專利名稱：：用于沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌復(fù)合增菌的培養(yǎng)基及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于致病菌的前增菌培養(yǎng)基，特別是涉及一種同時對沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌復(fù)合增菌的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：我國是水產(chǎn)品出口大國，但是隨著貿(mào)易全球化，我國漁業(yè)將面臨前所未有的新問題和新挑戰(zhàn)，對我國水產(chǎn)品質(zhì)量提出了更高的要求，無污染、無公害必將成為水產(chǎn)品進(jìn)入國際市場的入場券食品中污染的病原細(xì)菌是引起食源性疾病的主要因素之一，是一項巨大并不斷擴(kuò)大的世界性公共衛(wèi)生問題，控制微生物污染是目前解決水產(chǎn)品污染問題的主要內(nèi)容。沙門氏菌、副溶血性弧菌和霍亂弧菌都是水產(chǎn)品中常見致病菌，是進(jìn)出口水產(chǎn)品中的常檢項目。隨著人們生活方式的改變以及水環(huán)境的惡化，越來越多人由于進(jìn)食未煮熟的水產(chǎn)品而受到感染，加上這三種細(xì)菌危害巨大，特別是霍亂弧菌可引起大流行，嚴(yán)重威脅人民的生命健康，出口水產(chǎn)品污染這三種菌，阻礙我國水產(chǎn)品的出口，影響我國經(jīng)濟(jì)和我國在國際上的聲譽，所以對水產(chǎn)品進(jìn)行沙門氏菌、副溶血性弧菌和霍亂弧菌的監(jiān)測勢在必行，對于保證人民生命健康，我國經(jīng)濟(jì)健康發(fā)展具有重大的意義。目前對沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌主要采用常規(guī)增菌培養(yǎng)、生化鑒定及自動酶聯(lián)熒光免疫檢測方法(VIDAS)相結(jié)合，大多要耗費4-6天時間，而且程序復(fù)雜，所用試劑繁多，費時費力，檢出效率低，檢測靈敏度低，假陰性比較嚴(yán)重。近年來，酶聯(lián)熒光免疫檢測法(VIDAS)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、金標(biāo)試紙法、API法、聚合酶免疫檢測方法(EIA)和DNA探針技術(shù)等新技術(shù)逐漸應(yīng)用于微生物檢測，大大提高檢測的靈敏度和簡化了操作，甚至出現(xiàn)多重PCR技術(shù)、蛋白或抗體微陣列感受器、免疫吸收及DNA微陣列等技術(shù)等同一檢測平臺上檢測多種微生物的檢測方法，但是所有這些方法仍然離不開選擇性增菌和/或前增菌?，F(xiàn)有的增菌方法主要是根據(jù)所要監(jiān)測的菌株進(jìn)行各自的增菌處理，即不同的菌株采用各自的選擇性增菌培養(yǎng)基進(jìn)行增菌處理，費時費力，不符合現(xiàn)代檢測方法一平臺同時檢測多種致病菌的發(fā)展趨勢。國際上研究出一種通用增菌培養(yǎng)基(UPB)可以同時增殖多種細(xì)菌，但是由于該培養(yǎng)基沒有選擇性，除了要監(jiān)測的目標(biāo)菌能增殖外，其它雜菌也可以大量生長，雜菌的大量生長必然影響目標(biāo)菌的生長，UPB的效果不能讓人滿意。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種使得沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌復(fù)合增菌，抑制其它微生物的生長的培養(yǎng)基。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種用于沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌復(fù)合增菌的培養(yǎng)基，以重量份數(shù)計，其配方組分如下緩沖蛋白胨水0.5-1.5份、蒸餾水1000份，葡萄糖1.0-5.0份、甘露醇1.0-5.0份、丙酮酸鈉0.03-0.06份、無水亞硫酸鈉0.5-2.5份、檸檬酸鈉1.0-10.0份、氯化鈉5.0-25.0份、膽鹽l-5份、亞碲酸鉀0.0005-0.0025份，培養(yǎng)基的pH值為7.0-7.5。以重量份數(shù)計，所述培養(yǎng)基配方優(yōu)選為緩沖蛋白胨水1份、蒸餾水1000份，葡萄糖1.25份、甘露醇1.25份、丙酮酸鈉0.05份、無水亞硫酸鈉L25份、檸檬酸鈉5份、氯化鈉15.0份、膽鹽2.5份、亞碲酸鉀0.001份，培養(yǎng)基的pH值為7.2。用于沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌符合增菌培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟(1)按權(quán)利要求l所述配方，將緩沖蛋白胨水、氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、亞硫酸鈉、丙酮酸鈉、檸檬酸鈉和膽鹽加入到蒸餾水中，加熱熔解后121-125'C滅菌15-18min;(2)待步驟(1)的培養(yǎng)液冷卻到低于50'C，在無菌條件下，加入亞碲酸鉀混勻；分裝存于2-4'C下備用。緩沖蛋白胨水是由蛋白胨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和氯化鈉組成。其中，蛋白胨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和氯化鈉的重量比為10:3.57:1.5:5。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點本培養(yǎng)基可融合致病菌的前增菌及選擇性增菌兩個步驟，縮短增菌時間至24小時；使得三種常見的致病菌同時增菌而其它的致病微生物生長受到一定的抑制；本發(fā)明的培養(yǎng)物可以直接做目標(biāo)菌的分離培養(yǎng)及生物鑒定實驗，也可以直接用于多重PCR檢測，作出診斷報告。圖1是沙門氏菌熒光PCR檢測試劑盒檢測結(jié)果圖；圖2是副溶血弧菌熒光PCR檢測試劑盒檢測結(jié)果圖；圖3是霍亂弧菌熒光PCR檢測試劑盒檢測結(jié)果圖。具體實施例方式為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步地詳細(xì)說明，但是本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實施例表示的范圍。實施例1稱取緩沖蛋白胨水20.lg、葡萄糖1.25g、甘露醇1.25g、丙酮酸鈉0.05g、無水亞硫酸鈉L25g、檸檬酸鈉5.0g、氯化鈉15.0g、膽鹽2.5g、、蒸餾水1000ml加熱熔解后121。C滅菌滅菌18min。待培養(yǎng)冷卻到5(TC以下后在無菌條件下加入亞碲酸鉀l.Omg,溶解混勻后分裝備用。分別取三種目標(biāo)菌沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌以及非目標(biāo)菌大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、小腸耶爾森氏菌、變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、福氏志賀菌、鮑氏志賀菌、綠膿桿菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌的斜面培養(yǎng)物，稀釋后將稀釋到l(T的各目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的菌液0.2ml加入到上述培養(yǎng)基中，37'C培養(yǎng)24h。用可見分光光度計測定540nm下的0D值。同時將菌體接入緩沖蛋白胨水中做空白對照，結(jié)果見表l。表1目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌單獨在最佳配比的培養(yǎng)基中的生長情況0123沙門氏菌0.5951.2641.1891.199副溶血弧菌0.6110.8520.8910.853霍亂弧菌0.6260.8880.8750.891小腸耶爾森氏菌0.582-一-變形桿菌0.6190.3010.2840.286產(chǎn)氣腸桿菌0.5840.2510.2620.249福氏志賀菌0.569-一-鮑氏志賀菌0.498一一_綠膿桿菌0.560_一一大腸桿菌0.623—--蠟樣芽孢桿菌0.548-一-創(chuàng)傷弧菌0.637--一溶藻弧菌0.555-一-表示菌體不生長，0號為空白對照，1-3號管為三個重復(fù)。從表1看到，三種目標(biāo)菌沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌在所述的培養(yǎng)基中生長24小時后增菌效果比無選擇性的緩沖蛋白胨水佳；大部分非目標(biāo)菌的生長受到了抑制，只有變形桿菌和產(chǎn)品腸桿菌菌液變渾濁，但是與空白無選擇性的緩沖蛋白胨水相比這兩種菌在所述的培養(yǎng)基中生長明顯受到了抑制，它們的生長也明顯比3種目標(biāo)菌慢。實施例2稱取緩沖蛋白胨水10.05g、葡萄糖lg、甘露醇lg、丙酮酸鈉0.03g、無水亞硫酸鈉0.5g、檸檬酸鈉1.0g、氯化鈉5,0g、膽鹽lg、、蒸餾水1000ml加熱熔解后123'C滅菌滅菌16min。待培養(yǎng)冷卻到5CTC以下后在無菌條件下加入亞碲酸鉀0.5mg，溶解混勻后分裝備用。分別取三種目標(biāo)菌沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌以及非目標(biāo)菌大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、小腸耶爾森氏菌、變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、福氏志賀菌、鮑氏志賀菌、綠膿桿菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌的斜面培養(yǎng)物，稀釋后將稀釋到10"的各目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的菌液0.2ml加入到上述培養(yǎng)基中，37'C培養(yǎng)24h。用可見分光光度計測定540rai下的0D值。同時將菌體接入緩沖蛋白胨水中做空白對照，結(jié)果見表2。表2目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌單獨在下限培養(yǎng)基中的生長情況<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>O號為空白對照，l-3號管為三個重復(fù)。從表2看到，目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌都生長了。與空白無選擇性的緩沖蛋白胨水比較，目標(biāo)菌的生長情況比空白好，而非目標(biāo)菌則受到不同程度的抑制。實施例3稱取緩沖蛋白胨水30.15g、葡萄糖5.0g、甘露醇5.0g、丙酮酸鈉0.05g、無水亞硫酸鈉2.5g、檸檬酸鈉5.Og、氯化鈉25.Og、膽鹽5g、、蒸餾水1000ml加熱熔解后125'C滅菌滅菌15min。待培養(yǎng)冷卻到50。C以下后在無菌條件下加入亞碲酸鉀2.5mg，溶解混勻后分裝備用。分別接入稀釋到三種目標(biāo)菌沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌以及非目標(biāo)菌大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、小腸耶爾森氏菌、變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、福氏志賀菌、鮑氏志賀菌、綠膿桿菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌斜面培養(yǎng)物，將稀釋到10—4的各目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的菌液0.2ml加入到上述培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)24h。用可見分光光度計測定540nm下的0D值。同時將菌體接入緩沖蛋白胨水中做空白對照。結(jié)果見表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>-表示菌體不生長，O號為空白對照，l-3號管為三個重復(fù)。從表3看出，目標(biāo)菌均有生長，但是與空白無選擇性的緩沖蛋白胨水相比，三種目標(biāo)菌生長得比空白緩慢，受到了不同程度的抑制，特別是沙門氏菌和霍亂弧菌；非目標(biāo)菌均不生長。實施例4按實施例1配制培養(yǎng)基，將沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌按照10'cfu/rnl水平以1:1:l比例接入培養(yǎng)基中，37"C培養(yǎng)24小時候，將菌液稀釋到10—6，分別涂布到BS瓊脂平板以及TCBS平板上，進(jìn)行分離培養(yǎng)。沙門氏菌在BS瓊脂上位墨綠色圓形菌落，副溶血弧菌和霍亂弧菌不生長。在TCBS平板上霍亂弧菌菌落為黃色，扁平，真徑2-3mm;副溶血弧菌菌落為藍(lán)綠色，菌落呈圓形，邊緣整齊、濕潤、稍混濁、半透明，多數(shù)具尖心、斗笠狀，直徑2-4mm;沙門氏菌不生長。生長結(jié)果見表4。_表4復(fù)合增菌培養(yǎng)基增菌效果_指示菌接種量(cfu/ml)24小時培養(yǎng)物菌量(cfu/ml)沙門氏菌102.44X107102.31X107副溶血弧菌101.94X105101.86X105霍亂弧菌102.32X106102.25X106表4結(jié)果表明，沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌能夠同時增殖。實施例5按實施例l配制培養(yǎng)基。在無菌條件下，將魚、墨魚、魷魚(經(jīng)熒光PCR鑒定不含三種目標(biāo)菌)分別制備成25份粉碎。將培養(yǎng)物按照大約3X102cfLi/份水平接種于樣品中，室溫下處理15min，使細(xì)菌被吸收，然后將其放入含有225ml的自制培養(yǎng)基的無菌袋中，混合2min。均勻好的樣品接種后37'C培養(yǎng)24小時。用酚/氯仿法提取細(xì)菌的DNA，用沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌熒光PCR檢測試劑盒進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如圖1至圖3，可見三種目標(biāo)菌均出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，說明所述的復(fù)合增菌培養(yǎng)基使得樣品中的三種目標(biāo)菌沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌同時增殖，并達(dá)到檢測的菌濃度要求，證明經(jīng)所述的復(fù)合增菌培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，可用于PCR檢驗，滿足其檢測限的要求。本發(fā)明單一的培養(yǎng)基可以同時支持沙門氏菌，副溶血弧菌和霍亂弧菌三種食源性疾病的同時生長，將常規(guī)檢測方法中的前增菌步驟和選擇性增菌步驟合二為一，用于在一個檢測平臺上檢測多個致病菌的相關(guān)技術(shù)中。上述實施例中培養(yǎng)基含有抑制劑檸檬酸鈉、膽鹽和亞碲酸鉀，高濃度的氯化鈉也對背景微生物具有抑制作用。其中，檸檬酸鈉可以抑制大腸埃希氏菌和枸櫞酸桿菌，而對3種目標(biāo)菌沒有明顯的抑制作用，膽鹽抑制革蘭氏陽性菌，亞碲酸鉀可以抑制腸道桿菌和革蘭氏陽性菌。三種抑制劑的添加可以起到抑制背景微生物的生長，使目標(biāo)菌有較好的生長。三種菌對氯化鈉的耐受性能好，提高其用量，抑制其他微生物的生長；磷酸氫二鈉、磯酸二氫鉀可用于調(diào)節(jié)pH;蛋白胨、甘露醇是培養(yǎng)基中基本的營養(yǎng)和支持成分；丙酮酸鈉用于復(fù)活并促進(jìn)沙門氏菌的生長；葡萄糖用于促進(jìn)副溶血弧菌的生長；亞硫酸鈉用于促進(jìn)霍亂弧菌的生長，同時檸檬酸鈉對霍亂弧菌也具有促進(jìn)作用。標(biāo)本接種后，在37'C培養(yǎng)，增菌24小時后，劃線到三種目標(biāo)菌各自的選擇性培養(yǎng)基上，分離鑒別。權(quán)利要求1、一種用于沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌復(fù)合增菌的培養(yǎng)基，其特征在于，以重量份數(shù)計，其配方組分如下緩沖蛋白胨水0.5-1.5份、蒸餾水1000份，葡萄糖1.0-5.0份、甘露醇1.0-5.0份、丙酮酸鈉0.03-0.06份、無水亞硫酸鈉0.5-2.5份、檸檬酸鈉1.0-10.0份、氯化鈉5.0-25.0份、膽鹽1-5份、亞碲酸鉀0.0005-0.0025份，培養(yǎng)基的pH值為7.0-7.5。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于以重量份數(shù)計，所述培養(yǎng)基配方為緩沖蛋白胨水l份、蒸餾水1000份，葡萄糖1.25份、甘露醇1.25份、丙酮酸鈉0.05份、無水亞硫酸鈉1.25份、檸檬酸鈉5份、氯化鈉15.0份、膽鹽2.5份、亞碲酸鉀0.001份，培養(yǎng)基的pH值為7.2。3、權(quán)利l所述用于沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌符合增菌培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)按權(quán)利要求l所述配方，將緩沖蛋白胨水、氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、亞硫酸鈉、丙酮酸鈉、檸檬酸鈉和膽鹽加入到蒸餾水中，加熱熔解后121-125'C滅菌15-18min;(2)待步驟(1)的培養(yǎng)液冷卻到低于50'C，在無菌條件下，加入亞碲酸鉀混勻；分裝存于2-4'C下備用。全文摘要本發(fā)明涉及用于沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌復(fù)合增菌的培養(yǎng)基及制備方法，以重量份數(shù)計，培養(yǎng)基配方組分如下緩沖蛋白胨水0.5-1.5份、蒸餾水1000份，葡萄糖1.0-5.0份、甘露醇1.0-5.0份、丙酮酸鈉0.03-0.06份、無水亞硫酸鈉0.5-2.5份、檸檬酸鈉1.0-10.0份、氯化鈉5.0-25.0份、膽鹽1-5份、亞碲酸鉀0.0005-0.0025份。制備時，先將緩沖蛋白胨水等加入到蒸餾水中，加熱熔解后滅菌；冷卻到50℃后，加入亞碲酸鉀混勻。該培養(yǎng)基可融合細(xì)菌檢測的前增菌以及選擇性增菌兩個步驟，縮短增菌時間至24小時；能夠使三種目標(biāo)致病菌同時增菌，并且抑制其它微生物的生長。文檔編號C12N1/20GK101412977SQ20081021941公開日2009年4月22日申請日期2008年11月25日優(yōu)先權(quán)日2008年11月25日發(fā)明者余以剛,暉吳,李蘇龍,肖性龍,覃倚瑩,許喜林申請人:華南理工大學(xué)