專利名稱：一種具有增強(qiáng)免疫功能的有機(jī)分子肽乳及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有增強(qiáng)免疫功能的有機(jī)分子肽乳及其制備方法。
背景技術(shù)：
分子免疫佐劑是指本身就具有免疫刺激效應(yīng)的DNA (即CpGDNA)和可 在體內(nèi)表達(dá)各種免疫相關(guān)分子的重組質(zhì)粒DNA 。這些免疫相關(guān)分子包括細(xì)胞 因子、免疫共剌激分子、免疫剌激調(diào)節(jié)分子、及其新型分子佐劑補(bǔ)體C3d等。
CpGDNA,即含CpG基序的DNA或寡核苷酸(ODN)，統(tǒng)稱為CpG 0DN。目前 研兔表明，含CpG基序的細(xì)菌DNA和ODN可以激活多種免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)其分泌 不同的細(xì)胞因子及免疫球蛋白。在激發(fā)非特異性免疫應(yīng)答、增強(qiáng)抗原特異性 免疫應(yīng)答及調(diào)控免疫應(yīng)答類型(Thl及Th2型)等方面發(fā)揮重要作用。CpG 0DN能弓i起B(yǎng)細(xì)胞分化,直接刺激B細(xì)胞分泌IL-6、 IL-10等細(xì)胞因子和免疫 球蛋白，誘導(dǎo)B細(xì)胞表面共刺激分子的表達(dá)，包括MHC II 、 B7-1和B7-2等。CpG 0DN能直接激活抗原提呈細(xì)胞(APC),包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì) 胞，誘導(dǎo)其產(chǎn)生IL-12 、 TNF-a等Thl型為主的細(xì)胞因子，并可上調(diào)MHC和 共刺激分子的表達(dá)。CpG 0DN能與APC分泌的IL-12和IL-18協(xié)同剌激NK細(xì) 胞分泌IFN- Y ，提高其溶菌活性，IFN- Y反過(guò)來(lái)又可以激活A(yù)PC。 CpG 0DN現(xiàn)已 應(yīng)用于誘導(dǎo)天然保護(hù)性免疫,預(yù)防感染，作為T(mén)hl極化佐劑、核酸疫苗以及 基因治療中。
細(xì)胞因子是體內(nèi)免疫細(xì)胞或非免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一組具有廣泛生物活性 的異質(zhì)性肽類調(diào)節(jié)因子，在體內(nèi)能激活和調(diào)節(jié)免疫活性細(xì)胞，對(duì)免疫應(yīng)答的 產(chǎn)生和調(diào)節(jié)具有重要作用。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子(如GM-CSF、 IFN-Y、 IL-2、 IL-4和IL-12)具有免疫佐劑作用，可不同程度的增強(qiáng)DNA疫苗 的免疫效果，并可引導(dǎo)機(jī)體免疫朝有利的方向轉(zhuǎn)化。共刺激分子和免疫刺激 調(diào)節(jié)因子的質(zhì)粒也能夠加強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。在天然免疫應(yīng)答及獲得性免疫 應(yīng)答過(guò)程中，細(xì)胞因子表現(xiàn)出重要的功能，可以維持機(jī)體的生理平衡，抵抗 病原微生物的侵襲，防止腫瘤發(fā)生。
5有機(jī)農(nóng)業(yè)包括所有能促進(jìn)環(huán)境、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)良性發(fā)展的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)。 這些系統(tǒng)將農(nóng)地土壤肥力作為成功生產(chǎn)的關(guān)鍵。通過(guò)尊重植物、動(dòng)物和景觀 的自然能力，達(dá)到使農(nóng)業(yè)和環(huán)境各方面質(zhì)量都最完善的目標(biāo)。有機(jī)農(nóng)業(yè)利用 強(qiáng)有力的自然規(guī)律來(lái)增加農(nóng)業(yè)產(chǎn)量和抗病能力。有機(jī)食品是以有機(jī)農(nóng)業(yè)生產(chǎn) 體系為前提，在其生產(chǎn)和加工過(guò)程中禁止使用農(nóng)藥、化肥、激素等人工合成 物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有增強(qiáng)免疫功能的有機(jī)分子肽乳；本發(fā)明 的另一 目的在于提供一種有機(jī)分子肽乳的制備方法。 本發(fā)明目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明具有增強(qiáng)免疫功能的有機(jī)分子肽乳，通過(guò)接種CpG 0DN-pUC質(zhì)粒 的免疫奶牛所產(chǎn)牛奶制得，其中構(gòu)建CpG 0DN-pUC質(zhì)粒添加的CpG基因序列 如SEQ ID NO: 1所示。
本發(fā)明有機(jī)分子肽乳的制備還包括如下步聚
1、 構(gòu)建CpG 0DN-pUC質(zhì)粒
采用pUC質(zhì)粒，將CpG基因克隆到pUC載體，構(gòu)建成重組CpG ODN-pUC 質(zhì)粒，CpG基因序列為
5， GCGCAGATCTGACGTTMCGTTMCGTTAGATCTMCGTTMCGTTMCGTTMCGTTA ACGTTGACGTTAGATCTCCGG 3，，如SEQ ID NO: 1所示；
2、 在大腸桿菌中擴(kuò)增CpG 0DN :
將含有上述方法構(gòu)建的CpG ODN-pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到非致病性大腸桿菌(五 cW力中，挑一個(gè)單菌落接種于含瓊脂、氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，其中每 1000ml LB培養(yǎng)基中含有l(wèi)ml氨芐青霉素和15-20g的瓊脂，于37 。C下培養(yǎng) 24-36小時(shí)，至飽和狀態(tài)；
3、 用堿裂解法提取CpG ODN-pUC質(zhì)粒，或采用商用質(zhì)粒提取試劑盒提
?。?br> 4、 用聚i二醇沉淀法對(duì)提取的CpG ODN-pUC質(zhì)粒進(jìn)行純化；
5、 電泳檢測(cè)CpG ODN-pUC質(zhì)粒的分子量，大于pUC載體100bp,并采用紫 外分光光度法測(cè)定CpG 0DN-pUC質(zhì)粒的含量，含有CpG ODN-pUC質(zhì)粒不少于l
6毫克，于-2(TC保存?zhèn)溆茫?br> 6、 免疫接種奶牛
選取有機(jī)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)喂養(yǎng)的奶牛，于分娩前一個(gè)月進(jìn)行免疫注射；注射方 法為取保存?zhèn)溆肅pG ODN-pUC質(zhì)粒，對(duì)奶牛進(jìn)行皮下注射，注射劑量為 0. l-10.0mg/頭，第14天加強(qiáng)一次，劑量為O. l-10.0mg/頭；
7、 每周收集一次免疫奶牛的血清、牛奶，采用檢測(cè)細(xì)胞因子的商用酶 聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定細(xì)胞因子IL-2, IL-6， IL-10， IL-12, IFN-y ， TNF-a的含 量，牛奶內(nèi)各細(xì)胞因子的含量是未免疫奶牛所產(chǎn)牛奶的2-IO倍，若細(xì)胞因子 含量達(dá)不到此水平，則再加強(qiáng)免疫接種一次，劑量為0.1-10.0mg/頭；
8、 上述含有多種細(xì)胞因子的牛奶即為本發(fā)明有機(jī)分子肽乳；或者在有
機(jī)分子肽乳中加入常規(guī)輔料制備成其他飲品。
本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建CpG ODN-pUC質(zhì)粒，在大腸桿菌中大量擴(kuò)增含CpG ODN基 因的質(zhì)粒，提取并純化質(zhì)粒，然后將CpG 0DN-pUC質(zhì)粒皮下注射入有機(jī)農(nóng)業(yè) 系統(tǒng)的高產(chǎn)奶牛體內(nèi)，激發(fā)了非特異性免疫應(yīng)答、增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答， 誘導(dǎo)其分泌各種細(xì)胞因子，通過(guò)對(duì)牛奶進(jìn)行細(xì)胞因子的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)奶牛的乳 汁中也含有各種細(xì)胞因子，最后把其乳汁收集包裝生產(chǎn)成"有機(jī)分子肽乳"。 飲用有機(jī)分子肽乳，就能夠提高機(jī)體免疫力，抗腫瘤，預(yù)防疾病增強(qiáng)體質(zhì)的 功效。本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于采用CpG ODN等分子佐劑，對(duì)有機(jī)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中的 奶牛進(jìn)行免疫接種，使其牛奶中含有多種對(duì)人體有益的細(xì)胞因子并制成有機(jī) 分子肽乳制品用于人類的保健，同時(shí)，免疫奶牛能夠自身提高免疫力，增加 常規(guī)免疫疫苗的應(yīng)答水平，進(jìn)一步提高奶牛的抗病防病能力，具有重要的理 論意義和應(yīng)用前景。
下述實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明但不限于本發(fā)明。 實(shí)驗(yàn)例l本發(fā)明所述CpG ODN質(zhì)粒對(duì)奶牛細(xì)胞因子的影響。
用實(shí)施例l的方法免疫乳牛，收集乳牛分娩后15天的牛乳5-10ml (每24小 時(shí)收集一次)，將收集到的乳樣于4"C 5000rpm離心15min，除去脂肪及沉淀， 于水浴鍋中升溫至35。C，添加O. 02%的凝乳酶(酶效價(jià)為50， 000) ， 35。C保溫 凝乳40min，凝乳后于5000rpm 4。C離心20min，收集乳清并分裝，-2(TC保存采用檢測(cè)細(xì)胞因子的商用酶聯(lián)免疫試劑盒，測(cè)定采集牛奶IL-2， IL-6， IL-IO， IL-12, IFN-y等含量，掌握免疫后細(xì)胞因子分泌的規(guī)律。
試驗(yàn)結(jié)果如表1，每頭含CpG ODN質(zhì)粒lmg和每頭含CpG ODN質(zhì)粒2mg 的注射奶牛，均可顯著提高奶牛血清、牛奶中細(xì)胞因子含量。
表1 CpG ODN質(zhì)粒對(duì)牛奶中細(xì)胞因子含量的影響
組別y-IFNIL-2IL-6IL-IOIL-12
CpG ODN注射組290600550630550
普通組140170165172170
結(jié)果表明，本發(fā)明所述的注射了CpG ODN質(zhì)粒的奶牛產(chǎn)出的牛奶與普通 牛奶相比，其中IL-2，IL-6， IL-10, IL-12, IFN-y等細(xì)胞因子的含量均有 明顯增長(zhǎng)。
實(shí)驗(yàn)例2本發(fā)明實(shí)施例l方法制得的肽奶的功能鑒定實(shí)驗(yàn)
將本發(fā)明實(shí)施例l所述的免疫牛分泌的牛奶經(jīng)138t:超高溫滅菌處理2s; 取SPF級(jí)昆明小鼠90只，4 6周齡，雌雄各半，隨機(jī)分為3組，每組30只；A 組給予有機(jī)分子肽乳l.O ml/天灌胃；B組給予純牛奶1.0ml/天灌胃，C組給 予生理鹽水1.0ml/天灌胃；連續(xù)灌胃15天后，調(diào)整初始細(xì)胞數(shù)約0.7X 106/ml，以細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)；連續(xù)灌胃30天后，以MTT 法觀察小鼠淋細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)；連續(xù)灌胃90天后，以MTT法觀察小鼠淋巴細(xì)胞 轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，結(jié)果如表2。
表2本發(fā)明肽乳對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖活力的影響
細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)15天30天90天
組別間(細(xì)胞計(jì)數(shù)X106)(MTT法OD值)(MTT法OD值)
A組72h5. 525 ±0. 7221,20.268±0.021,20. 389 ±0.0531,2
B組72h1.246 ±0.23930.158 ±0.00730.187 ± 0.00393
C組72h0.837±0.3190.142 ±0.0220.158 ±0.053
結(jié)果表明，灌胃15天時(shí)給予有機(jī)分子肽乳的A組小鼠與其他兩組小鼠相 比，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增多，灌胃30天和90天時(shí)給予有機(jī)分子肽乳的A組小鼠 與其他兩組小鼠相比，以MTT法觀察小鼠淋巴細(xì)胞的OD值差異明顯，由此可見(jiàn)， 本發(fā)明有機(jī)分子肽乳對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞的增值活力有顯著增強(qiáng)的作用。下述實(shí)施例均能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)例的有益效果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:本發(fā)明有機(jī)分子肽乳的制備工藝
1、 構(gòu)建CpG 0DN-pUC質(zhì)粒
采用pUC質(zhì)粒，將CpG基因克隆到pUC載體，構(gòu)建成重組CpG 0DN-pUC 質(zhì)粒，CpG基因序列為
5，GCGCAGATCTGACGTTMCGTTMCGTTAGATCTAACGTTMCGTTMCGTTAACGTTA ACGTTGACGTTAGATCTCCGG 3，，如SEQ ID NO: 1所示；
2、 在大腸桿菌中擴(kuò)增CpG 0DN :
將含有上述方法構(gòu)建的CpG ODN-pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到非致病性大腸桿菌(￡ 7力中，挑一個(gè)單菌落接種于含瓊脂、氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，其中每 1000ml LB培養(yǎng)基中含有l(wèi)nil氨芐青霉素和19g的瓊脂，于37 。C下培養(yǎng)35 小時(shí)，至飽和狀態(tài)；
3、 用堿裂解法提取CpG 0DN-pUC質(zhì)粒；
4、 用聚乙二醇沉淀法對(duì)提取的CpG 0DN-pUC質(zhì)粒進(jìn)行純化；
5、 電泳檢測(cè)CpG ODN-pUC質(zhì)粒的分子量，大于pUC載體100bp，并采用紫 外分光光度法測(cè)定CpG 0DN-pUC質(zhì)粒的含量，含有CpG 0DN-pUC質(zhì)粒不少于l 毫克，于-2(TC保存?zhèn)溆茫?br> 6、 免疫接種奶牛
選取有機(jī)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)喂養(yǎng)的奶牛，于分娩前一個(gè)月進(jìn)行免疫注射；注射方 法為取保存?zhèn)溆肅pG 0DN-pUC質(zhì)粒，對(duì)奶牛進(jìn)行皮下注射，注射劑量為 1.0-3.0mg/頭，第14天加強(qiáng)一次，劑量為1.0-3.0mg/頭；
7、 每周收集一次免疫奶牛的血清、牛奶，采用檢測(cè)細(xì)胞因子的商用酶 聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定細(xì)胞因子IL-2， IL-6， IL-10， IL-12， IFN-y等含量，牛 奶內(nèi)各細(xì)胞因子的含量是未免疫奶牛所產(chǎn)牛奶的2-10倍，若細(xì)胞因子含量達(dá) 不到此水平，則再加強(qiáng)免疫接種一次，劑量為1.0-3.0mg/頭；
8、 上述含有多種細(xì)胞因子的牛奶即為本發(fā)明有機(jī)分子肽乳。 實(shí)施例2:本發(fā)明有機(jī)分子肽乳的制備工藝
1、構(gòu)建CpG ODN-pUC質(zhì)粒采用pUC質(zhì)粒，將CpG基因克隆到pUC載體，構(gòu)建成重組CpG 0DN-pUC 質(zhì)粒，CpG基因序列為
5， GCGCAGATCTGACGTTMCGTTMCGTTAGATCTMCGTTMCGTTMCGTTMCGTTA ACGTTGACGTTAGATCTCCGG 3，，如SEQ ID NO: 1所示；
2、 在大腸桿菌中擴(kuò)增CpG ODN :
將含有上述方法構(gòu)建的CpG ODN-pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到非致病性大腸桿菌(￡ ②7力中，挑一個(gè)單菌落接種于含瓊脂、氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，其中每 1000ml LB培養(yǎng)基中含有l(wèi)ml氨節(jié)青霉素和16g的瓊脂，于37 'C下培養(yǎng)25
小時(shí)，至飽和狀態(tài)；
3、 采用商用質(zhì)粒提取試劑盒提取CpG ODN-pUC質(zhì)粒；
4、 用聚乙二醇沉淀法對(duì)提取的CpG ODN-pUC質(zhì)粒進(jìn)行純化；
5、 電泳檢領(lǐng)!!CpG ODN-pUC質(zhì)粒的分子量，大于pUC載體100bp，并采用紫 外分光光度法測(cè)定CpG ODN-pUC質(zhì)粒的含量，含有CpG ODN-pUC質(zhì)粒不少于l 毫克，于-2(TC保存?zhèn)溆茫?br> 6、 免疫接種奶牛
選取有機(jī)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)喂養(yǎng)的奶牛，于分娩前一個(gè)月進(jìn)行免疫注射；注射方 法為取保存?zhèn)溆肅pG ODN-pUC質(zhì)粒，對(duì)奶牛進(jìn)行皮下注射，注射劑量為 6.0-9.0mg/頭，第14天加強(qiáng)一次，劑量為6.0-9.0mg/頭；
7、 每周收集一次免疫奶牛的血清、牛奶，采用檢測(cè)細(xì)胞因子的商用酶 聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定細(xì)胞因子IL-2， IL-6， IL-10， IL-12， IFN-Y等含量，牛 奶內(nèi)各細(xì)胞因子的含量是未免疫奶牛所產(chǎn)牛奶的2-10倍，若細(xì)胞因子含量達(dá) 不到此水平，則再加強(qiáng)免疫接種一次，劑量為6.0-9.0mg/頭；
8、 在上述含有多種細(xì)胞因子的牛奶中加入常規(guī)輔料制備成其他飲品。
10Untitledl. ST25. txt
SEQUENCE LISTING
<110〉皇東震j大地乳業(yè)有限公司
〈120〉 一種具有增強(qiáng)免疫功能的有機(jī)分子肽乳及其 制備方法
〈130〉 000
〈160〉 1
〈170> Patentln version 3. 3
〈210> 1
〈211〉 80
〈212〉 腿 <213〉人工序列
〈400〉 1
gcgcagatct gacgttaacg ttaacgttag atctaacgtt aacgttaacg ttaax)gtta^ 60
cgttgacgtt agatctccgg
80
權(quán)利要求
1、一種含CpG基因序列的寡核苷酸CpG ODN，其中含有的CpG基因序列如SEQID NO1所示。
2、 一種具有增強(qiáng)免疫功能的有機(jī)分子肽乳，通過(guò)接種CpG ODN-PUC質(zhì) 粒的免疫奶牛所產(chǎn)牛奶制得，其特征在于構(gòu)建CpG ODN-pUC質(zhì)粒添加的CpG 基因序列如SEQ ID NO: 1所示。
3、 如權(quán)利要求2所述的有機(jī)分子肽乳，其特征在于該肽乳由如下方法制成(1) 構(gòu)建CpG ODN-PUC質(zhì)粒采用pUC質(zhì)粒，將CpG基因克隆到PUC載體，構(gòu)建成重組CpG ODN-pUC 質(zhì)粒，CpG基因序列為5，GCAGATCTGACGTTAACGTTAACGTTAGATCTAACGTTAACGTTAACGTTAACGTTA ACGTTGACGTTAGATCTCCGG 3，，如SEQ ID NO: 1所示；(2) 在大腸桿菌中擴(kuò)增CpG ODN :將含有上述方法構(gòu)建的CpG ODN-pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到非致病性大腸桿菌(￡ "h')中，挑一個(gè)單菌落接種于含瓊脂、氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，其中每 1000ml LB培養(yǎng)基中含有l(wèi)ml氨芐青霉素和15-20g的瓊脂，于37 'C下培養(yǎng) 24-36小時(shí)，至飽和狀態(tài)；(3) 用堿裂解法提取CpG ODN-pUC質(zhì)粒，或采用商用質(zhì)粒提取試劑盒提?。?4) 用聚乙二醇沉淀法對(duì)提取的CpG ODN-pUC質(zhì)粒進(jìn)行純化；(5) 電泳檢測(cè)CpGODN-pUC質(zhì)粒的分子量，大于pUC載體100bp，并采用 紫外分光光度法測(cè)定CpG ODN-pUC質(zhì)粒的含量，含有CpG ODN-pUC質(zhì)粒不少于 l毫克，于-20。C保存?zhèn)溆茫?6) 免疫接種奶牛選取有機(jī)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)喂養(yǎng)的奶牛，于分娩前一個(gè)月進(jìn)行免疫注射；注射方 法為取保存?zhèn)溆肅pG ODN-pUC質(zhì)粒，對(duì)奶牛進(jìn)行皮下注射，注射劑量為 0. 1-10.0mg/頭，第14天加強(qiáng)一次，劑量為O. 1-10.0mg/頭；(7) 每周收集一次免疫奶牛的血清、牛奶，采用檢測(cè)細(xì)胞因子的商用 酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定細(xì)胞因子IL-2， IL-6， IL-IO， IL-12， IFN-Y，TNF-a的 含量，牛奶內(nèi)各細(xì)胞因子的含量是未免疫奶牛所產(chǎn)牛奶的2-10倍，若細(xì)胞因 子含量達(dá)不到此水平，則再加強(qiáng)免疫接種一次，劑量為O. l-10.0mg/頭；(8) 上述含有多種細(xì)胞因子的牛奶即為有機(jī)分子肽乳；或者在有機(jī)分 子肽乳中加入常規(guī)輔料制備成其他飲品。
4、 如權(quán)利要求2或3所述的有機(jī)分子肽乳的制備方法，該有機(jī)分子肽 乳是由免疫了 CpG ODN-pUC質(zhì)粒的奶牛所產(chǎn)牛奶制得，其特征在于該方法中 免疫過(guò)程中構(gòu)建CpG ODN-pUC質(zhì)粒添加的CpG基因序列如SEQ ID NO: 1所 示。
5、 如權(quán)利要求2或3所述的有機(jī)分子肽乳的制備方法，其特征在于該 方法包括如下步驟(1) 構(gòu)建CpG ODN-pUC質(zhì)粒采用pUC質(zhì)粒，將CpG基因克隆到pUC載體，構(gòu)建成重組CpG ODN-pUC 質(zhì)粒，CpG基因序列為 5' GCGCAGATCTGACGTTAACGTTMCGTTAGATCTAACGTTAACGTTAACGTTAACGTTA ACGTTGACGTTAGATCTCCGG 3，，如SEQ ID NO: 1所示；(2) 在大腸桿菌中擴(kuò)增CpG ODN :將含有上述方法構(gòu)建的CpG ODN-pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到非致病性大腸桿菌(￡ cW力中，挑一個(gè)單菌落接種于含瓊脂、氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，其中每 1000ml LB培養(yǎng)基中含有1ml氨芐青霉素和15-20g的瓊脂，于37 'C下培養(yǎng) 24-36小時(shí)，至飽和狀態(tài)；(3) 用堿裂解法提取CpG ODN-pUC質(zhì)粒，或采用商用質(zhì)粒提取試劑盒提取；(4) 用聚乙二醇沉淀法對(duì)提取的CpG ODN-pUC質(zhì)粒進(jìn)行純化；(5) 電泳檢測(cè)CpG ODN-pUC質(zhì)粒的分子量，大于pUC載體100bp,并采用 紫外分光光度法測(cè)定CpG ODN-pUC質(zhì)粒的含量，含有CpG ODN-pUC質(zhì)粒不少于 l毫克，于-2(TC保存?zhèn)溆茫?6) 免疫接種奶牛選取有機(jī)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)喂養(yǎng)的奶牛，于分娩前一個(gè)月進(jìn)行免疫注射；注射方 法為取保存?zhèn)溆肅pG 0DN-pUC質(zhì)粒，對(duì)奶牛進(jìn)行皮下注射，注射劑量為 0. 1-10.0mg/頭，第14天加強(qiáng)一次，劑量為O. l-10.0mg/頭;(7) 每周收集一次免疫奶牛的血清、牛奶，采用檢測(cè)細(xì)胞因子的商用 酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定細(xì)胞因子IL-2，IL-6， IL-10， IL-12， IFN-Y，TNF-a的 含量，牛奶內(nèi)各細(xì)胞因子的含量是未免疫奶牛所產(chǎn)牛奶的2-IO倍，若細(xì)胞因 子含量達(dá)不到此水平，則再加強(qiáng)免疫接種一次，劑量為O. l-10.0mg/頭；(8) 上述含有多種細(xì)胞因子的牛奶即為有機(jī)分子肽乳；或者在有機(jī)分 子肽乳中加入常規(guī)輔料制備成其他飲品。
6、如權(quán)利要求2或3所述的有機(jī)分子肽乳在制備具有增強(qiáng)免疫功能飲 品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有增強(qiáng)免疫功能的有機(jī)分子肽乳及其制備方法，本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建CpG ODN-pUC質(zhì)粒，在大腸桿菌中大量擴(kuò)增含CpG ODN基因的質(zhì)粒，提取并純化質(zhì)粒，然后將CpG ODN-pUC質(zhì)粒皮下注射入有機(jī)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)的高產(chǎn)奶牛體內(nèi)，激發(fā)了非特異性免疫應(yīng)答、增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)其分泌各種細(xì)胞因子，通過(guò)對(duì)牛奶進(jìn)行細(xì)胞因子的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)奶牛的乳汁中也含有各種細(xì)胞因子，并且經(jīng)過(guò)免疫后牛奶中各細(xì)胞因子的含量是普通牛奶中的2-10倍，最后把其乳汁收集包裝生產(chǎn)成“有機(jī)分子肽乳”。飲用有機(jī)分子肽乳，就能夠提高機(jī)體免疫力，抗腫瘤，預(yù)防疾病增強(qiáng)體質(zhì)的功效。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101684465SQ20081021169
公開(kāi)日2010年3月31日 申請(qǐng)日期2008年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月23日
發(fā)明者于忠波, 杜啟科, 王銀香, 谷登峰, 陸家海 申請(qǐng)人:山東銀香大地乳業(yè)有限公司;王銀香