專利名稱：區(qū)分馬傳染性貧血中國(guó)弱毒疫苗株與美洲流行毒株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種區(qū)分弱毒疫苗株與強(qiáng)毒株的方法，尤其涉及一種區(qū)分馬 傳染性貧血中國(guó)弱毒疫苗株與美洲流行毒株的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
馬傳染性貧血病(equine infectious anemia ， EIA)是馬傳染性貧血 病毒(equine infectious anemia virus ， EIAV)弓l起的一禾中馬屬動(dòng)物的烈 性傳染病。該病的特征是病毒持續(xù)性感染、免疫病理反應(yīng)以及臨床反復(fù)發(fā)作， 呈現(xiàn)發(fā)熱并伴有貧血、出血、黃疸、心肌衰弱、浮腫和消瘦等癥狀。大多數(shù) 感染馬傳染性貧血病毒的馬經(jīng)過(guò)急性期和慢性期之后，進(jìn)入一個(gè)無(wú)癥狀隱性
帶毒的階段，變?yōu)镋IAV終生攜帶者(Hammond SA， Cook SJ， Lichtenstein DL， Issel CJ， Montelaro RC. Maturation of the cellular and humoral immune responses to persistent infection in horses by equine infectious anemia virus is a complex and lengthy process.J Virol. 1997 May;71(5):3840-52)， EIAV在馬體內(nèi)以低水平復(fù) 制，是危險(xiǎn)的傳染源，給養(yǎng)馬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因而建立一種能夠?qū)?馬匹進(jìn)行階段性檢測(cè)地方法十分重要。
根據(jù)其臨床癥狀、病理變化及血清學(xué)試驗(yàn)可對(duì)馬傳染性貧血病作出診斷。 瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是檢測(cè)EIA病毒
感染簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的方法，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織指定試驗(yàn)。此外，還有免疫熒 光抗體試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、中和試驗(yàn)等。1975年哈爾濱獸醫(yī)研究所研制成 功了馬傳貧弱毒疫苗，通過(guò)該疫苗的推廣應(yīng)用并采取了 "養(yǎng)、檢、隔、封、 消、處"等綜合性防治措施，使我國(guó)的疫情逐步得到控制(沈榮顯，馬傳染 性貧血病驢白細(xì)胞弱毒疫苗的研制與應(yīng)用[A]。國(guó)際馬傳染性貧血病免疫學(xué)術(shù) 討論會(huì)文集[C]，哈爾濱1983， 21-23)，預(yù)計(jì)在今后幾年消滅馬傳貧。而國(guó) 外尤其美洲等國(guó)家的馬傳貧至今仍很嚴(yán)重，紛紛要求引進(jìn)我國(guó)的馬傳貧疫苗， 因此，開發(fā)該疫苗將其推向國(guó)際市場(chǎng)，必將對(duì)世界養(yǎng)馬業(yè)作出極大的貢獻(xiàn)。 但由于受馬傳貧病毒強(qiáng)、弱毒不能鑒別技術(shù)條件的制約而使我國(guó)馬傳貧弱毒疫苗遲遲不能走出國(guó)門。
目前常規(guī)的馬傳貧診斷方法是用瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)(AGID)或酶聯(lián)免疫吸附試 驗(yàn)(EL工SA)的方法來(lái)檢測(cè)馬傳貧的P26抗原的抗體(Coggins,L"Norcross.N.， Nusbaum,S.,. Diagnosis of equine infectious anemia by immunodiffusion test.Am丄Vet.Res. 1972,33,11-18.)，雖然這些方法已經(jīng)比較成熟，但是卻存在 著一定的缺陷。首先，這些方法都是檢測(cè)馬匹血清中的抗體，而不是特異的 檢測(cè)其病毒的存在，只有在馬體內(nèi)產(chǎn)生了針對(duì)該病毒的免疫應(yīng)答之后才能檢 測(cè)到其特異性的抗體，這樣感染初期的馬匹，在病毒的免疫應(yīng)答還沒(méi)有建立
之前，用此方法檢測(cè)可能出現(xiàn)假陽(yáng)性(Issel, C. J., Cook, R. F.， A review of techniques for the serologic diagnosis of equine infectious anemia. J. Vet. Diagn. Invest. 1993, 5, 137-141 )。 1996年，Langemeier等(Langemerier, JL., Cook, R. F.，Rushlow, K. E.， d a/. Detection of equine infectious anemia vrial RNA in plasma sampales from recently infected and long-term inappaemt carrier animals by PCR丄Clin. Microbiol. 1996, 34， 481-1487)建立了一種RT-PCR的方法從馬 的血漿中檢測(cè)病毒的gag基因，這種方法盡管與瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)相比，靈敏性 有很大的提高，但是Oaks等(Oaks, J. L. ,McGuire.T. C.，Ulibarri,C., " a/. Equine infectious anemia virus is found in tissue macrophages during subclinical infection. J. Virol. 1998. 72. 7263-7269 )發(fā)現(xiàn)在病馬處于亞臨床感染狀態(tài)時(shí)，用這種方法 有時(shí)不能從血槳中檢測(cè)到病毒的存在。而Issel發(fā)現(xiàn)馬傳貧病毒進(jìn)入馬體后， 能夠保持一種持續(xù)性感染，馬傳貧病毒以前病毒地形式整合在白細(xì)胞基因組 中， 一直能夠持續(xù)很多年(Issel, C丄，Adams， W.V.,Meek,L. ， " a/. Transmission of equine infectious anemia virus from horses without clinical signs of disease. J. Am. Vet. Med . Assoc.1982， 180, 272-275)。因此利用PCR的方法馬傳貧前病毒 DNA，對(duì)于防制馬傳貧有很重要的意義，可以避免馬處于隱性感染期時(shí)的漏檢。
馬傳染性貧血病曾經(jīng)對(duì)整個(gè)世界的養(yǎng)馬業(yè)造成巨大的危害，我國(guó)研制成 功的馬傳貧弱毒疫苗成功的控制了我國(guó)的馬傳染性貧血病，而且有實(shí)驗(yàn)表明 該疫苗對(duì)美洲等國(guó)家的馬傳貧病馬有很高的保護(hù)作用，但是由于缺乏一種能 夠?qū)ⅠR傳染性貧血中國(guó)弱毒疫苗株感染與美洲流行毒株感染區(qū)分出來(lái)的方 法，阻礙了該弱毒疫苗株向美洲等國(guó)家的推廣和應(yīng)用
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠?qū)ⅠR 傳染性貧血中國(guó)弱毒疫苗株感染與美洲流行毒株感染區(qū)分出來(lái)的方法。 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的 一種區(qū)分馬傳染性貧血中國(guó)弱毒疫苗株與美洲流行毒株的方法，包括.. (1)從感染了待檢測(cè)毒株的馬外周血白細(xì)胞中提取DNA; (2)以所提取
的DNA為模板，以SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:3為引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增； (2)以第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，以SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3為引 物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；(3)取第二輪PCR擴(kuò)增得到的675bp片段用Kpnl和 Bspl2861進(jìn)行雙酶切分析;(4)如果酶切出了 340bp， 190bp和150bp三條片 段，則該檢測(cè)毒株為美洲流行毒株；如果僅切出了 340bp的一條片段，則該 檢測(cè)毒株為中國(guó)弱毒疫苗株。
上述方法中，其中，所述的第一輪PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系優(yōu)選為反應(yīng)體 系為25ul，其中，2.5 Pi IOXPCR緩沖液、2-2. 5ulTaq聚合酶，引物SEQ ID NO:l和SEQ ID N0:3各0. 5 u 1/L， 200umol/L dNTP， 2ulDNA模板，余 量為雙蒸水；PCR循環(huán)參數(shù)優(yōu)選為95i:/5min預(yù)變性后，95°C/45sec， 54°C /30sec， 72°C/30sec，共20個(gè)循環(huán)；72°C/5min。
所述的第二輪PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系優(yōu)選為反應(yīng)體系為25"1，其中，2.5 nllOXPCR緩沖液、2-2. 5ulTaq聚合酶，引物SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3 各O. 5ixl/L， 200umol/LdNTP ， 1 u 1第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，余量為雙蒸水； PCR循環(huán)參數(shù)優(yōu)選為:95。C/2min預(yù)變性后，95。C/15sec， 54。C/30sec， 72°C /15sec，共30個(gè)循環(huán)；72°C/5min。
其中，所述的馬傳染性貧血美洲流行毒株優(yōu)選為馬傳染性貧血阿根廷代 表毒株Agen-EIAV。
本發(fā)明在對(duì)馬傳貧病毒美洲流行株和中國(guó)馬傳貧弱毒疫苗株(DLV)全基 因序列大量的分析比較的基礎(chǔ)上，在病毒gag基因區(qū)設(shè)計(jì)了 SEQIDNO:l、 SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3三條引物，用nPCR的方法從阿根廷代表毒株Agen-EIAV 和中國(guó)DLV感染馬的外周血白細(xì)胞中均能擴(kuò)增出675bp的片段。通過(guò)對(duì)這個(gè) 片段核苷酸序列及其酶切位點(diǎn)的分析而建立了區(qū)分馬傳貧病毒美洲流行株和 中國(guó)馬傳貧弱毒疫苗株感染馬的方法。對(duì)第2輪PCR擴(kuò)增出的675bp片段用 Kpnl和Bspl2861酶切分析，結(jié)果表明，中國(guó)馬傳貧弱毒疫苗得到一條340bp 左右的片段，而美洲毒株出現(xiàn)340bp， 190bp和150bp三條片段。本發(fā)明方法同時(shí)采用巢氏多重PCR和RFLP的方法對(duì)阿根廷代表毒株感染 馬和中國(guó)疫苗免疫馬的進(jìn)行了準(zhǔn)確的區(qū)分，可以靈敏特異的檢測(cè)感染馬傳貧 病毒的馬匹，能夠鑒別到O. 2ng細(xì)胞染色體DNA中的病毒特異性DNA片段，， 而且只用5 — 7小時(shí)就可以快速的進(jìn)行區(qū)分，本發(fā)明方法對(duì)于馬傳染性貧血中 國(guó)弱毒疫苗株向世界范圍的推廣具有重要意義。


圖1 引物SEQ IDN0:1和SEQ ID N0:3，引物SEQ IDN0:2和SEQ ID NO:3 的nPCR擴(kuò)增結(jié)果；
圖2阿根廷毒株感染馬nPCR產(chǎn)物Kpnl/Bsp12861雙酶切結(jié)果； 圖3 中國(guó)弱毒疫苗免疫馬nPCR產(chǎn)物Kpnl/Bspl286I.雙酶切結(jié)果； 圖4 PCR檢測(cè)的敏感性試驗(yàn)；
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨 著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成 任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下 可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均 落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
1、材料與方法 1. 1毒株和試劑
馬傳染性貧血病毒阿根廷代表毒株(Agen-EIAV)由本實(shí)驗(yàn)室保存。rTaq 酶、PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP等購(gòu)自大連寶生物工程公司，DNA提取試劑盒購(gòu)自 Qiagen公司。馬傳染性貧血病毒中國(guó)弱毒疫苗株中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸 醫(yī)研究所研制，保存。
1.2引物的設(shè)計(jì)與合成
在已測(cè)定的Agen-EIAV序列、genebank上發(fā)表的美國(guó)毒株序列及中國(guó)弱 毒疫苗株序列的比較基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了三條引物，其中二條為上游引物， 一條 為下游引物，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列為Pl : 5'
6CAG MC ACA GGA GGA CAG GTA AG 3，(SEQ ID N0:1) ， P2: 5' GCG CTC AAG AAG TTA GAG A3' (SEQ ID N0:2) ， P3: 5' CCT AAT GM CCT TGC TGT CA 3， (SEQ ID N0:3)。
1. 3模板的制備
采集阿根廷馬傳貧病毒株攻毒馬和中國(guó)馬傳貧弱毒疫苗免疫馬不同時(shí)間 段的抗凝血，置室溫30-40min，收集中間淡黃色的白細(xì)胞層，4000r/min離 心10min，按照Qiagen Genomenic DNA Kit (M13433, midi)說(shuō)明書提供的 方法提取細(xì)胞基因組DNA。
主要步驟如下(均在室溫操作)沉淀用200W PBS重懸后加入20ri (50mg/ml)蛋白酶K，混合后加入20(H4緩沖液AL，充分混勻；56。C水浴溫 育lOmin至溶液清亮，短暫離心以除去附于管壁的液體;在離心管中加入200^1 無(wú)水乙醇，震蕩混勻；將混合液移入核酸分離柱中，小心操作以避免污染分 離柱管口。 8 OOOrpm離心lmin,棄去收集管中的液體(注如離心過(guò)程中出 現(xiàn)堵塞情況，說(shuō)明樣品中存在難降解固形物，可再加入適量蛋白酶并延長(zhǎng)降 解時(shí)間)；加入500W AW1，大于8 OOOrpm離心lmin。換用新收集管，棄去 盛有濾液的原管；加入500W AW2，全速離心3min，離心后可選擇將分離柱 置于新的2ml收集管中，全速離心lmin;分離柱移入新1.5ml離心管，加 入100-200f4 AE洗脫緩沖液，室溫放置2min，大于8 OOOrpm離心lmin洗脫 核酸，-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 1. 4 nPCR擴(kuò)增與RFLi3 (Restriction Fragment Length Polymorphism, 限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性)
第一輪PCR反應(yīng)體系為25ul: 2. 5 PllOxbuffer、 2-2. 5WTaq聚合酶， 引物Pl/P3各0. 5W/L， 200翻1/L dNTP， 2|4DNA模板。循環(huán)參數(shù)分別為 95°C/5min預(yù)變性后，95°C/45sec， 54°C/30sec， 72°C/30sec，共20個(gè)循環(huán)，72 °C/5min。第二輪PCR反應(yīng)體系為25^1: 2. 5幽xbuffer、 2-2. 5PlTaq聚合 酶，引物P2/P3為0. 5l4/L， 200陶ol/L dNTP ， 外套PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模 板。循環(huán)參數(shù)分別為95°C/2min預(yù)變性后，95°C/15sec， 54°C/30sec， 72 °C/15sec，共30個(gè)循環(huán)。72°C/5min。取PCR產(chǎn)物2|4用Kpnl和Bspl286工 (圖l)進(jìn)行雙酶切分析，然后以2.0%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色檢査。
2試驗(yàn)結(jié)果
2. 1 nPCR擴(kuò)增與RFLP
用Pl/P3引物作第一輪PCR反應(yīng)，取反應(yīng)產(chǎn)物為模板，再用P2/P3 引物作第二輪PCR反應(yīng)，馬傳貧病毒阿根廷和中國(guó)弱毒疫苗株均能擴(kuò)增出 675bp的片段，其大小與預(yù)計(jì)相符合。然后取巢氏PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2[il用Kpnl 和Bspl2861雙酶切，2.0%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色檢查，阿根廷 代表毒株為340bp， 190bp和150bp三條片段，而我國(guó)弱毒疫苗為340bp左右 的片段(見(jiàn)圖2， 3)。
2.3 PCR檢測(cè)的敏感性試驗(yàn)
以提取的馬外周血白細(xì)胞染色體DNA為模板，從200ngDNA開始按10倍 稀釋，用Pl/P3和P2/P3作巢氏PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳溴化乙錠染色，能從最少 0. 2ng細(xì)胞染色體DNA中擴(kuò)增出特異性馬傳染性貧血病條帶(圖4)。序列表
序列表
<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所
<120>區(qū)分馬傳染性貧血中國(guó)弱毒疫苗株與美洲流行毒株的方法
<130> KLPI08089
<160〉 3
<170> Patentln version 3.5
<210> 1 <211> 23 <212>艦
<213> equine infectious anemia virus <400〉 1
cag犯cacag g3ggacaggt 33g
<210> 2 <211> 19 <212> DNA
<213> equine infectious anemia virus <400> 2
gcgctcaaga agttagaga
<210> 3 <211> 20 <212> 腿
<213> equine infectious anemia virus <400> 3
cctaatgaac cttgctgtca
19
20
權(quán)利要求
1、一種區(qū)分馬傳染性貧血中國(guó)弱毒疫苗株與美洲流行毒株的方法，包括(1)從感染了待檢測(cè)毒株的馬外周血白細(xì)胞中提取DNA；(2)以所提取的DNA為模板，以SEQ ID NO1和SEQ ID NO3為引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；(2)以第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，以SEQ ID NO2和SEQ ID NO3為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；(3)取第二輪PCR擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用KpnI和Bsp1286I進(jìn)行雙酶切分析；如果酶切出了340bp，190bp和150bp三條片段，則該檢測(cè)毒株為美洲流行毒株；如果僅切出了340bp的一條片段，則該檢測(cè)毒株為中國(guó)弱毒疫苗株。
2、 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的第一輪PCR擴(kuò)增的 反應(yīng)體系為反應(yīng)體系為25 ul，其中，2.5 IOXPCR.緩沖液、2-2. 5 li lTaq聚合酶，引物SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 3各0, 5 u 1/L， 200 y mol/L dNTP， 2ulDNA模板，余量為雙蒸水。
3、 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的第一輪PCR擴(kuò)增的 循環(huán)參數(shù)為95。C/5min預(yù)變性后，95°C/45sec， 54°C/30sec， 72。C/30sec， 共20個(gè)循環(huán)；72。C/5min。 u。
4、 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的第二輪PCR擴(kuò)增的 反應(yīng)體系為反應(yīng)體系為25ul，其中，2.5 ul 10XPCR緩沖液、2-2.5u lTaq聚合酶，引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO: 3各0. 5 u 1/L， 200 u mol/L dNTP, 1 u 1第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，余量為雙蒸水。
5、 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的第二輪PCR擴(kuò)增的 循環(huán)參數(shù)為95。C/2min預(yù)變性后，95°C/15sec， 54°C/30sec， 72°C/15sec， 共30個(gè)循環(huán)；72°C/5min。
6、 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的馬傳染性貧血美洲 流行毒株為馬傳染性貧血阿根廷代表毒株Agen-EIAV。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種區(qū)分馬傳染性貧血中國(guó)弱毒疫苗株與美洲流行毒株的方法，包括(1)從感染了待檢測(cè)毒株的馬外周血白細(xì)胞中提取DNA；(2)以該DNA為模板，以P1/P3為引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；(2)以P2/P3為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；(3)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切分析；如果酶切出了340bp，190bp和150bp片段，則該檢測(cè)毒株為美洲流行毒株；如果僅切出了340bp片段，則該檢測(cè)毒株為中國(guó)弱毒疫苗株。本發(fā)明方法可以對(duì)阿根廷代表毒株感染馬和中國(guó)疫苗免疫馬進(jìn)行準(zhǔn)確的區(qū)分，可以靈敏特異的檢測(cè)感染馬傳貧病毒的馬匹，能夠鑒別到0.2ng細(xì)胞染色體DNA中的病毒特異性DNA片段，而且只用5-7小時(shí)就可以快速的進(jìn)行區(qū)分。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101665841SQ20081021435
公開日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2008年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月5日
發(fā)明者呂曉玲, 周建華, 姜成剛, 相文華, 耿慶華, 趙立平, 巍 郭 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所