胁课换蚨嗫寺∥稽c，與載體相連接的方法。為了在宿主內(nèi)表達外來基因，有必要在結(jié)構(gòu)基因之前設置適當?shù)膯幼印Ｉ鲜鰡幼硬o特別限制，可使用任一種在宿主內(nèi)功能已知的啟動子。且關于啟動子，在后述的轉(zhuǎn)化中，對宿主按順序進行詳述。另外，還可以根據(jù)需要設置增強子等順式元件、剪接信號、polyA附加信號、核糖體結(jié)合序列(SD序列)、終止子序列等。另外，還可以利用市售的表達載體系統(tǒng)，例如Novagen公司的pET載體系統(tǒng)或后基因組研究所的pURE載體系統(tǒng)等。4.變異型熒光素酶的合成然后，在宿主中導入上述載體以表達目的基因，制作變異型熒光素酶蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)。此處宿主只要能表達本發(fā)明的DNA，并無特別限定，可利用通過使大腸菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞等已知的宿主中的任一種適合于表達載體的系統(tǒng)。例如可舉出大腸桿菌(Escherichiacoli)等埃希氏菌屬、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等桿菌屬、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)等假單胞菌屬、苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)等根瘤菌屬的細菌、或酉良酒酵母(Saccharomycescervisiae)、粟酒裂歹直酵母(Schizosaccharomycespombe)、畢赤酵母(Pichiapastoris)等酵母、其它的COS細胞、CHO細胞等動物細胞、或Sfl9、Sf21等昆蟲細胞。以大腸桿菌等細菌為宿主時，本發(fā)明的重組栽體優(yōu)選可以在該細菌中自律復制，同時通過啟動子、核糖體結(jié)合序列、本發(fā)明的基因、轉(zhuǎn)錄終止序列構(gòu)成。另外，還可含有控制啟動子的基因。以大腸桿菌為例，可舉出例如大腸桿菌(Escherichiacoli)K12菌林、B菌林等；以枯草菌為例可舉出例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)MI114、207-21等。啟動子只要可在大腸桿菌等上述宿主中表達并無特別限定，例如可舉出trp啟動子、lac啟動子、Pt啟動子、h啟動子等來源于大腸桿菌或噬菌體的啟動子。另外還可以使用tac啟動子等人為設計改變的啟動子。在細菌中導入重組載體的方法并無特別限定，可舉出例如使用鉤離子的方法[Cohen，S.N.etal.:Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69:2110-2114(1972)]或電穿孔法等。使用酵母作為宿主時，可采用例如釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、畢赤酵母等。啟動子只要是可在酵母中表達的并無特別限定，例如可舉出gall啟動子、gallO啟動子、熱休克蛋白啟動子、MFctl啟動子、PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子、A0X1啟動子等。在酵母中導入載體的方法沒有特別限定，例如可舉出電穿孔法[Becker，D.M.etal.:Methods.Enzymol.，194:182—187(1991)]、原生質(zhì)球法[Hinnen，A.etal.:Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，75:1929-1933(1978)]、醋酸鋰法[Itoh，H.:J.Bacteriol.，153:163-168(1983)]等。還可采用利用T7啟動子等在試管內(nèi)合成蛋白質(zhì)的無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)。無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)可使用例如PURESYSTEM(后基因組研究所)等。由于在細胞系中合成蛋白質(zhì)必須要培養(yǎng)細胞，除了操作繁瑣且存在生物污染的問題，還有合成的蛋白質(zhì)引起的培養(yǎng)細胞系的繁殖阻礙問題。對此相對，無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(1)取用活細胞時產(chǎn)生的所有問題(培養(yǎng)細胞的繁瑣等)均可避免；(2)也會產(chǎn)生對細胞來說有毒的蛋白質(zhì)；(3)操作比較簡單，可在短對間內(nèi)獲得目標蛋白質(zhì)，因此使高通量成為可能；(4)可簡單的進行非天然型氨基酸的導入因此目標蛋白質(zhì)的標記也變得容易。5.合成熒光素酶的純化測定合成的變異型螢火蟲熒光素酶的dATP活性時，有必要從該合成系統(tǒng)中純化蟲熒光酶蛋白質(zhì)。特別在此時，必須完全除去包含在各合成系統(tǒng)中的ATP等熒光素酶的底物的成分。為了去掉將上述成分，回收熒光素酶，可使用透析、超濾、各種柱層析等已知的純化系統(tǒng)。合成的熒光素酶的量為少量(500ng左右)時在熒光素酶蛋白質(zhì)中導入標簽標記序列，利用針對該標簽序列的親和柱層析回收熒光素酶的方法。例如，在無細胞蛋白質(zhì)系統(tǒng)的純系統(tǒng)(PURESYSTEM)中合成熒光素酶時，可導入鏈霉素-標簽(Strep-tag)序列(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys:序列編號27)、Flag標簽序歹寸(Asp—Tyr—Lys—Asp—Asp—Asp—Asp—Lys:序歹'J編號28)等作為才示簽序列，便可回收熒光素酶。6.合成熒光素酶的活性測定(活性評價方法)儀，優(yōu)選內(nèi)置試劑自動分注功能的裝置。變異型熒光素酶的活性檢測的總體流程本發(fā)明中的變異型熒光素酶的活性測定法在圖2中集中表示。本發(fā)明大致分為3個步驟，在步驟l中合成變異型熒光素酶(優(yōu)選在無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中)。在步驟2中使用鏈霉素標簽柱進行合成熒光素酶的純化，將合成反應溶液中含有的內(nèi)源性ATP完全除去。步驟3中測定對于dATP和ATP的合成熒光素酶活性。各步驟可以連續(xù)進行，整個步驟可以在大約2個半小時內(nèi)完成進行。因此是評價缺乏穩(wěn)定性的熒光素酶的非常有效的方法。有關本活性測定法的內(nèi)容在以下的實施例中有更具體的記載。實施例以下基于實施例對本發(fā)明進行具體說明，但本發(fā)明并不局限于以下實施例。實施例l:422氨基酸變異型熒光素酶的制備和活性測定(1)熒光素酶基因中標簽序列的導入在pURE2載體(后基因組研究所)中摻入野生型北美螢火蟲熒光素酶基因的pURE2Luc載體的熒光素酶基因的C末端導入鏈霉素標簽序列。使用反轉(zhuǎn)錄PCR作為導入方法。以在環(huán)狀模板DNA(pURE2Luc載體)上欲倒導入標簽序列的部位(熒光素酶的C末端)作為基準設計l組引物使其序列完全配對。此時將欲在引物的5，末端導入的標簽序列上附加錨定序列。在該條件下進行PCR，擴增在末端附加錨定序列的2條直鏈狀的DM鏈。通過自身連接反應使該產(chǎn)物結(jié)合，獲得在期望部位導入了錨定序列(Tag序列)的環(huán)狀的2條鏈DNA。具體而言使用下述序列作為此次的引物。以下所有的引物均使用SIGMAGENOSYS公司合成的引物。Luc-cStr印IF:5'-TCGAAAAATAAAAGCTTTAGCATMCCCCT-3'(序列編號1)Luc-cStr印IR:5'-ACTGCGGGTGGCTCCACAATTTGGACTTTCCGCCC-3'(序列編號2)下劃線部分為編碼欲導入的鏈霉素標簽序列的堿基序列。另外，該堿基序列在自身連接反應正確進行的情況下重新形成限制性內(nèi)切酶的BstBI序列(TTCGAA)。在反轉(zhuǎn)錄PCR的反應液中加入20fmol的pURE2Luc、Luc-cStrepIF引物和Luc-cStrepIR引物各15pmo1、2.5UKOD-PlusVer.2聚合酶(東洋紡)、5juL10xKOD緩沖液、3jaL25mMMgS04、5jaL2.OmM各dNTP，使之總量為50yL。在94X:下進行2分鐘擴增反應后，以98C下IO秒、60C下30秒、68C下4分鐘的條件重復進行循環(huán)反應40次，然后在68'C下反應3分鐘。使用微芯片電泳裝置(日立化成)確認反應后的擴增產(chǎn)物。確認除了目的DNA以外其他DNA鏈并未擴增，在殘留的49ML樣品中加入1jiLDpnl(20U//JL:NEB公司)，在37C下反應1小時，分解模板質(zhì)粒。進一步使用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen社)純化該反應物.將5jLiL的純化反應物與14juLT4激酶(TaKaRa)1mL和Ligationhigh液(東洋紡)混合，在37匸下反應1小時。進一步加入15pLLigationhigh液后，在16'C下反應30分鐘進行自身連接反應。將5mL自身連接反應液與40juL感受態(tài)細胞MAXEfficiencyDH5a(Invitrogen)混合，進行在42X:下40秒的熱休克反應，進行大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。進一步將該反應液接種至LB-amp(LBBROTHBASE:Invitrogen、瓊脂和光純藥、青霉素SIGMA公司)板上，在3rc下溫浴一晚上，形成大腸桿菌的集落。采取其中幾個增殖集落，以l.50^的1^-amp培養(yǎng)基培養(yǎng)l晚上。使用PlasmidMiniKit(Qiagen)從培養(yǎng)的大腸桿菌純化質(zhì)粒。使用限制性內(nèi)切酶BstBI處理純化的質(zhì)粒的一部分，確認導入編碼鏈霉素標簽的DNA序列。進一步進行質(zhì)粒的熒光素酶部分的全長測序分析，確認正確鏈霉素標簽DNA序列的導入和有無PCR錯誤。(2)含有變異型熒光素酶基因的重組栽體的制備以在C末端與鏈霉素標簽序列結(jié)合的含有野生型北美熒光素酶基因的pURE2LucC-Strep載體為模板，將編碼422位的Asp的基因替換為位點特異性DNA的堿基序列以使其改變?yōu)楸彼?Ala)、天冬酰胺(Asn)、絲氨酸(Ser)。該替換4吏用Invitrogen^^司的GeneTailor定點突變系統(tǒng)按照操作指南進行。在變異導入用引物中使用下述序列。另外，對變異導入后的各載體進行測序分析，確認變異的導入及有無PCR錯誤。Asp422—R:5'-TCCAGAATGTAGCCATCCATCCTTGTCAATCA-3'(序列編號3)Asp422Ala-F:5，-ATGGATGGCTACATTCTGGAgcgATAGCTTACTGG-3'(序列編號4)Asp422Asn-F:5，-ATGGATGGCTACATTCTGGAaacATAGCTTACTGG-3'(序列編號5)Asp422Ser-F:5'-ATGGATGGCTACATTCTGGAagcATAGCTTACTGG-3'(序列編號6)(3)無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中變異型熒光素酶的合成研究所)的模板。按照操作指南將lpmol的各載體作為模板在32t:下進行l(wèi)小時合成反應。另外，在該合成反應中加入分子伴倡DnaK、DnaJ、GrpE(后基因組研究所)使其終濃度分別達到4、2、2juM。通過蛋白質(zhì)印跡確認從熒光素酶的合成反應正常進行完成。(4)合成熒光素酶的活性測定測定了合成的熒光素酶的ATP活性。在測定中使用本研究室開發(fā)的在檢測部分采用光電二極管的小型基因分析裝置。混合5juLPURESYSTEM反應后的溶液和O.5jaLlOmMATP液、及50ML2xC緩沖液(120mMTricine、4mMEDTA、40mMMg-acetate、pH7.5)，以蒸餾水(DW)配制為總量99uL后，分裝至小型基因分析裝置的反應槽內(nèi)。另外，將50mM蟲熒光素(SIGMA)溶液設置于裝置的分裝裝置上，通過每l次測定向反應槽內(nèi)分裝注入l)aL啟動酶反應，測定各變異型熒光素酶發(fā)出的熒光。在比較各測定的熒光素酶活性時，使用熒光強度(V)的最大值。其結(jié)果為，Asp422被替換為Ala、Asn、Ser的熒光素酶的熒光強度均為O.01(V)以下，低至檢測噪音限度水平，喪失了對ATP的活性。因此證明該422位的Asp為對于熒光素酶的活性必不可少的氨基酸。實施例2:421氨基酸變異型焚光素酶的制備和活性測定(1)含有變異型熒光素酶基因的重組載體的制備以在C末端結(jié)合鏈霉素標簽序列的含有野生型北美螢火蟲焚光素酶基因的pURE2LucC-Strep載體為模板，將編碼421位的Gly的基因替換為位點特異性DNA的堿基序列以使其改變?yōu)槠渌?9種類的氨基酸。該替換使用Invitrogen公司的GeneTailor定點突變系統(tǒng)按照操作指南進行。使用的變異導入用引物序列分別如下所述。另外，對變異導入后的各載體進行測序分析，確認變異的導入及有無PCR錯誤。Gly421-R:5'Gly421Ala-FGly421Arg-FGly421Asn-FGly421Asp-FGly421Cys-FGly421Gln-FGly421Glu-FGly421His-FGly421Ile-FGly421Leu-FGly421Lys-FGly421Met-FGly421Phe-FGly421Pro-FGly421Ser-FGly421Thr-FGly421Trp-FGly421Tyr-FGly421Val-F-AGAATGTAGCCATCCATCCTTGTCAATCAAGG-3'5'-AGGATGGATGGCTACATTCTgcgGACATAGCTTAC-3'5'-AGGATGGATGGCTACATTCTcgcGACATAGCTTAC-3，5'-AGGATGGATGGCTACATTCTaacGACATAGCTTAC-3'5'-AGGATGGATGGCTACATTCTgatGACATAGCTTAC-3，5'-AGGATGGATGGCTACATTCTtgcGACATAGCTTAC-3，5'-AGGATGGATGGCTACATTCTcagGACATAGCTTAC-3，5'-AGGATGGATGGCTACATTCTgagGACATAGCTTAC-3'5'-AGGATGGATGGCTACATTCTcatGACATAGCTTAC-3'5'-AGGATGGATGGCTACATTCTattGACATAGCTTAC-3'5'-AGGATGGATGGCTACATTCTctgGACATAGCTTAC-3'5'-AGGATGGATGGCTACATTCTaaaGACATAGCTTAC-3'5'-AGGATGGATGGCTACATTCTatgGACATAGCTTAC-3'5'-AGGATGGATCGCTACATTCTtttGACATAGCTTAC-3'5'-AGGATGGATGGCTACATTCTccgGACATAGCTTAC-3'5'-AGGATGGATGGCTACATTCTagcGACATAGCTTAC-3'5'-AGGATGGATGGCTACATTCTaccGACATAGCTTAC-3'5'-AGGATGGATGGCTACATTCTtggGACATAGCTTAC-3'5'-AGGATGGATGGCTACATTCTtatGACATAGCTTAC-3，5'-AGGATGGATGGCTACATTCTgtgGACATAGCTTAC-3'(序列編號7)(序列編號8)(序列編號9)(序列編號10)(序列編號11)(序列編號12)(序列編號13)(序列編號14)(序列編號15)(序列編號16)(序列編號17)(序列編號18)(序列編號19)(序列編號20)(序列編號21)(序列編號22)(序列編號23)(序列編號24)(序列編號25)(序列編號26)(2)無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的變異性熒光素酶的合成使用各載體作為無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的PURESYSTEM(后基因組研究所)的模板。按照操作指南將lpmol的各載體作為模板在32。C下進行l(wèi)小時合成反應。另外，在該合成反應中加入分子伴倡DnaK、DnaJ、GrpE(后基因組研究所)，使其終濃度分別達到4、2、2juM。和實施例1一樣測定5iuL份反應后溶液的ATP活性。(3)合成熒光素酶的純化使用鏈霉素標簽親和層析柱對在PURESYSTEM中合成的附加鏈霉素標簽序列的各熒光素酶進行純化。使用Strep-TactinSpinColumn(IBA公司)作為親和層析柱。首先，在層析柱中加入附帶的緩沖液W(lOOmMTris/HClpH8、150raMNaCl、lmMEDTA)500juL,在1800rpm下離心30秒洗滌柱子。再次重復該操作。然后為了使熒光素酶與柱子結(jié)合，將含有合成的熒光素酶的溶液(約45iiL)加入至離心柱在1800rpm下離心30秒。為了進一步提高結(jié)合量，再l次將濾液加至離心柱上，同樣進行離心。丟棄濾液后，為了洗掉附著于層析柱上的目的以外的產(chǎn)物，在離心柱上加入100juL緩沖液W,在13000rpm下離心30秒。重復該操作3次。將離心柱移至其他新的管中后，為了洗脫結(jié)合于柱子上的熒光素酶，加入150jaL緩沖液BE(lOOmMTris-HClpH8、150mMNaCl、lmMEDTA、2mMD-biotin)在1800rpm下離心30秒，在l3000rpm下離心15秒，回收含有溶洗脫的熒光素酶的濾液。同樣加入50jiiL緩沖液BE，再次進行該操作，共計獲得2GGjaL濾液。(4)合成熒光素酶的活性測定為了測定純化的濾液中熒光素酶的活性配制了測定溶液。將80mL濾液分裝至2根管中，分別加入10jLiL10xC緩沖液(600mMTricine，20mMEDTA，200raMMg-acetate,pH7,5)和1jjLlOOmMATP(終濃度lmM)或ljuL100mM的dATP(終濃度lraM)作為底物，以蒸餾水配制為99juL后，分裝至小型基因分析裝置的反應槽內(nèi)。另外，將50mM蟲熒光素(SIGMA)溶液設置于裝置的分裝裝置上，通過每l次測定向反應槽內(nèi)分裝注入ljaL開始酶反應，測定各變異型熒光素酶發(fā)出的熒光。在比較各測定的熒光素酶活性時，使用發(fā)光強度的最大值進行比較。圖3為將合成熒光素酶后進行純化，以ATP和dATP為底物分別測定熒光的結(jié)果進行了圖表化的圖。橫軸為反應時間(秒)、縱軸為熒光強度(V)。作為例子，(A)中顯示測定野生型北美螢火蟲熒光素酶的結(jié)果，'(B)中顯示測定變異型熒光素酶(Gly421Ser)的結(jié)果。與野生型熒光素酶相比變異型熒光素酶(Gly421Ser)中，明顯可見dATP/ATP0O的值的降低。該測定涉及421位的氨基酸的所有的變異型而進行。取代421位氨基酸的所有變異型熒光素酶的活性在表1中總結(jié)。編號l的Gly為野生型熒光素酶的值表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表l的"dATP/ATP(%)，，為對dATP活性與對ATP活性的比率，從編號6(Cys)到編號IO(Asp)的氨基酸為dATP/ATPOO的值在野生型的l/2以下，但比l/3更高的值的變異型氨基酸；從編號ll(Ser)到編從編號17(Trp)到編號20(Pro)為dATP/ATP的值無法檢出。表l的"ATP活性"指合成熒光素酶以后，其粗合成液中包含的熒光素酶的ATP活性的值，表示以野生型的Gly421的活性為100時的比值。表l的"種類"表示上述"實施發(fā)明的的最佳形態(tài)"中表示的2個種類的組，對于著重對ATP活性的維持的(a)的組中Gly421Ser為最優(yōu)選的形態(tài)；對于著重dATP/ATP比率的(b)組中Gly421Asn為最佳形態(tài)。產(chǎn)業(yè)實用性通過利用本發(fā)明的變異型熒光素酶，可以使用dATP作為在焦磷酸測序時的DNA聚合酶底物。因此，本發(fā)明可被利用于必須進行堿基序列分析的醫(yī)學、生命科學等領域內(nèi)。序列表全文序列編號l序列編號2序列編號3序列編號4序列編號5序列編號6序列編號7序列編號8序列編號9序列編號10:序列編號ll:序列編號12:序列編號13:序列編號14:序列編號15:序列編號16:序列編號17:序列編號18:序列編號19:序列編號20:序列編號21:序列編號22:序列編號23:引物(Luc-cStrepIF)引物(Luc-cStrepIR)引物(Asp422-R)引物(Asp422Ala-F)引物(Asp422Asn-F)引物(Asp422Ser-F)引物(Gly421-R)引物(Gly421Ala-F)引物(Gly421Arg-F)引物(Gly421Asn-F引物(Gly421Asp-F引物(Gly421Cys-F引物(Gly421Gln-F引物(Gly421Glu-F引物(Gly421His-F引物(Gly421Ile-F引物(Gly421Leu-F引物(Gly421Lys-F引物(Gly421Met-F引物(Gly421Phe-F引物(Gly421Pro-F引物(Gly421Ser-F引物(Gly421Thr-F序列編號24序列編號25序列編號26序列編號27序列編號28引物(Gly421Trp-F)引物(Gly421Tyr-F)引物(Gly421Val-F)鏈霉素標簽序列Flag-標簽序列序列表〈110>HITACHI,LTD.〈120〉變異型螢火蟲熒光素酶<130〉H750402<160>30<170>Patentlnversion3.4〈210>1<211>30<212>DNA<213〉人.T.序列<220><223>Inventor:Tsunoda,Hiroyuki;Kanbara，Hideki<220><223>引物(Luc-cStr印IF)<400>1tcgaaaaataaaagctttagcataacccct30<210〉2<211>35〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223〉引物(Luc-cStr印IR)〈400〉2actgcgggtggctccacaatttggactttccgccc35<210>3<211>32〈212>DNA<213>人工序列<220><223>引物(Asp422-R)〈■〉3tccag犯tgtagccstccatccttgtcaatca32<210>4〈211〉35〈212〉DNA'<213〉人工序列<220〉<223〉引物(Asp422Ala-F)<400>4atggatggctacattctggagcgatagcttactgg35<210〉5〈211>35<212>DNA<213〉人工序列〈220〉〈223〉引物(Asp422Asn-F)<400>5atggatggctacattctggaaacatagcttactgg35<210>6<211〉35<212>DNA<213>人工序列<220>〈223>引物(Asp422Ser-F)<400>6atggatggctacattctggaagcatagcttactgg35<210>7<211>32〈212>腿<213〉人工序列<220〉<223〉引物(Gly421-R)<400>7agaatgtagccatccatccttgtcaatcaagg32〈210〉8<211〉35<212〉腿<213〉人工序列<220〉<223〉引物(Gly421Ala-F)《400〉8a,gg.Ht.gg;itggctacattctgcggficiitfcigcUac35<210〉9<2丄丄〉35<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223〉引物(Gly421Arg-F)〈400〉9aggatggatggctacattctcgcgacatagcttac35<210〉10<211〉35<212〉DNA<2丄3〉人工序列〈220〉<223〉引物(Gly421Asn-F)<400>10aggatggatggctacattctaacgacatagcttac35<210>11<211〉35<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223〉引物(Gly421Asp-F)<400〉11aggatggatggctacattctgatgacatagcttac35<210>12〈211>35<212〉DNA<213〉人丄序列<220><223>引物(Gly421Cys-F)<400>12叫gatgg3tggctiac3ttcttgcg3catagcttiic35<210>13<211>35<2〗2〉DNA<213〉人:l:序列<223>引物(Gly421Gln-F)<400〉13aggatggatggctacattctcaggacatagcttac35<210>1435DMA<213>人工序列<220〉<223〉引物(Gly421Glu—F)<400〉14aggatggatggctacattctgaggacatagcttac35<210〉15<211>35<212>薩<213〉人工序列<223〉引物(Gly421His-F)<400〉15aggatggatggctacattctcatgacatagcttac35<210>16<211>35<212>腿<213〉人工序列<220〉<223〉引物(Gly421Ile-F)<400〉16aggatggatggctacattctattgacatagcttac35<210〉17<211>35<212〉DNA<213>人工序列〈220〉<223>引物(Gly421Leu-F)<400>17aggatggatggctacattctctggacatagcttac35<210〉18<211>35〈212〉DNA〈213〉人工序列<220>〈223>引物(Gly421Lys-F)<400>18aggatggatggctacattctaaagacatagcttac35<210>19〈211〉35<212〉DNA<213〉人工序列<220><223>引物(Gly421Met-F)<400>19aggatggatggctacattctatggacatagcttac35<210〉20<211>35<212>腿<213>人工序列〈220〉<223>引物(Giy421Phe-F)<400〉20aggatggatggctacattcttttgacatagcttac35<210〉21<2]1>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物(Gly421Pro-F)<400>21aggatggatggctacattctccggacatagcttac35<210>22<211>35〈212>DNA<213>人工序列<220〉<223〉引物(Gly421Ser-F)<■>22aggatggatggctacattctagcgacatagcttac35<210>23<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物(Gly421Thr-F)<400>23ag'gatggatggctacattctaccgacatagcttac35<210〉24<211〉35<212>腿<213〉人工序列<220><223>引物(Gly421Trp-F)<400>24aggatggatggctacattcttgggacatagcttac35<210>25<211>35<212>DNA<213>人工序列〈220〉<223>引物(Gly421Tyr-F)<400>25aggatggatggctacgittcttatgac3tagcttac35<210〉26<211>35<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223>引物(Gly421Val-F)<400〉26aggatggatggctacattctgtggacatagcttac35<2〗0>27<211>8<212>PRT〈213〉人工序列<220〉<223>鏈霉素標簽序列<400〉27TrpSerHisProGinPheGluLys15<210>28<211>8<212>PRT<213〉人工序列<220><223>Flag標簽序列<400〉28AspTyrLysAspAspAspAspLys15<210〉29<211>1653〈212〉DNA〈213〉北美螢火蟲(Photinuspyralis)<220〉<221〉CDS<222〉(1)..(1653)<223〉<400>29iUgg肌gacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatcct48MetGluAspAlaLysAsnlieLysLysGlyProAlaProPheTyrPro151015etagaggatggaaccgetggagagcaactgcataaggetatgaagaga%LeuGluAspGlyThrAlaGlyGluGinLeuHisLysAlaMetLysArg202530tacgccctggttcctggaacaattgettttacagatgcacatategag]44TyrAlaLeuValProGlyThrlieAlaPheThrA印AlaHislieGlu354045gtgaacateacgtacgcg'gaatacttcgaaatgtecgtteggttggca192ValAsnlieThrTyrAlaGluTyrPheGluMetSerValArgLeuAla505560gaagetatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaategtcgta240GluAlaMetLysArgTyrGlyLeuAsnThrAsnHisArglieValVal65707580tgca.gt.gaaaa.ctctcttcaattctttatgccggtgttgggcg'cgtta288CysSerGluAsnSerLeuGinPhePheMetProValLeuGlyAlaLeu859095tttateggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgt336Phe丄leGlyValAlaValAlaProAlaAsnAsplieTyrAsnGluArg100105110gaattgetcaacagtatgaacatttegcagcctaccgtagtgtttgtt384GluLeuLeuAsnSerMetAsnlieSerGinProThrValValPheVal115120125tecaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaaattacca432<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>cgacaaggatatgggetcactgagactacateagetattctgattaca1056ArgGinGlyTyrGlyLeuThrGluThrThrSerAlalieLeulieThr340345350cccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattt1104l)roGluGlyAspAspLysProGlyAlaValGlyLysValValProPhe355360365Utgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgtt1152PheGluAlaLysValValAspAspThrGlyLysThrLeuGlyVal370375380aatcagagaggcgaattatgtgtcagaggacctatgattatgtecggt1200AsnGinArgGlyGluLeuCysValArgGlyProMetlieMetSerGly385390395400tatgta肪caatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatgga1248TyrValAsnAsnProGluAlaThrAsnAlaLeulieAspLysAspGly405410415tggetacattctggagacatagettactgg'gacgaagacgaacacttc1296TrpLeuHisSerGlyAsplieAlaTyrTrpAspGluAspGluHisPhe420425430ttcatagttgaccgcttgaagtctttaattaaatac犯aggatatcag1344PhelieValAspArgteuLysSerLeulieLysTyrLysGlyTyrGin435440445gtggcccccgetgaattggaategatattgttacaacaccccaacate1392ValAlaProAlaGluLeuGluSerlieLeuLeuGinHisProAsnlie450455460ttcgacgcgggcgtggcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaactt1440PheAspAlaGlyValAlaGlyLeuProAspAspAspAlaGlyGluLeu465470475480cccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaa1488ProAlaAlaValValValLeuGluHisGlyLysThrMetThrGluLys485490495gagategtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttg1536GlulieValAspTyrValAlaSerGinValThrThrAlaLysLysLeu500505510cgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccgga1584ArgGlyGlyValValPheValAspGluValProLysGlyLeuThrGly515520525aaaetcgacgcaagaaaaateagagagateetcataaaggccaagaag1632LysLeuAspAlaArgLyslieArgGlulieLeulieLysAlaLysLys530535540ggcggei朋gtec站3ttgtaa1653GlyGlyLysSerLysLeu545550<210>30<21j>550<212>PRT<213〉北美螢火蟲<400〉30MetGluAspAlaLysAsnlieLysLysGlyProAlaProPheTyrPro151015LeuGluAspGlyThrAlaGlyGluGinLeuHisLysAlaMetLysArg202530TyrAlaLeuValProGlyThrlieAlaPheThrAspAlaHislieGlu354045ValAsnlieThrTyrAlaGluTyrPheGluMetSerValArgLeuAla505560GluAlaMetLysArgTyrGlyLeuAsnThrAsnHisArglieValVal65707580CysSerGluAsnSerLeuGinPhePheMetProValLeuGlyAlaLeu859095PhelieGlyValAlaValAlaProAlaAsnAsplieTyrAsnGluArg100105U0GluLeuLeuAsnSerMetAsnlieSerGinProThrValValPheVal115120125SerLysLysGlyLeuGinLyslieLeuAsnValGinLysLysLeuPro130135140lielieGinLyslielielieMetAspSerLysThrAspTyrGinGly145150155160PheGinSerMetTyrThrPheValThrSerHisLeuProProGlyPhe165170175AsnGluTyrAspPheValProGluSerPheAspArgAspLysThrlie180185190AlaLeu丄leMetAsnSerSerGlySerThrGlyLeuProLysGlyVal195200205AlaLeuProHisArgThrAlaCysValArgPheSerHisAlaArgAsp210215220ProliePheGlyAsnGinlielieProAspThrAlalieLeuSerVal225230235240ValProPheHisHisGlyPheGlyMetPheThrThrLeuGlyTyrLeu245250255lieCysGlyPheArgValValLeuMetTyrArgPheGluGluGluLeu260265270PheLeuArgSerLeuGinAspTyrLyslieGinSerAlaLeuLeuVal275280285ProThrLeuPheSerPhePheAlaLysSerThrLeulieAspLysTyr290295300AspteuSerAsnLeuHisGlulieAlaSerGlyGlyAlaProLeuSer305310315320LysGluValGlyGluAlaValAlaLysArgPheHisLeuProGlylie325330335ArgGinGlyTyrGlyLeuThrGluThrThrSerAlalieLeulieThr<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>GlyGlyLysSerLysLeu545550權(quán)利要求1.變異型的螢火蟲熒光素酶，是特征為與野生型螢火蟲熒光素酶相比，對dATP活性與對ATP的活性的比率(dATP/ATP)降低的變異型螢火蟲熒光素酶，其特征為，通過同源性分析，特定為與野生型北美螢火蟲(Photinuspyralis)熒光素酶的氨基酸序列的第421位的甘氨酸相當?shù)陌被岜粯O性氨基酸置換。2.權(quán)利要求1記栽的變異型螢火蟲熒光素酶，其具有野生型北美螢火蟲(Photinuspyralis)熒光素酶的氨基酸序列的第421位的甘氨酸被極性氨基酸所置換的氨基酸序列。3.權(quán)利要求1記載的變異型螢火蟲熒光素酶，其具有野生型源氏螢(Luciolacruciata)熒光素酶或野生型平家螢(Luciolalateralis)熒光素酶的氨基酸序列的第423位的甘氨酸被極性氨基酸所置換的氨基酸序列。4.權(quán)利要求1記栽的變異型螢火蟲熒光素酶，與野生型相比較，對dATP活性與對ATP的活性的比率(dATP/ATP)為1/2以下，且ATP活性在1/2以上。5.權(quán)利要求4記載的變異型螢火蟲熒光素酶，前述極性氨基酸為選自絲氨酸、賴氨酸、天冬氨酸及組氨酸中選擇的任一個。6.權(quán)利要求1記載的變異型螢火蟲熒光素酶，與野生型相比較，對dATP活性與對ATP的活性的比率(dATP/ATP)為1/3以下，且ATP活性為1/3以上至不到1/2。7.權(quán)利要求6記載的變異型螢火蟲熒光素酶，前述極性氨基酸為精氨酸或天冬酰胺。8.編碼權(quán)利要求l-7中任一項記載的變異型安火蟲熒光素酶的基因。9.含有編碼權(quán)利要求8記載的變異型螢火蟲熒光素酶的基因的重組載體。10.變異型螢火蟲熒光素酶的活性評價方法，其包括以下步驟合成與野生型螢火蟲熒光素酶相比，對dATP活性與對ATP的活性的比率(dATP/ATP)降低的變異型螢火蟲熒光素酶的步驟、從合成的變異型螢火蟲熒光素酶除去內(nèi)生性ATP，并純化的步驟、及分別測定純化的變異型螢火蟲熒光素酶對于ATP和dATP的活性的步驟。11.權(quán)利要求10記載的方法，變異型螢火蟲熒光素酶在無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中合成。12.權(quán)利要求10或11記載的方法，變異型螢火蟲熒光素酶為權(quán)利要求l~7中任一項記載的變異型螢火蟲熒光素酶。全文摘要通過本發(fā)明可提供一種為了實現(xiàn)可在焦磷酸測序中使用dATP作為DNA聚合酶的底物，而設計的可在維持對ATP的活性的同時，僅僅降低對dATP活性的改變了底物特異性的變異型熒光素酶。該變異型的螢火蟲熒光素酶，是與野生型螢火蟲熒光素酶相比，對ATP活性與對dATP的活性的比率(dATP/ATP)降低的變異型螢火蟲熒光素酶，其特征為，通過同源性分析，與野生型北美螢火蟲(Photinuspyralis)熒光素酶的氨基酸序列上421位的甘氨酸相當?shù)奶囟ǖ陌被岜粯O性氨基酸替換。文檔編號C12N15/53GK101397550SQ200810211098公開日2009年4月1日申請日期2008年8月20日優(yōu)先權(quán)日2007年9月26日發(fā)明者神原秀記,角田弘之申請人:株式會社日立制作所