專利名稱：利用人類皮膚黑色素細(xì)胞分析美白劑毒性和功效的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用原代培養(yǎng)的人類皮膚黑色素細(xì)胞對美白劑進行毒性分析和功效 分析的方法，可以替代活體動物(或人體)皮膚及瘤性黑色素細(xì)胞，應(yīng)用于美白化學(xué)原 料或含美白劑的化妝品配方的毒理學(xué)和功效學(xué)實驗領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
皮膚是人體最大的器官，是外源化學(xué)因素(化學(xué)品、藥品、化妝品等)或物理機械因 素(紫外線、微波等)毒性作用的主要器官。利用動物或人體皮膚進行皮膚毒性測試和 功效測試是化妝品、藥品、食品添加劑及原料、農(nóng)藥、生物制品、化學(xué)品健康安全評價 的常規(guī)檢測項目。傳統(tǒng)的皮膚安全性評價實驗不僅要求一定數(shù)量和高質(zhì)量的實驗動物， 而且試驗周期長，成本高，某些反應(yīng)會給動物造成極大的痛苦。世界各國非常重視實驗 動物的福利問題,如上世紀(jì)歐洲各國、美國頒布的動物福利法，中國的《實驗動物管理條 例》等。隨著國際動物保護和動物福利運動的興起，40多年前國外最先提出了以"減少 (reduce) 〃、 〃替代(r印lace) 〃和〃優(yōu)化(refine) 〃為核心內(nèi)容的"3R原則"，并在此 基礎(chǔ)上大力開展動物實驗替代方法的研究。特別是近20年，不再以動物模式為基礎(chǔ)的毒 理學(xué)系統(tǒng)己被科學(xué)家采用，并被許多國家的政府、歐洲和國際法規(guī)所接受。2002年11 月7日歐洲議會與歐盟理事會在布魯塞爾達成協(xié)議，決定"從2009年3月11日起在歐 盟范圍內(nèi)禁止使用動物進行化妝品毒性和過敏實驗"，也"不允許成員國從外國進口和銷 售進行動物實驗的化妝品"。歐盟新化學(xué)品法規(guī)REACH (化學(xué)品的注冊、評估、許可和限
制)也提出鼓勵動物試驗替代方法的開發(fā)和應(yīng)用。采用體外培養(yǎng)的細(xì)胞或構(gòu)建的組織工 程器官進行毒性評價和功能性評價是動物試驗替代技術(shù)的關(guān)鍵領(lǐng)域之一。
表皮和真皮交界處的黑色素細(xì)胞是皮膚中的黑色素顆粒的產(chǎn)生部位，在外界各種剌激(如UV，化學(xué)物，超氧化物等)和體內(nèi)一些激素、代謝產(chǎn)物(如促黑色素分泌激素，堿 性成纖維細(xì)胞生長因子，內(nèi)皮素等)作用下，黑色素顆粒分泌增加，經(jīng)過與表皮基底部 的角質(zhì)形成細(xì)胞的突觸連接，將生成的黑色素顆粒傳遞到角質(zhì)形成細(xì)胞中發(fā)揮其生物學(xué) 效應(yīng)。大約一個黑色素細(xì)胞和其周圍的40個角質(zhì)形成細(xì)胞形成一個這樣的功能單位，稱 之為表皮黑色單位。正常的黑色顆粒的形成對于皮膚抗紫外，抗氧化具有著積極的作用。 但是在一些病理情況(如過敏性皮炎，日光性皮炎，炎癥，黑斑病等)下出現(xiàn)的黑色素 過度表達，則對患者的精神和身體都產(chǎn)生很大的影響。所以對抗這種黑色素過度表達的 美白劑常用于化妝品、藥品中。另一方面，各種功能性的化妝品日益成為人們?nèi)粘Ｉ?中的必需生活品，在滿足消費者改善膚質(zhì)愿望的過程中，也給消費者帶來了精神上的愉 悅。越來越多的來源于合成化工產(chǎn)品、天然動植物提取物、生物活性因子等被開發(fā)利用 為美白物質(zhì)，同時，也應(yīng)注意到各種具有美白功效的化學(xué)物質(zhì)的廣泛使用可能給消費者 帶來一定程度的潛在健康風(fēng)險，而建立一種既安全、高效又人道(既替代動物實驗)的 毒性和功效的評估方法則是我們此發(fā)明中所解決的問題。
目前的美白物質(zhì)毒性與功效評價主要采用活體動物試驗或體內(nèi)人體志愿者試用試驗， 體外方法主要利用人源或嚙齒類(大鼠、小鼠)動物的黑色素瘤細(xì)胞試用試驗。但現(xiàn)有 的體外方法有其不足之處通常黑色素表達不夠穩(wěn)定，而且腫瘤的或動物的細(xì)胞與正常 的人體細(xì)胞形態(tài)和基因都存在一定差異。
開發(fā)含黑色素細(xì)胞的組織工程化皮膚是進行美白毒性和功效評價的另一途徑，如 2003年，Yoon T. J.等將分離培養(yǎng)的原代黑色素細(xì)胞加到組織工程化皮膚中，構(gòu)建含黑 色素細(xì)胞的人工皮膚(Yoon T. J., Lei T. C. ， Yamaguchi Y., Batzer J. ， Wolber R.， Hearing V. J.,Anal. Biochem. ， 318, 260—269 (2003))，但這種含黑色素細(xì)胞的工程 化皮膚還不成熟，而且造價昂貴且培養(yǎng)不易。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題，就是提供一種成熟的利用人類黑色素細(xì)胞對美白 劑進行毒性和功效分析的實驗方法，因為細(xì)胞來源于人類，故實驗結(jié)果能真實地反映人 類皮膚組織中的黑色素細(xì)胞對受測試物質(zhì)的反應(yīng)效果，因而能滿足化妝品領(lǐng)域?qū)γ腊讋?毒性和功效實驗的研究。
在上述基礎(chǔ)上，本發(fā)明還涉及實驗中所用的人類黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)，該培養(yǎng)技術(shù) 成熟，培養(yǎng)容易周期短，重復(fù)性好，而且價格低廉。
本發(fā)明原代人類黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)主要分以下幾個步驟
I 、人類皮膚原代黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)
(1)人類皮膚黑色素細(xì)胞培養(yǎng)液的配置 l)配制人類黑色素細(xì)胞培養(yǎng)液
A. 完全培養(yǎng)液將角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)液K-SFM (Keratinocyte Serum-Free Medium )與胎牛血清按體積比9: 1混合，并添加以下輔助因子氫化可的松
(Hydrocortisone)，其終濃度為0.4ug/ML;牛胰島素(insuilin)，其終濃度為10ug/ML; L-谷氨酰胺(L-glutamine)，其終濃度為6mmol; 12-o-十四烷酰佛波醋酸酯-13 (簡寫TPA， 英文名12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate)，其終濃度為81.06nmol/L; 3-異丁基-l-甲基 黃嘌呤(簡寫為IBMX,即3-isobutyl-l-methylxanthine)，其終濃度為O.lnmol/L;轉(zhuǎn)鐵 蛋白(transferrin)，其終濃度為10ug/ML;霍亂毒素(choleratoxin， CT)，某終濃度為 10ng/ML;堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-FGF)和表皮生長因子(EGF)，兩者的終濃度 均為lOng/ML;
B. 基礎(chǔ)培養(yǎng)液K-SFM與10%胎牛血清按體積比9: l混合，僅添加終濃度為6mmo1 的L-谷氨酰胺和終濃度為10ug/ML的胰島素；
2)細(xì)胞培養(yǎng)瓶的包被將每毫升含50微克的膠原蛋白的IV型膠原包被液2-3ml加入 一個新的25ml塑料培養(yǎng)瓶中，使包被液覆蓋在培養(yǎng)瓶的底部，過夜或室溫孵育2-3小時，將包被液吸出之后，或是將塑料培養(yǎng)瓶在室溫下放置約2-3小時晾干，或是將已經(jīng)包被
好的培養(yǎng)瓶放在4'C保存?zhèn)溆茫?br> (2)人類原代黑色素細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
1)將外科手術(shù)環(huán)切下的幼兒新鮮包皮用含100 U/mL青霉素、100 ug/mL鏈霉素的 0. 01mol/L的PBS緩沖液徹底清洗2-3次；然后在無菌條件下去除皮下脂肪和結(jié)締組織 將清洗干凈的包皮剪切成約2.0mmX3.0mra的皮片；將皮片展開，表皮朝向上方浸泡于質(zhì) 量濃度0. 25M的裂解酶(DispasesI1)中分離表皮和真皮，方式有37。C消化2±0. 5小時或 是4'C過夜12-18小時；
2)將分離的皮片從裂解酶(DispasesII)中取出，用鑷子輕輕將表皮和真皮分離，將 表皮收集在含有雙抗(100U/mL青霉素、100ug/mL鏈霉素)的0. 01mol/L的PBS中； 將表皮用此PBS液徹底清洗2-3次，用已經(jīng)滅菌的眼科手術(shù)剪徹底將表皮組織剪碎，加 入0. 25%胰酶/0. 02%EDTA徹底消化真皮，并用吸頭反復(fù)吹打3分鐘；加入血清中止消化， 將所得的表皮細(xì)胞混懸液通過100目的濾器過濾，去除未消化分離的組織細(xì)胞；將得到 的細(xì)胞懸液離心，室溫下1200rpm/min， 5分鐘，得到的沉淀即為多種表皮細(xì)胞(黑色素 細(xì)胞，表皮干細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，以及少量的成纖維細(xì)胞)；用K-SFM培養(yǎng)液清洗一次 細(xì)胞后，將其用已經(jīng)配置好的黑色素細(xì)胞培養(yǎng)液按照1X 105cell/cra2—2X 105cell/cm2重 懸細(xì)胞，并將其接種到已經(jīng)用collageIV包被好的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；隔天換一次培養(yǎng)液，大 約10-14天，黑色素細(xì)胞即可長滿培養(yǎng)瓶；
(3)人類黑色素細(xì)胞的鑒定
采用以下(3)2) -4)所述的三種方法中的一種或同時采用2-3種進行黑色素細(xì)胞鑒
定
1)制備細(xì)胞爬片將培養(yǎng)的原代人類黑色素細(xì)胞按照4X104Cell/Cm2密度接種于放置蓋
玻片的六孔板中，24小時后貼壁生長到70%時終止培養(yǎng)，制備爬片；2) L-D0PA染色鑒定將上步所得細(xì)胞爬片經(jīng)4'CPBS洗2次，5%甲醛固定30min，加入 0.2%L-doPa, 37。C染色5小時，結(jié)束染色后用PBS洗3次，10%甲醛后固定20min，甘油 封片后在顯微鏡下觀察，黑色素細(xì)胞中含有大量被L-dopa染色的黑色素顆粒；
3) 人類黑色素細(xì)胞特異性抗體MART-1免疫熒光染色將(3)中1)步所得細(xì)胞爬片，4 。CPBS洗2次，4y。多聚甲醛固定30min， 4'C PBS洗3次，每次5分鐘，用正常山羊血清 封閉30min,加一抗(MART-1用PBS按照1: 100-1: 200倍稀釋)，4度冰箱保濕過夜；4 。C PBS洗3次，每次5分鐘，加入二抗(德克薩斯紅，用PBS按照1: 200稀釋)，室溫 保濕避光孵育l小時；0. WDAPI染液復(fù)染細(xì)胞核，室溫避光孵育10min， PBS洗3次，每 次5分鐘，緩沖甘油封片，在綠光激發(fā)下，相差熒光顯微鏡觀察可見黑色素細(xì)胞呈強烈 紅色熒光；
3)電鏡照片按常規(guī)方法收集細(xì)胞，制備掃描電鏡照片，觀察到細(xì)胞中大量黑色素顆粒。
本發(fā)明解決的第一個技術(shù)問題主要分以下幾個步驟 I利用(包括以上所得的)人類黑色素細(xì)胞對美白劑的毒性進行分析；
(l).美白劑貯備溶液的配制
PEP液的配置將2-丙二醇、無水乙醇和無菌雙蒸水按照5: 3: 2配置 PEH液的配置將PEP液用0. Olmol/L的PBS稀釋10倍配置；
以曲酸(kojicacid)和熊果苷(arbutin)作為美白劑毒性試驗的對照參考標(biāo)準(zhǔn)品， 曲酸、熊果苷和待測化學(xué)物質(zhì)用PEH液溶解(一般使用的貯備液濃度為lmg/ml)，并用 0.22um濾器過濾除菌，分裝，-20度保存；
(2)按步驟I所述方法制備黑色素細(xì)胞，將生長至80%-90%融合的人類黑色素細(xì)胞用 0.25。/。胰酶/0.02y。EDTA消化，1200rpm/min， 5rain離心，得到的細(xì)胞沉淀，用黑色素細(xì)胞 完全培養(yǎng)液制成懸液，1X10、ell/孔的密度(每孔100ul)接種于96孔板，37度，5%
的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天；(3)用黑色素細(xì)胞完全培養(yǎng)液將待測化學(xué)物質(zhì)溶解至不同的待測濃度，將96孔板中原來 的培養(yǎng)液移走，加入新鮮的含有待測美白劑的培養(yǎng)液液(每孔200ul， 180ul基礎(chǔ)培養(yǎng)液, 20ul含藥物的PEH液)，同時設(shè)立陽性對照孔(有細(xì)胞，加入藥物為SDS)，陰性^"照孔(有 細(xì)胞，不加藥物，僅20ulPEH液)和空白孔(無細(xì)胞，不加藥物，僅20ul的PEH液)，37
度，5。/。的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天；
(4) 加入MTT溶液和DMSO溶液在每孔中加入已經(jīng)配置好的5mg/ml的MTT溶液20ul，在 37度孵化4小時，移走上清液，每孔中加入DMSO 150ul， 37度孵化30min，充分混勻后 用酶標(biāo)儀在570nm處測量每孔的吸光度；
(5) 結(jié)果的分析細(xì)胞活力抑制率=[1一(各濃度平均吸光度值一空白孔平均吸光度值)+ (對照組平均吸光度值一空白孔平均吸光度值)]X100%;根據(jù)抑制率曲線，計算得出待
測藥物的致死劑量范圍以及半數(shù)致死劑量(IC50)，即為該美白劑的毒性指標(biāo)； II、利用人類黑色素細(xì)胞對美白物質(zhì)進行功效分析 該美白劑對黑色素細(xì)胞的功效實驗采用兩種方法(1)黑色素細(xì)胞黑色素含量的改變
1) 按步驟I (1)用PEH液將待測物質(zhì)溶解成不同濃度的溶液，用黑色素細(xì)胞基礎(chǔ)培 養(yǎng)液(K-SFM，l(m胎牛血清，L-谷氨酰胺，胰島素)溶解至待測的終濃度，以質(zhì)量濃度為 20umol/L的a -MSH作為美白功效實驗的陽性對照;
2) 原代黑色素細(xì)胞的制備按上述培養(yǎng)制備黑色素細(xì)胞，按密度lX10Scell/孔接種 于6孔板；
3)待測化學(xué)物質(zhì)干預(yù)將6孔板中原來的培養(yǎng)液移走，每孔加入1000ul含待測化 學(xué)物質(zhì)的培養(yǎng)液(900ul基礎(chǔ)培養(yǎng)液+100ul含待測化學(xué)物質(zhì)的PEH液)，同時設(shè)立陽性對 照孔(有細(xì)胞，加入藥物為a-MSH)，陰性對照孔(有細(xì)胞，不加藥物，僅100ulPEH液)， 37度，5%的0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天，每隔兩天換液一次；4) 收集藥物處理以后的細(xì)胞移走培養(yǎng)液，用冷的PBS清洗兩遍，用細(xì)胞刮刀將不同
細(xì)胞處理組以及陽性、陰性對照組的細(xì)胞分別收集到不同的EP管中，10000rpm/min， 4 度離心lmin收集細(xì)胞;
5) 裂解細(xì)胞，釋放黑色素顆粒收集后的細(xì)胞用1NNaOH溶液150ul溶解，并在100 度下加熱IOmin，將獲得的每種溶有各組處理后細(xì)胞的1NNaOH溶液100ul加入到96孔 中；
6) 每孔細(xì)胞蛋白濃度的分析在96孔板中每孔加入99ul protein assay和lul IN NaOH 溶解的細(xì)胞溶液，每孔細(xì)胞設(shè)立三個測試組；
7) 酶標(biāo)儀測量及結(jié)果分析用酶標(biāo)儀在405nm處測量步驟(5)加入96孔中各孔的吸 光度，得到每孔的黑色素含量的吸光度值；用酶標(biāo)儀在490nm處測量步驟(6)加入96 孔板中各孔的吸光度，得到每孔的蛋白濃度吸光度值；
黑素合成抑制率=[1-(藥物孔黑色素含量的吸光度值+藥物孔蛋白濃度的吸光度值)+
(陰性對照組黑色素含量的吸光度值+陰性對照組蛋白濃度的吸光度值)]xiooy。；
(2)黑色素細(xì)胞酪氨酸酶活性的改變 1)同步驟III (1)1) -4);
5) 裂解細(xì)胞，釋放黑色素顆粒收集后的細(xì)胞用細(xì)胞裂解液(lysisbuffer) (0.1M 磷酸鹽緩沖液，含有質(zhì)量百分比W的Triton-X-100和100ug/ml的苯甲基磺酰氟)150ul 溶解，用聲裂法充分裂解(操作均在冰上進行)，充分裂解后，13000rpm/min， 4度離心 20min;得到的上清液即含酪氨酸酶的胞質(zhì)蛋白；
6) 每孔細(xì)胞蛋白濃度的分析在96孔板中每孔加入98ul protein assay和2ul細(xì)胞裂 解液溶解的胞質(zhì)蛋白，每孔細(xì)胞設(shè)立三個測試組；用酶標(biāo)儀在490nm處測量各孔的蛋白 濃度的吸光度值；
7) 酪氨酸酶活性試驗在96孔板中每孔加入90ul各孔含胞質(zhì)蛋白的細(xì)胞裂解液，lOul 2mg/ml的L-DOPA溶液，對照組為90ul不含蛋白的細(xì)胞裂解液和10ul 2mg/ml的 L-DOPA溶液，因為無色的L-D0PA在胞質(zhì)蛋白中所含的酪氨酸酶的作用下會變成黑色的 多巴醌，而在無酪氨酸酶的作用下，無色的L-DOPA也會在空氣中的氧化作用下慢慢變黑； 所以在37度下反應(yīng)1小時，每十分鐘用酶標(biāo)儀在475nm處測量一次各孔的吸光度，即通 過黑色多巴醌的吸光度來反應(yīng)酪氨酸酶的活性；
8)結(jié)果分析酪氨酸酶活性抑制率=[1-(各藥物濃度孔的吸光度值+藥物孔蛋白濃 度的吸光度值)+ (陰性對照孔的吸光度值+陰性對照組蛋白濃度的吸光度值).]X 100%。
所述的裂解酶dispasell為商品化購買，使用質(zhì)量濃度為0. 25%裂解酶。 所述的IV型膠原(collageIV)，主要成份為來源于人類胎盤的IV型膠原粉末，商品 化購自sigma公司。
所述的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基KSM (Keratinocyte Serum-Free Medium )為商業(yè)化 購自國外公司，如美國BioWhittaker公司的KBM(Keratinocyte Basal Medium)或GIBCO 公司的DK-SFM (Defined Keratinocyte Serum Free Medium);
所述的胎牛血清(fetal bovine serum)為商業(yè)化購自GIBCO公司的FBS。
所述的黑色素細(xì)胞培養(yǎng)液中的輔助因子insulin, TPA， IBMX, transpferrin, CT 均商業(yè)化購自sigma公司；L-谷氨酰胺商業(yè)化購自invitrogen公司；堿性成纖維細(xì)胞生 長因子和表皮生長因子商業(yè)化購自p印rotech公司。
所述的MTT英文全稱為3-(4, 5) -dimethylthiahiazo (-z-yl) -3， 5-di- phenytetraz oliumromide，漢語化學(xué)名為3-(4， 5-二甲基噻唑-2)-2， 5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名 噻唑藍，是一種黃顏色的染料，MTT比色法是一種常用的檢測細(xì)胞存活和生長的方法。
所述的黑色素細(xì)胞促進因子a-MSH作為促進黑色素顆粒生成的物質(zhì)，曲酸(kojid
acid)和熊果苷(arbutin)作為抑制黑色素顆粒生成的標(biāo)準(zhǔn)美白物質(zhì)，均商品化購自sigma公司。
所述作為黑色素細(xì)胞酪氨酸酶活性反應(yīng)底物的 L-DOPA(3.4-Dihydroxy-L-phenylalanine)商品化購自sigma公司。
有益效果本發(fā)明建立了人類原代黑色素細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)，所培養(yǎng)的細(xì)胞分裂增 殖能力強，具有人類活體黑色素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素顆粒的功能，能滿足美白劑毒性和功效 研究的需要。由于人工培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化程度高、批間差異??；人工培養(yǎng)的人類 黑色素細(xì)胞比以往實驗所用的人類或者鼠類黑色素瘤細(xì)胞更接近于人類天然皮膚實驗。 且全程采用標(biāo)準(zhǔn)化的黑色素細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液，明確待測藥物在對黑色素細(xì)胞的毒性和美 白功效上的作用，因而其應(yīng)用于毒性和功效性檢驗的方式和檢測指標(biāo)更符合實際情況， 可以代替整體動物和人類皮膚，直接應(yīng)用于化學(xué)品、化妝品、藥品等健康相關(guān)產(chǎn)品中美 白物質(zhì)的毒性和功效的試驗。
具體實施例方式
實施例l
I 、人類皮膚原代黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 G)人類皮膚黑色素細(xì)胞培養(yǎng)液的配置 i).配制人類黑色素細(xì)胞培養(yǎng)液
A.完全培養(yǎng)液將角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)液K-SFM (Keratinocyte Serum-Free Medium )與胎牛血清按體積比9: 1混合，并添加以下輔助因子氫化可的松 (Hydrocortisone),其終濃度為0.4ug/ML;牛胰島素(insuiiin)，其終濃度為10ug/ML; L-谷氨酰胺(L-ghit咖ine)，其終濃度為6mmol; 12-o沖四烷酰佛波醋酸酯-B (簡寫TPA， 英文名12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate)，其終濃度為81.06nmol/L; 3-異丁基-l-甲基 黃嘌呤(簡寫為IBMX，即3-isobutyl-l-methybcantWne)，其終濃度為O.lnmoi/L;轉(zhuǎn)鐵 蛋白(transferrin)'其終濃度為10ug/ML;霍亂毒素(choleratoxin, CT)，其終濃度為10ng/ML;堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-FGF)和表皮生長因子(EGF)，兩者的終濃度 均為10ng/ML;
B.基礎(chǔ)培養(yǎng)液K-SFM與10%胎牛血清按體積比9: l混合，僅添加終濃度為6mmo1 的L-谷氨酰胺和終濃度為10ug/ML的胰島素；
2)細(xì)胞培養(yǎng)瓶的包被將2ml 50ug/ml IV型膠原包被液加入一個新的25ml塑料培養(yǎng)瓶 中，使包被液覆蓋在培養(yǎng)瓶的底部，過夜室溫孵育。將包被液吸出，室溫下晾干2小時 備用。
(2)人類原代黑色素細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
1) 將外科手術(shù)環(huán)切下的幼兒新鮮包皮用含100 U/mL青霉素、100 U&/mL鏈霉素的 0. 01mol/L的PBS緩沖液徹底清洗2次；然后在無菌條件下去除皮下脂肪和結(jié)締組織。將 清洗干凈的包皮剪切成約2.0mmX3.0nim的皮片；將皮片展開，表皮朝向上方浸泡于質(zhì)量 濃度0. 25W的裂解酶(Dispases II)中37。C消化2±0. 5小時。
2) 將分離的皮片從DispasesII中取出，用鑷子輕輕將表皮和真皮分離，將表皮收集在含 有雙抗的0.01mol/L的PBS中。將表皮用此PBS液徹底清洗2次，用滅菌的眼科手術(shù)剪 將表皮剪碎，加入0.25免胰酶/0.02WEDTA消化真皮，反復(fù)吹打3分鐘。加入血清中止消 化，將所得的表皮細(xì)胞混懸液通過100目的濾器過濾，去除未消化分離的組織細(xì)胞。將 得到的細(xì)胞懸液室溫下1200rpm/min離心5分鐘。得到的沉淀即為多種表皮細(xì)胞(黑色 素細(xì)胞，表皮干細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，以及少量的成纖維細(xì)胞)。用K-SFM培養(yǎng)液清洗一 次細(xì)胞后，將其用已經(jīng)配置好的黑色素細(xì)胞培養(yǎng)液按照lX105cell/Cm2—2X105cell/cm2 重懸細(xì)胞，并將其接種到已經(jīng)用collageW包被好的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。隔天換一次培養(yǎng)液， 大約12天，黑色素細(xì)胞即可長滿培養(yǎng)瓶。
3.人類黑色素細(xì)胞的鑒定
1)制備細(xì)胞爬片原代人類黑色素細(xì)胞按4X104cell/cra2密度接種于放置蓋玻片的六孔板中，24小時后貼壁生長到70%時終止培養(yǎng)，制備爬片。
2)將1)步所得細(xì)胞爬片經(jīng)4'CPBS洗2次，5%甲醛固定30min。加入0. 2%L-dopa， 37 'C染色5小時，結(jié)束染色后用PBS洗3次，1(^甲醛后固定20min。甘油封片后在顯微鏡 下觀察，黑色素細(xì)胞中含有大量被L-d叩a染色的黑色素顆粒。
II.利用人類黑色素細(xì)胞對美白劑的毒性進行分析；
(l).美白劑配制-
PEP液的配置將2-丙二醇無水乙醇無菌雙蒸水按照5: 3: 2配置-
PEH液的配置將PEP液用0. Olmol/L的PBS稀釋10倍配置。
以曲酸(kojicacid)和熊果苷(arbutin)作為美白劑毒性試驗的對照參考標(biāo)準(zhǔn)品。 曲酸、熊果苷和待測化學(xué)物質(zhì)用PEH液溶解(一般使用的溶解濃度為lmg/ml),并用0. 22ura 濾器過濾除菌，分裝，-20度保存。
(2)按步驟I所述方法制備黑色素細(xì)胞，將生長至80%-90%融合的人類黑色素細(xì)胞用 0.25免胰酶/0.0296EDTA消化，1200rpm/min， 5min離心，得到的細(xì)胞沉淀，用黑色素細(xì)胞 完全培養(yǎng)液制成懸液，1X10、ell/孔的密度(每孔100ul)接種于96孔板。37度，5% 的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。
(3) 用PEH液將待測化學(xué)物質(zhì)溶解成不同濃度的溶液，用黑色素細(xì)胞完全培養(yǎng)液溶解至待 測的終濃度。將96孔板中原來的培養(yǎng)液移走，加入新鮮的含有藥物的培養(yǎng)液(每孔200ul， 180ul基礎(chǔ)培養(yǎng)液，20ul含藥物的PEH液)，同時設(shè)立陽性對照孔(有細(xì)胞，加入藥物為 SDS),陰性對照孔(有細(xì)胞，不加藥物，僅20ulPEH液)和空白孔(無細(xì)胞，不加藥物， 僅20ul的PEH液)。37度，5%的0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。
(4) 加入MTT溶液和DMSO溶液在每孔中加入已經(jīng)配置好的5mg/ml的MTT溶液20ul，在 37度孵化4小時，移走上清液，每孔中加入DMSO 150ul， 37度孵化30min，充分混勻后 用酶標(biāo)儀在570nm處測量每孔的吸光度。(5〉結(jié)果的分析細(xì)胞活力抑制率-[l一(各濃度平均吸光度值一空白孔平均吸光度值)+ (對照組平均吸光度值—空白孔平均吸光度值)]X100%。根據(jù)抑制率曲線，計算得出待
測藥物的致死劑量范圍以及半數(shù)致死劑量ac50)。 ffl、利用人類黑色素細(xì)胞對美白物質(zhì)進行功效分析 (1).黑色素細(xì)胞黑色素含量的改變 "按步驟n (i)用PEH液將待測物質(zhì)溶解成不同濃度的溶液，用黑色素細(xì)胞基礎(chǔ)培
養(yǎng)液(K-SFM， 10%胎牛血清，L-谷氨酰胺，胰島素)溶解至待測的終濃度。以質(zhì)量濃度為 20umo/L的a -MSH作為美白功效實驗的陽性對照。
2)原代黑色素細(xì)胞的制備按步驟I (2)制備黑色素細(xì)胞，按密度1X10^ell/孔 接種于6孔板。
3)待測化學(xué)物質(zhì)干預(yù)將6孔板中原來的培養(yǎng)液移走，每孔加入1000ul含待測化 學(xué)物質(zhì)的培養(yǎng)液(900ul基礎(chǔ)培養(yǎng)液+100ul含待測化學(xué)物質(zhì)的PEH液〉，同時設(shè)立陽性對 照孔(有細(xì)胞，加入藥物為a-MSH)，陰性對照孔(有細(xì)胞，不加藥物，僅iOOulPEH液)。 37度，5%的0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天，每隔兩天換液一次。
4) 收集藥物處理以后的細(xì)胞移走培養(yǎng)液，用冷的PBS清洗兩遍，用細(xì)胞刮刀將不同 細(xì)胞處理組以及陽性、陰性對照組的細(xì)胞分別收集到不同的EP管中，10000rpffl/min， 4 度離心lmin收集細(xì)胞。
5) 裂解細(xì)胞，釋放黑色素顆粒收集后的細(xì)胞用1NNaOH溶液150ul溶解，并在100 度下加熱10miti，將獲得的每種溶有各組處理后細(xì)胞的1NNaOH溶液100ul加入到96孔 中。
6) 每孔細(xì)胞蛋白濃度的分析在96孔板中每孔加入99ui pfotein assay和lul IN NaOH 溶解的細(xì)胞溶液，每孔細(xì)胞設(shè)立三個測試組。
7) 酶標(biāo)儀測量及結(jié)果分析用酶標(biāo)儀在405nm處測量步驟(5)加入96孔中各孔的吸光度，得到每孔的黑色素含量的吸光度值。用酶標(biāo)儀在490nrn處測量步驟(6)加入96 孔板中各孔的吸光度，得到每孔的蛋白濃度吸光度值。
黑素合成抑制率=[1-(藥物孔黑色素含量的吸光度值+藥物孔蛋白濃度的吸光度值)+ (陰性對照組黑色素含量的吸光度值+陰性對照組蛋白濃度的吸光度值)]X100% 實施例2
I、人類皮膚原代黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 (1)人類皮膚黑色素細(xì)胞培養(yǎng)液的配置
1) 配制人類黑色素細(xì)胞培養(yǎng)液
A. 完全培養(yǎng)液將角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)液K-SFM (Keratinocyte Serum-Free Medium )與胎牛血清按體積比9: 1混合，并添加以下輔助因子氫化可的松
(Hydrocortisone)，其終濃度為0.4ug/ML;牛胰島素(insuilin),其終濃度為10ug/ML; L-谷氨酰胺(L-glutamine)，其終濃度為6mmol; 12-o-十四垸酰佛波醋酸酯-13 (簡寫TPA， 英文名12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate)，其終濃度為81.06nmol/L; 3-異丁基-l-甲基 黃嘌呤(簡寫為IBMX，即3-isobutyl-l-methylxanthine),其終濃度為0.1nmol/L;轉(zhuǎn)鐵 蛋白(transferrin)，其終濃度為10ug/ML;霍亂毒素(choleratoxin， CT)，其終濃度為 10ng/ML;堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-FGF)和表皮生長因子(EGF)，兩者的終濃度 均為lOng/ML;
B. 基礎(chǔ)培養(yǎng)液K-SFM與10%胎牛血清按體積比9: l混合，僅添加終濃度為6mrno1 的L-谷氨酰胺和終濃度為10ug/ML的胰島素；
2) 細(xì)胞培養(yǎng)瓶的包被將3ml 50ug/ml collageIV包被液加入一個新的25ml培養(yǎng)瓶中， 使包被液覆蓋在培養(yǎng)瓶的底部，過夜室溫孵育。將包被液吸出，塑料培養(yǎng)瓶在室溫下放 置約3小時晾干，放在4'C保存?zhèn)溆谩?br> (2)人類原代黑色素細(xì)胞的分離與培養(yǎng)1) 將外科手術(shù)環(huán)切下的幼兒新鮮包皮用含100 U/mL青霉素、100 ug/mL鏈霉素的 0. 01mol/L的PBS緩沖液徹底清洗2-3次；然后在無菌條件下去除皮下脂肪和結(jié)締組織。 將清洗干凈的包皮剪切成約2.0iranX3.0ram的皮片；將皮片展開，表皮朝向上方浸泡于質(zhì) 量濃度0. 25W的裂解酶(DispasesI1)中4'C過夜15小時。
2) 將分離的皮片從DispasesII中取出，用鑷子輕輕將表皮和真皮分離，將表皮收集在含 有雙抗(100 U/mL青霉素、100 ug/mL鏈霉素)的0. 01mol/L的PBS中。將表皮用此PBS 液徹底清洗2-3次，用已經(jīng)滅菌的眼科手術(shù)剪徹底將表皮組織剪碎，加入0.25%胰酶 /0.02能DTA徹底消化真皮，并用吸頭反復(fù)吹打3分鐘。加入血清中止消化，將所得的表 皮細(xì)胞混懸液通過100目的濾器過濾，去除未消化分離的組織細(xì)胞。將得到的細(xì)胞懸液 離心，室溫下1200rpm/min， 5分鐘。得到的沉淀即為多種表皮細(xì)胞(黑色素細(xì)胞，表皮 干細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，以及少量的成纖維細(xì)胞)。用K-SFM培養(yǎng)液清洗一次細(xì)胞后，將 其用已經(jīng)配置好的黑色素細(xì)胞培養(yǎng)液按照lX105cell/cm2—2X105cell/cm2重懸細(xì)胞， 并將其接種到已經(jīng)用collageIV包被好的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。隔天換一次培養(yǎng)液，大約10-14 天，黑色素細(xì)胞即可長滿培養(yǎng)瓶。
(3)人類黑色素細(xì)胞的鑒定
1) 制備細(xì)胞爬片將培養(yǎng)的原代人類黑色素細(xì)胞按照4Xl(^cell/ci^密度接種于放置蓋 玻片的六孔板中，24小時后貼壁生長到70%時終止培養(yǎng)，制備爬片。
2) 將l)步所得細(xì)胞爬片，4'CPBS洗2次，4%多聚甲醛固定30min。 4°C PBS洗3次， 每次5分鐘，用正常山羊血清封閉30min。加一抗(MART-1用PBS按照1: 100-1: 200 倍稀釋)，4度冰箱保濕過夜。4。C PBS洗3次，每次5分鐘，加入二抗(德克薩斯紅， 用PBS按照1: 200稀釋)，室溫保濕避光孵育1小時。0.1MAPI染液復(fù)染細(xì)胞核，室溫 避光孵育10min， PBS洗3次，每次5分鐘，緩沖甘油封片'在綠光激發(fā)下，相差熒光顯 微鏡觀察可見黑色素細(xì)胞呈強烈紅色熒光。II.利用人類黑色素細(xì)胞對美白劑的毒性進行分析；
(l).美白劑貯備液配制-
PEP液的配置將2-丙二醇無水乙醇無菌雙蒸水按照5: 3: 2配置-
PEH液的配置將PEP液用0. 01mol/L的PBS稀釋10倍配置。
以曲酸(kojicacicl)和熊果苷(arbutin)作為美白劑毒性試驗的對照參考標(biāo)準(zhǔn)品。 曲酸、熊果苷和待測化學(xué)物質(zhì)用PEH液溶解(一般使用的貯備液濃度為lmg/Rd),并用 0.22um濾器過濾除菌，分裝，-20度保存。
(2)按步驟I所述方法制備黑色素細(xì)胞，將生長至80%-90%融合的人類黑色素細(xì)胞用 0.25《胰酶/0.02XEDTA消化，1200rpm/min， 5min離心，得到的細(xì)胞沉淀，用黑色素細(xì)胞 完全培養(yǎng)液制成懸液，1X10"cell/孔的密度(每孔幽l)接種于恥孔板。37度，5% 的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。
(3) 用黑色素細(xì)胞完全培養(yǎng)液將等測物質(zhì)溶解至待測的終濃度。將96孔板中原來的培養(yǎng) 液移走，加入新鮮的含有藥物的培養(yǎng)液(每孔200ul， 180ul基礎(chǔ)培養(yǎng)液，20ul含藥物的 PEH液)，同時設(shè)立陽性對照孔(有細(xì)胞，加入藥物為SDS)，陰性對照孔(有細(xì)胞，不加 藥物，僅20ulPEH液)和空白孔(無細(xì)胞，不加藥物，僅20ul的PEH液)。37度，5%的 C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。
(4) 加入MTT溶液和DMSO溶液在每孔中加入已經(jīng)配置好的5mg/ml的MTT溶液20ul，在 37度孵化4小時，移走上清液，每孔中加入DMS0 150ul， 37度孵化30min，充分混勻后 用酶標(biāo)儀在570nrn處測量每孔的吸光度。
(5) 結(jié)果的分析細(xì)胞活力抑制率=[1一(各濃度平均吸光度值一空白孔平均吸光度值)+ (對照組平均吸光度值一空白孔平均吸光度值)]X100%。根據(jù)抑制率曲線'計算得出待
測藥物的致死劑量范圍以及半數(shù)致死劑量(IC50)。
ffl、利用人類黑色素細(xì)胞對美白物質(zhì)進行功效分析采用黑色素細(xì)胞酪氨酸酶活性改變檢測美白功效
1) 按步驟II (1)用PEH液將待測物質(zhì)溶解成不同濃度的溶液，用黑色素細(xì)胞基礎(chǔ)培 養(yǎng)液(K-SFM, 10%胎牛血清，L-谷氨酰胺，胰島素)溶解至待測的終濃度。以質(zhì)量濃度為 20umol/L的a -MSH作為美白功效實驗的陽性對照。
2) 原代黑色素細(xì)胞的制備按步驟I (2)制備黑色素細(xì)胞，按密度lX10Scell/孔 接種于6孔板。
3)待測化學(xué)物質(zhì)干預(yù)將6孔板中原來的培養(yǎng)液移走，每孔加入lOOOul含待測化 學(xué)物質(zhì)的培養(yǎng)液(900ul基礎(chǔ)培養(yǎng)液+100ul含待測化學(xué)物質(zhì)的PEH液)，同時設(shè)立陽性對 照孔(有細(xì)胞，加入藥物為a-MSH)，陰性對照孔(有細(xì)胞，不加藥物，僅100ulPEH液)。 37度，5%的0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天，每隔兩天換液一次。
4)收集藥物處理以后的細(xì)胞移走培養(yǎng)液，用冷的PBS清洗兩遍，用細(xì)胞刮刀將不同 細(xì)胞處理組以及陽性、陰性對照組的細(xì)胞分別收集到不同的EP管中，10000rpm/min， 4 度離心lmin收集細(xì)胞。
5) 裂解細(xì)胞，釋放黑色素顆粒收集后的細(xì)胞用細(xì)胞裂解液(lysisbuffer) (0.1M 磷酸鹽緩沖液，含有質(zhì)量百分比W的Triton-X-100和100ug/ml的苯甲基磺酰氟)150ul 溶解，用聲裂法充分裂解(操作均在冰上進行)，充分裂解后，13000rpm/min， 4度離心 20min。得到的上清液即含酪氨酸酶的胞質(zhì)蛋白。
6) 每孔細(xì)胞蛋白濃度的分析在96孔板中每孔加入98ul protein assay和2ul細(xì)胞裂 解液溶解的胞質(zhì)蛋白，每孔細(xì)胞設(shè)立三個測試組。用酶標(biāo)儀在490nm處測量各孔的蛋白 濃度的吸光度值。
7) 酪氨酸酶活性試驗在96孔板中每孔加入90ul各孔含胞質(zhì)蛋白的細(xì)胞裂解液， IOul 2mg/ml的L-DOPA溶液。對照組為90ul不含蛋白的細(xì)胞裂解液和10ul 2mg/ml的 L-DOPA溶液。因為無色的L-DOPA在胞質(zhì)蛋白中所含的酪氨酸酶的作用下會變成黑色的多巴醌，而在無酪氨酸酶的作用下，無色的L-DOPA也會在空氣中的氧化作用下慢慢變黑。 所以在37度下反應(yīng)1小時，每+分鐘用酶標(biāo)儀在475nm處測量一次各孔的吸光度，即通 過黑色多巴醌的吸光度來反應(yīng)酪氨酸酶的活性。
8)結(jié)果分析酪氨酸酶活性抑制率=[1-(各藥物濃度孔的吸光度值+藥物孔蛋白濃 度的吸光度值)+ (陰性對照孔的吸光度值+陰性對照組蛋白濃度的吸光度值)]X100%
實施例3
I、人類皮膚原代黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定
0) 人類皮膚黑色素細(xì)胞培養(yǎng)液的配置
1) 配制人類黑色素細(xì)胞培養(yǎng)液-
A. 完全培養(yǎng)液將角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)液K-SFM (Keratinocyte Serum-Free Medium )與胎牛血清按體積比9: 1混合，并添加以下輔助因子氫化可的松
(Hydrocortisone)，其終濃度為0.4ug/ML;牛胰島素(insuilin)，其終濃度為10ug/ML; L-谷氨酰胺(L-glutamine)，其終濃度為6mmol; 12-o-十四烷酰佛波醋酸酯-13 (簡寫TPA， 英文名12-o-tetradecanoylphorboi-B-acetate)，其終濃度為81.06nmol/L; 3-異丁基-l-甲基 黃嘌呤(簡寫為IBMX，艮卩3-isobutyl-l-methylxanthine)，其終濃度為0.1nmol/L;轉(zhuǎn)鐵 蛋白(transfenin)，其終濃度為10ug/ML;霍亂毒素(choleratoxin, CT)，其終濃度為 10ng/ML;堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-FGF)和表皮生長因子(EGF)，兩者的終濃度 均為lOng/ML;
B. 基礎(chǔ)培養(yǎng)液K-SFM與10%胎牛血清按體積比9: l混合，僅添加終濃度為6mmo1 的L-谷氨酰胺和終濃度為10ug/ML的胰島素；
2).細(xì)胞培養(yǎng)瓶的包被將2-3ml 50ug/ml collageIV包被液加入一個新的25ml塑料培 養(yǎng)瓶中，使包被液覆蓋在培養(yǎng)瓶的底部，過夜室溫孵育。將包被液吸出，塑料培養(yǎng)瓶在
室溫下放置約2-3小時晾干，或?qū)⒁呀?jīng)包被好的培養(yǎng)瓶放在4。C保存?zhèn)溆谩?2)人類原代黑色素細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
1) 將外科手術(shù)環(huán)切下的幼兒新鮮包皮用含100 U/mL青霉素、100 ug/mL鏈霉素的 0. 01mol/L的PBS緩沖液徹底清洗2-3次；然后在無菌條件下去除皮下脂肪和結(jié)締組織。 將清洗干凈的包皮剪切成約2.0mmX3.0mm的皮片；將皮片展開，表皮朝向上方浸泡于質(zhì) 量濃度0. 25呢的裂解酶(DispasesI1)中4"C過夜12小時。
2) 將分離的皮片從DispasesII中取出，用鑷子輕輕將表皮和真皮分離，將表皮收集在含 有雙抗(100 U/mL青霉素、100 ug/mL鏈霉素)的0. 01mol/L的PBS中。將表皮用此PBS 液徹底清洗2-3次，用已經(jīng)滅菌的眼科手術(shù)剪徹底將表皮組織剪碎，加入0.25%胰酶 /0.02先EDTA徹底消化真皮，并用吸頭反復(fù)吹打3分鐘。加入血清中止消化，將所得的表 皮細(xì)胞混懸液通過100目的濾器過濾，去除未消化分離的組織細(xì)胞。將得到的細(xì)胞懸液 離心，室溫下1200rpm/min， 5分鐘。得到的沉淀即為多種表皮細(xì)胞(黑色素細(xì)胞，表皮 干細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，以及少量的成纖維細(xì)胞)。用K-SFM培養(yǎng)液清洗一次細(xì)胞后，將 其用已經(jīng)配置好的黑色素細(xì)胞培養(yǎng)液按照lX105cell/Cm2—2X105cell/Cm2重懸細(xì)胞， 并將其接種到已經(jīng)用collageIV包被好的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。隔天換一次培養(yǎng)液，大約10-14 天，黑色素細(xì)胞即可長滿培養(yǎng)瓶。
(3)人類黑色素細(xì)胞的電鏡鑒定將接種在培養(yǎng)皿中快速生長期的細(xì)胞用細(xì)胞刮刀刮下， 用電鏡固定液固定細(xì)胞，制備掃描電鏡照片，觀察到細(xì)胞中大量黑色素顆粒。
II.利用人類黑色素細(xì)胞對美白劑的毒性進行分析；
(l).美白劑貯備液配制
PEP液的配置將2-丙二醇無水乙醇無菌雙蒸水按照5: 3: 2配置
PEH液的配置將PEP液用0. Olmol/L的PBS稀釋10倍配置。
以曲酸(kojicacid)作為美白劑毒性試驗的對照參考標(biāo)準(zhǔn)品。曲酸、熊果苷和待測 化學(xué)物質(zhì)用PEH液溶解(一般使用的貯備注濃度為lmg/ml)，并用0. 22咖濾器過濾除菌，分裝，-20度保存。
(2)按步驟I所述方法制備黑色素細(xì)胞，將生長至80%-90%融合的人類黑色素細(xì)胞用 0. 25%胰酶/0. 02%EDTA消化，1200rpm/min, 5min離心，得到的細(xì)胞沉淀，用黑色素細(xì)胞 完全培養(yǎng)液制成懸液，1X10"cell/孔的密度(每孔100ul)接種于96孔板。37度，5% 的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。
(3) 用黑色素細(xì)胞完全培養(yǎng)液將待測化學(xué)物質(zhì)溶解至待測的終濃度。將96孔板中原來的 培養(yǎng)液移走，加入新鮮的含有藥物的培養(yǎng)液(每孔200ul， 180ul基礎(chǔ)培養(yǎng)液，20ui含藥 物的PEH液)，同時設(shè)立陽性對照孔(有細(xì)胞，加入藥物為SDS)，陰性對照孔(有細(xì)胞， 不加藥物，僅20ulPEH液)和空白孔(無細(xì)胞，不加藥物，僅20ul的PEH液)。37度，5% 的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。
(4) 加入MTT溶液和DMS0溶液在每孔中加入已經(jīng)配置好的5mg/ml的MTT溶液20ul,在 37度孵化4小時，移走上清液，每孔中加入DMS0150ul， 37度孵化30min，充分混勻后 用酶標(biāo)儀在570ntn處測量每孔的吸光度。
(5) 結(jié)果的分析細(xì)胞活力抑制率41—(各濃度平均吸光度值一空白孔平均吸光度值)+ (對照組平均吸光度值一空白孔平均吸光度值)]XiOO%。根據(jù)抑制率曲線，計算得出待
測藥物的致死劑量范圍以及半數(shù)致死劑量(IC50)。 III、利用人類黑色素細(xì)胞對美白物質(zhì)進行功效分析 同時采用兩種方法進行美白功效評價-O).黑色素細(xì)胞黑色素含量的改變
1) 按步驟II U)用PEH液將待測物質(zhì)溶解成不同濃度的溶液，用黑色素細(xì)胞基礎(chǔ)培 養(yǎng)液(K-SFM， 10%胎牛血清，L-谷氨酰胺，胰島素)溶解至待測的終濃度。以質(zhì)量濃度為 20umol/L的a -MSH作為美白功效實驗的陽性對照。
2) 原代黑色素細(xì)胞的制備按步驟I (2)制備黑色素細(xì)胞，按密度1Xl()Scell/孔接種于6孔板。
3)待測化學(xué)物質(zhì)干預(yù)將6孔板中原來的培養(yǎng)液移走，每孔加入lOOOul含待測化 學(xué)物質(zhì)的培養(yǎng)液(900ul基礎(chǔ)培養(yǎng)液+100ul含待測化學(xué)物質(zhì)的PEH液)，同時設(shè)立陽性對 照孔(有細(xì)胞，加入藥物為a-MSH)，陰性對照孔(有細(xì)胞，不加藥物，僅100ulPEH液)。 37度，5%的(]02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天，每隔兩天換液一次。
4) 收集藥物處理以后的細(xì)胞移走培養(yǎng)液，用冷的PBS清洗兩遍，用細(xì)胞刮刀將不同 細(xì)胞處理組以及陽性、陰性對照組的細(xì)胞分別收集到不同的EP管中，10000rpm/min， 4 度離心lmin收集細(xì)胞。
5) 裂解細(xì)胞，釋放黑色素顆粒收集后的細(xì)胞用1NNaOH溶液150ul溶解，并在100 度下加熱10min，將獲得的每種溶有各組處理后細(xì)胞的1NNaOH溶液100ul加入到96孔 中。
6) 每孔細(xì)胞蛋白濃度的分析在96孔板中每孔加入99ul protein assay和lul IN NaOH 溶解的細(xì)胞溶液，每孔細(xì)胞設(shè)立三個測試組。
7) 酶標(biāo)儀測量及結(jié)果分析用酶標(biāo)儀在405nm處測量步驟(5)加入96孔中各孔的吸 光度，得到每孔的黑色素含量的吸光度值。用酶標(biāo)儀在490nm處測量步驟(6)加入96 孔板中各孔的吸光度，得到每孔的蛋白濃度吸光度值。
黑素合成抑制率=[1-(藥物孔黑色素含量的吸光度值+藥物孔蛋白濃度的吸光度值)+ (陰性對照組黑色素含量的吸光度值+陰性對照組蛋白濃度的吸光度值)]><100%
(2)黑色素細(xì)胞酪氨酸酶活性的改變 1)同步驟III (1) 1) -4)。
5)裂解細(xì)胞，釋放黑色素顆粒收集后的細(xì)胞用細(xì)胞裂解液(lysis buffer) (0. 1M 磷酸鹽緩沖液，含有質(zhì)量百分比^的Triton-X-IOO和100ug/ml的苯甲基磺酰氟)150ul 溶解，用聲裂法充分裂解(操作均在冰上進行)，充分裂解后，13000rpm/min， 4度離心20min。得到的上清液即含酪氨酸酶的胞質(zhì)蛋白。
6) 每孔細(xì)胞蛋白濃度的分析在96孔板中每孔加入98ul protein assay和2ul細(xì)胞裂 解液溶解的胞質(zhì)蛋白，每孔細(xì)胞設(shè)立三個測試組。用酶標(biāo)儀在490nm處測量各孔的蛋白 濃度的吸光度值。
7) 酪氨酸酶活性試驗在96孔板中每孔加入卯ul各孔含胞質(zhì)蛋白的細(xì)胞裂解液， 10ul 2mg/ml的L-DOPA溶液。對照組為90ul不含蛋白的細(xì)胞裂解液和10ul 2mg/ml的 L-DOPA溶液。因為無色的L-DOPA在胞質(zhì)蛋白中所含的酪氨酸酶的作用下會變成黑色的 多巴醌，而在無酪氨酸酶的作用下，無色的L-DOPA也會在空氣中的氧化作用下慢慢變黑。 所以在37度下反應(yīng)1小時，每十分鐘用酶標(biāo)儀在475nm處測量一次各孔的吸光度，即通 過黑色多巴醌的吸光度來反應(yīng)酪氨酸酶的活性。
8)結(jié)果分析酪氨酸酶活性抑制率=[1-(各藥物濃度孔的吸光度值+藥物孔蛋白濃度的 吸光度值)+(陰性對照孔的吸光度值+陰性對照組蛋白濃度的吸光度值)]乂100%。
權(quán)利要求
1、一種利用人類皮膚黑色素細(xì)胞分析美白劑毒性和功效的方法，分以下幾個步驟I、毒性檢驗(1)美白劑貯備溶液的配制PEP液的配置將2-丙二醇、無水乙醇和無菌雙蒸水按照5∶3∶2配置；PEH液的配置將PEP液用0.01mol/L的PBS稀釋10倍配置；以十二烷基磺酸鈉(SDS)為毒性試驗的陽性對照物；；(2)將生長至80％-90％融合的人類黑色素細(xì)胞用0.25％胰酶/0.02％EDTA消化，1200rpm/min，5min離心，得到的細(xì)胞沉淀，用黑色素細(xì)胞完全培養(yǎng)液制成密度為1×104cell/孔的懸液，每孔100ul，接種于96孔板，37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天；(3)用黑色素細(xì)胞完全培養(yǎng)液將待測美白劑稀釋成不同終濃度的溶液，將96孔板中原來的培養(yǎng)液移走，每孔加入200ul新鮮的含有美白劑的溶液，即180ul基礎(chǔ)培養(yǎng)液與20ul含待測美白劑的PEH培養(yǎng)液混合同時設(shè)立陽性對照、陰性對照和空白對照；，37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天；(4)加入MTT溶液和二甲基亞砜(DMSO)溶液在每孔中加入已經(jīng)配置好的5mg/ml的MTT溶液20ul，在37℃孵化4小時，移走上清液，每孔中加入DMSO150ul，37℃孵化30min，充分混勻后用酶標(biāo)儀在570nm處測量每孔的吸光度；(5)結(jié)果分析細(xì)胞活力抑制率＝[1—(各濃度平均吸光度值—空白孔平均吸光度值)÷(對照組平均吸光度值—空白孔平均吸光度值)]×100％；根據(jù)抑制率曲線，計算得出待測物的致死濃度范圍以及IC50半數(shù)致死濃度，即為該美白劑的毒性指標(biāo)；II、功效分析該美白劑對黑色素細(xì)胞的功效實驗采用兩種方法(1)黑色素細(xì)胞黑色素含量的改變1)按步驟I(3)用黑色素細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液將待測美白劑溶解成不同終濃度的溶液，以質(zhì)量濃度為20umol/L的α-MSH作為美白功效實驗的陽性對照，根據(jù)試驗需要可增加曲酸或熊果苷作為美白劑的參照物質(zhì)，用于相對美白功效的評價；2)原代黑色素細(xì)胞的制備制備黑色素細(xì)胞，按密度1×105cell/孔接種于6孔板；3)待測美白劑干預(yù)將6孔板中原來的培養(yǎng)液移走，每孔加入1000ul含待測美白劑的培養(yǎng)液，其包含900ul基礎(chǔ)培養(yǎng)液+100ul含待測美白劑的PEH液，同時設(shè)立陽性對照、陰性對照和空白對照，37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天，每隔兩天換液一次；4)收集美白劑處理以后的細(xì)胞移走培養(yǎng)液，用冷的PBS清洗兩遍，用細(xì)胞刮刀將不同待測物處理組以及陽性、陰性對照組的細(xì)胞分別收集到不同的EP管中，10000rpm/min，4℃離心1min收集細(xì)胞；5)裂解細(xì)胞，釋放黑色素顆粒收集后的細(xì)胞用1N NaOH溶液150ul溶解，并在100℃下加熱10min，將獲得的每種溶有各組處理后細(xì)胞的1N NaOH溶液100ul加入到96孔中；6)每孔細(xì)胞蛋白濃度的分析在96孔板中每孔加入99ul蛋白染料和1ul1N NaOH溶解的細(xì)胞溶液，每孔細(xì)胞設(shè)立三個測試組；7)酶標(biāo)儀測量及結(jié)果分析用酶標(biāo)儀在405nm處測量步驟(5)加入96孔中各孔的吸光度，得到每孔的黑色素含量的吸光度值；用酶標(biāo)儀在490nm處測量步驟(6)加入96孔板中各孔的吸光度，得到每孔的蛋白濃度吸光度值；黑素合成抑制率＝[1-(待測物孔黑色素含量的吸光度值÷待測物孔蛋白濃度的吸光度值)÷(陰性對照組黑色素含量的吸光度值÷陰性對照組蛋白濃度的吸光度值)]×100％；(2)黑色素細(xì)胞酪氨酸酶活性的改變1)同步驟II(1)1)-4)；5)裂解細(xì)胞，釋放黑色素顆粒收集后的細(xì)胞用0.1M磷酸鹽緩沖液，含有質(zhì)量百分比1％的Triton-X-100和100ug/ml的苯甲基磺酰氟的細(xì)胞裂解液150ul溶解，用聲裂法充分裂解，操作均在冰上進行，充分裂解后，13000rpm/min，4℃離心20min；得到的上清液即含酪氨酸酶的胞質(zhì)蛋白；6)每孔細(xì)胞蛋白濃度的分析在96孔板中每孔加入98ul蛋白染液和2ul細(xì)胞裂解液溶解的胞質(zhì)蛋白，每孔細(xì)胞設(shè)立三個測試組；用酶標(biāo)儀在490nm處測量各孔的蛋白濃度的吸光度值；7)酪氨酸酶活性試驗在96孔板中每孔加入90ul各孔含胞質(zhì)蛋白的細(xì)胞裂解液，10ul 2mg/ml的L-DOPA溶液，對照組為90ul不含蛋白的細(xì)胞裂解液和10ul2mg/ml的L-DOPA溶液，因為無色的L-DOPA在胞質(zhì)蛋白中所含的酪氨酸酶的作用下會變成黑色的多巴醌，而在無酪氨酸酶的作用下，無色的L-DOPA也會在空氣中的氧化作用下慢慢變黑；所以在37℃下反應(yīng)1小時，每十分鐘用酶標(biāo)儀在475nm處測量一次各孔的吸光度，即通過黑色多巴醌的吸光度來反應(yīng)酪氨酸酶的活性；8)結(jié)果分析酪氨酸酶活性抑制率＝[1-(各待測物濃度孔的吸光度值÷待測物孔蛋白濃度的吸光度值)÷(陰性對照孔的吸光度值÷陰性對照組蛋白濃度的吸光度值)]×100％。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用人類皮膚黑色素細(xì)胞分析美白劑毒性和功效的方法， 其特征是所述的陽性對照、陰性對照和空白對照常用于細(xì)胞檢測試驗，分別指有細(xì) 胞只加陽性對照物，有細(xì)胞不加待測物和無細(xì)胞僅加培養(yǎng)液；所述的曲酸和熊果苷為已知的具有美白作用的參考化學(xué)物，可制備濃度為lmg/ml 的貯備溶液，并用0.22um濾器過濾除菌，分裝，-20'C保存?zhèn)溆谩?br> 3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用人類皮膚黑色素細(xì)胞分析美白劑毒性和功效的方法， 其中所用的的原代人類黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)主要分以下幾個步驟(1)人類皮膚黑色素細(xì)胞培養(yǎng)液的配置 1)配制人類黑色素細(xì)胞培養(yǎng)液A. 完全培養(yǎng)液將角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)液K-SFM與胎牛血清按體積比9: l混合， 并添加以下輔助因子氫化可的松，其終濃度為0.4Ug/ML;牛胰島素，其終濃度為10ug/ML; L-谷氨酰胺，其終濃度為6mmol; 12-0-十四烷酰佛波醋酸酯-13，其終濃 度為81.06腦ol/L; 3-異丁基-l-甲基黃嘌呤，其終濃度為O.lnmol/L;轉(zhuǎn)鐵蛋白，其終 濃度為10ug/ML;霍亂毒素，其終濃度為10ng/ML;堿性成纖維細(xì)胞生長因子和表皮 生長因子，兩者的終濃度均為10ng/ML;B. 基礎(chǔ)培養(yǎng)液:K-SFM與10%胎牛血清按體積比9:1混合，僅添加終濃度為6mmo1 的L-谷氨酰胺和終濃度為10ug/ML的胰島素；2)細(xì)胞培養(yǎng)瓶的包被將每毫升含50微克IV型膠原蛋白的包被液2-3ral加入一 個新的25ml塑料培養(yǎng)瓶中，使包被液覆蓋在培養(yǎng)瓶的底部，過夜或室溫孵育2小時， 將包被液吸出之后，或是將塑料培養(yǎng)瓶在室溫下放置約2-3小時晾干，或是將己經(jīng)包 被好的培養(yǎng)瓶放在4"保存?zhèn)溆茫?2)人類原代黑色素細(xì)胞的分離與培養(yǎng)1)取外科手術(shù)環(huán)切下的幼兒新鮮包皮，采用裂解酶消化法分離表皮和真皮；2)將分離的皮片從裂解酶中取出，用鑷子輕輕將表皮和真皮分離，將表皮收集 在含有雙抗的0. 01mol/L的PBS中；將表皮用此PBS液徹底清洗2-3次，用已經(jīng)滅菌 的眼科手術(shù)剪徹底將表皮組織剪碎，加入0.25呢胰酶/0.02《EDTA徹底消化真皮，并用 吸頭反復(fù)吹打3分鐘；加入血清中止消化，將所得的表皮細(xì)胞混懸液通過IOO目的濾 器過濾，去除未消化分離的組織細(xì)胞；將得到的細(xì)胞懸液離心，室溫下1200rpm/min， 5分鐘，得到的沉淀即為包含黑色素細(xì)胞，表皮干細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，以及少量的成纖維細(xì)胞的多種表皮細(xì)胞；用K-SFM培養(yǎng)液清洗一次細(xì)胞后，將其用已經(jīng)配置好的黑色素細(xì)胞培養(yǎng)液按照lX105cell/cm2—2X105cell/cm2重懸細(xì)胞，并將其接種到已 經(jīng)用IV型膠原包被好的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；隔天換一次培養(yǎng)液，大約10-14天，黑色素細(xì) 胞即可長滿培養(yǎng)瓶；(3)人類黑色素細(xì)胞的鑒定 采用下述2) -4)的3種方法中的一種或同時采用2-3種進行黑色素細(xì)胞鑒定1) 制備細(xì)胞爬片將培養(yǎng)的原代人類黑色素細(xì)胞按照4X10、ell/cr^密度接種于 放置蓋玻片的六孔板中，24小時后貼壁生長到70%時終止培養(yǎng)，制備爬片；2) L-DOPA染色鑒定將上步所得細(xì)胞爬片經(jīng)4'CPBS洗2次，5%甲醛固定30min， 加入0. 2%L-dopa， 37'C染色5小時，結(jié)束染色后用PBS洗3次，10%甲醛后固定20min， 甘油封片后在顯微鏡下觀察，黑色素細(xì)胞中含有大量被L-dopa染色的黑色素顆粒；3) 人類黑色素細(xì)胞特異性抗體MART-1免疫熒光染色將(3)中1)步所得細(xì)胞爬 片，4。CPBS洗2次，4。/。多聚甲醛固定30min， 4'C PBS洗3次，每次5分鐘，用正常 山羊血清封閉30min，加一抗(MART-1用PBS按照1: 100-1: 200倍稀釋)，4'C冰箱 保濕過夜;4°C PBS洗3次，每次5分鐘,加入二抗，室溫保濕避光孵育1小時;0. 1%DAPI 染液復(fù)染細(xì)胞核，室溫避光孵育10min， PBS洗3次，每次5分鐘，緩沖甘油封片， 在綠光激發(fā)下，相差熒光顯微鏡觀察可見黑色素細(xì)胞呈強烈紅色熒光；4) 電鏡照片按常規(guī)方法收集細(xì)胞，制備透射電鏡照片，觀察到細(xì)胞中大量黑色 素顆粒；所述的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基KSM為商業(yè)化購自國外公司，如美國BioWhittaker 公司的KBM或GIBCO公司的DK-SFM;所述的裂解酶消化法分離表皮和真皮是一種改良的方法，即用含100 U/mL青霉 素、100ug/mL鏈霉素的0. 01mol/L的PBS緩沖液徹底清洗皮膚2-3次；無菌條件下 去除皮下脂肪和結(jié)締組織；將包皮剪切成約2.0mmX3.0mm的皮片；將皮片展開，表皮向上浸泡于質(zhì)量濃度O. 25%的裂解酶中，37°(:消化3土0. 5小時或在4t:下消化12-18 小時；所述的IV型膠原主要成份為來源于人類胎盤的IV型膠原粉末。
全文摘要
一種利用原代培養(yǎng)的人皮膚黑色素細(xì)胞對美白化學(xué)物質(zhì)進行毒性和功效分析的實驗方法1.原代人皮膚黑色素細(xì)胞培養(yǎng)鑒定；2.利用原代人黑色素細(xì)胞對美白化學(xué)物質(zhì)進行毒性分析；3.利用原代人黑色素細(xì)胞對美白化學(xué)物質(zhì)的功效，即黑色素含量和酪氨酸酶活性兩方面進行分析。本方法具有以下優(yōu)點體外培養(yǎng)的人黑色素細(xì)胞分裂增殖能力強、標(biāo)準(zhǔn)化程度高、批間差異小，具有與體內(nèi)相同的產(chǎn)生黑色素顆粒的功能；利用健康人黑色素細(xì)胞比動物或人源的黑色素瘤細(xì)胞獲得的結(jié)果更可信；從定性和定量兩方面評價待測物質(zhì)的毒性作用和美白功效。本發(fā)明建立的方法可以代替活體動物和人類皮膚，直接用于化學(xué)品、化妝品、藥品等產(chǎn)品中美白物質(zhì)的毒性和功效試驗。
文檔編號C12Q1/18GK101532950SQ20081022066
公開日2009年9月16日 申請日期2008年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日
發(fā)明者程樹軍 申請人:程樹軍;廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心