專利名稱：：肝癌預(yù)后的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及癌癥手術(shù)預(yù)后，具體地說是肝癌預(yù)后，本發(fā)明還涉及用于肝癌預(yù)后的產(chǎn)品，包括基因芯片和檢測試劑盒。背景資料原發(fā)性肝癌根治術(shù)后5年的復(fù)發(fā)率約為60%~70%，其中術(shù)后1年的復(fù)發(fā)率所占比例高達(dá)51.4%~72.3%,即使是小肝癌獲根治性切除后的5年復(fù)發(fā)率也達(dá)30%~40%。因此，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為進(jìn)一步提高肝癌治療效果的主要障礙。術(shù)后灌注化療等治療方法有可能降低肝癌患者術(shù)后的復(fù)發(fā)率，但是一些長期研究顯示釆用這些術(shù)后化療后患者的生存率反而相對于未行化療的患者降低。這些現(xiàn)象提示術(shù)后具有較高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險的患者可能會受益于這些術(shù)后治療，但術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險較低的患者釆用這些術(shù)后治療可能會適得其反。如果能夠通過有效的預(yù)測方法預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險高的患者，就可以通過一系列的干預(yù)預(yù)防措施，降低復(fù)發(fā)率，延長患者的生存期。用臨床指標(biāo)(如TNM分級、肝硬化程度)和單個分子指標(biāo)(如AFP、MMPs)預(yù)測肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的研究已經(jīng)有較長的歷史。但是，由于肝癌的發(fā)生和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是一個包含多個基因變化的復(fù)雜過程，腫瘤的發(fā)生和其轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的能力由一系列重要的因素決定，包括癌基因抑癌基因的突變，免疫功能變化，血管生成，腫瘤細(xì)胞粘附、細(xì)胞外基質(zhì)降解等方面。單因素或單基因研究無法全面了解整個基因組多個基因的變化情況，不能反映肝癌轉(zhuǎn)移的確切分子生物學(xué)特征。并且臨床指標(biāo)或者病理類型相似的患者確有截然不同的臨床結(jié)局，所以用臨床指標(biāo)或著單獨的分子標(biāo)志來預(yù)測或評價患者難以取得滿意的效果。1999年Golub等率先利用基因芯片技術(shù)對急性白血病進(jìn)行研究，根據(jù)腫瘤的基因表達(dá)譜對白血病的進(jìn)行分型，并根據(jù)所建立的模型對新的患者進(jìn)行腫瘤類型預(yù)測，從而為利用基因芯片對腫瘤的分類和預(yù)測開創(chuàng)了先例。此后，Alizadeh、和van，tVeer等也利用類似的方法建立了用于彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤和乳腺癌分型預(yù)測的模型。這些研究結(jié)果說明基因芯片技術(shù)能夠從分子水平對腫瘤進(jìn)行更準(zhǔn)確的分類，并預(yù)測腫瘤亞型、預(yù)后和對治療的反應(yīng)等特性。更為重要的是，van，tVeer等基于70個基因的乳腺癌預(yù)后診斷模型和相關(guān)診斷用芯片MammaPrint被FDA批準(zhǔn)上巿，為我們展示了基于基因表達(dá)譜模型來進(jìn)行疾病分型和預(yù)后判斷的良好前景。因此，我們希望通過表達(dá)譜分析找到能夠預(yù)測肝癌患者根治術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的預(yù)測模型。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種預(yù)測原發(fā)性肝癌術(shù)后狀態(tài)的方法，該方法可用于評估原發(fā)性肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的可能性。本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于肝癌預(yù)后的產(chǎn)品。本發(fā)明方法包括對原發(fā)性肝癌初次手術(shù)切除腫瘤標(biāo)本中下述基因表達(dá)模式的分析HLA-DQB1(NM_002123)、HLA-DRA(J00194)、RHBDD2(RHBDD2)和CD3D(麗—000732)。作為優(yōu)選的方案，還進(jìn)一步包括對對原發(fā)性肝癌初次手術(shù)切除腫瘤標(biāo)本中選自下述基因表達(dá)模式的分析SAMD9(NM一017654)、LCN1(NM—002297)、0A1(麗—000273)和COS-22(Z27446)。對上述基因的表達(dá)分析，可通過測定患者肝癌組織基因產(chǎn)生的RNA量進(jìn)行，測定方法包括本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的熒光定量PCR(realtimequantitativePCR)和基因芯片。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。典型的PCR由(1)高溫變性模板；(2)引物與模板退火；(3)引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個循環(huán)，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。所謂實時定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。(參考文獻(xiàn)HeidCA,StevensJ,LivakKJ,etal.RealtimequantitativePCR[J].GenomeRes,1996,6(10):9862994.)基因芯片(microarray)又被稱為DNA芯片、DNA微陣列，是指以大量人工合成的或應(yīng)用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)獲得的核酸片段作為探針，按照特定的排列方式和特定的手段固定在硅片、載玻片或塑料片上，由于同時將大量探針固定于支持物上，所以可以一次性對樣品大量序列進(jìn)行檢觀!l和分析。(BertrandL，AsaphA，MarkS.OverviewofDNAchiptechnology[J].MolecularBreeding,1998,4:277)目前以合成寡核苷酸探針和原位合成探針制備的芯片較為常用。優(yōu)先地，可以選擇包含上述用來預(yù)測復(fù)發(fā)基因的定制芯片進(jìn)行分析，這種定制芯片不用包含與檢測目的無關(guān)的基因，但是含有目的基因和必要的用于質(zhì)控的基因?；蛐酒慕Y(jié)構(gòu)以及制造方法可以參閱CN2457166A、CN1341752A、CN1414112A、CN1616178A、US5445934、US5532128等等公開的方法。HLA-DQB1、HLA-DRA、RHBDD2、CD3D、SAMD9、LCN1、OA1和COS-22八個基因的表達(dá)值可以用來預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的可能性。這些基因是禾ll用BoandJonassen(GenomeBiology3(4):research0017.1-0017.11,2002)等開發(fā)的Greedy-pair方法篩選而出。其中HLA-DQBl、HLA-DRA、RHBDD2、CD3D和COS-22在根治術(shù)后三年內(nèi)不復(fù)發(fā)的患者中高表達(dá)，而SAMD9和LCN1在三年內(nèi)復(fù)發(fā)的患者高表達(dá)。利用這8個基因在21個患者中的表達(dá)水平作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集(表3),用PAM程序(PredictionAnalysisofMicroarrays)(參考文獻(xiàn)EricBairl,RobertTibshirani.PLoSBIOLOGY,April2004，Volume2，Issue4,0511)訓(xùn)練該數(shù)據(jù)集后，建立的模型可以100%地預(yù)測訓(xùn)練集中所有患者的預(yù)后。當(dāng)用這一模型來預(yù)測另外11獨立樣本的術(shù)后結(jié)局時，正確的預(yù)測了其中10個樣本。當(dāng)只用HLA-DQB1、HLA-DRA、RHBDD2和CD3D四個基因來建立預(yù)測模型的時候，可以得到同樣的預(yù)測效果。本發(fā)明方法可與用于癌癥診斷的其它方法聯(lián)合使用，對肝癌術(shù)后預(yù)后。例如TNM分期，CLIP評分系統(tǒng)和血清中游離AFPmRNA等指標(biāo)。本發(fā)明進(jìn)一步提供基于上述肝癌預(yù)后方法的產(chǎn)品，例如基因芯片，所述基因芯片包括可與來自上述基因的mRNA、cRNA和/或cDNA特異雜交的探針，這些探針可以是上述基因的核酸序列、其互補(bǔ)序列、或者是它們的片段；或者是檢測試劑盒，其包括對上述基因產(chǎn)生的RNA或表達(dá)產(chǎn)物測定的全部或部分試劑，典型地，測定RNA的試劑包括(熒光定量PCR檢測試劑盒，原位雜交及原位RT-PCR,Nouthem檢測試劑盒)等，測定蛋白表達(dá)產(chǎn)物的試劑包括(ELISA試劑盒、抗體芯片)等。綜上所述，本發(fā)明提供了肝癌預(yù)后的解決方案，并提供了可用于肝癌預(yù)后的產(chǎn)品。實驗表明，本發(fā)明方法對肝癌術(shù)后三年內(nèi)是否復(fù)發(fā)預(yù)測的準(zhǔn)確率達(dá)90%以上。圖l是篩選用于肝癌術(shù)后預(yù)測基因的方法；圖2是預(yù)測模型的預(yù)測表現(xiàn)A:預(yù)測模型中包含不同基因數(shù)目的時候預(yù)測模型的預(yù)測表現(xiàn)，可以看到，當(dāng)模型中包含4個或者8個基因的時候，該模型預(yù)測的表現(xiàn)最好。B:模型中包含8個基因時，訓(xùn)練組樣本的交叉驗證表現(xiàn)。C:模型中包含8個基因時，驗證組樣本的預(yù)測表現(xiàn)。圖3是聚類分析結(jié)果；圖4差異基因和差異通路的重疊分析。具體實施例方式以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1通過對32例具有根治術(shù)后不同無瘤生存時間原發(fā)性肝癌患者原發(fā)腫瘤組織的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析比較，成功地構(gòu)建了一個基于PAM禾呈序(PredictionAnalysisofMicroarrays)(參考文獻(xiàn)EricBairl,RobertTibshirani.PLoSBIOLOGY,April2004，Volume2，Issue4,0511)的預(yù)測模型。該模型包含了8個基因(見表l)的表達(dá)模式，能夠準(zhǔn)確地根據(jù)原發(fā)性肝癌患者原發(fā)瘤中這8個基因的表達(dá)水平判斷該患者術(shù)后是否會在3年內(nèi)復(fù)發(fā)，準(zhǔn)確度達(dá)90%以上。將32例肝癌患者隨機(jī)分成兩組一組包含21個患者，用來訓(xùn)練預(yù)測模型，稱之為"訓(xùn)練組"；另一組包含ll例患者，用來檢驗預(yù)測模型的準(zhǔn)確度，稱之為"檢測組"。本發(fā)明所構(gòu)建的預(yù)測模型成功的判斷了訓(xùn)練組中全部21個患者是否在三年內(nèi)復(fù)發(fā)，更為重要的是該模型成功地預(yù)測了11個訓(xùn)練組患者中10個患者是否復(fù)發(fā)的結(jié)局(圖2)。表1:預(yù)測模型中的基因GenBank登陸號基因標(biāo)簽功能簡介預(yù)測模型雨—002123HLA響DQB1抗原遞呈4基因模型■94HLA-DRA抗原遞呈4基因模型NM—020684RHBDD2在6年內(nèi)復(fù)發(fā)的乳腺癌患者中高表達(dá)4基因模型NM—000732CD3D免疫相關(guān)4基因模型NM—017654SAMD9調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，抑制腫瘤形成4/8基因模型畫—002297LCN1抑制半胱氨酸蛋白酶4/8基因模型麗—000273OA1未知4/8基因模型Z27446COS-22免疫球蛋白組分4/8基因模型實驗方案7一、樣品和芯片分析1.按照規(guī)范流程收集HCC患者的組織和血清標(biāo)本，并規(guī)范地隨訪和管理患者的相關(guān)背景資料，通過數(shù)年的隨訪我們選出了在術(shù)后一年內(nèi)復(fù)發(fā)的患者11例(命名為S組)，術(shù)后l-3年內(nèi)復(fù)發(fā)的患者8例(命名為M組)，術(shù)后3年內(nèi)不復(fù)發(fā)的患者13例(命名為L組)。2.用Trizol(Invitrogen，GaMiersburg,MD，USA)—步法提取肝癌組織總RNA，并進(jìn)一步釆用NucleoSpinRNAclean-up試劑盒(MACHEREY-NAGEL,Germany)對總RNA進(jìn)行過柱純化，最后用分光光度計定量，甲醛變性膠電泳質(zhì)檢。同時，提取10例HCC患者的癌旁組織總RNA，并混合作為芯片分析時的共同對照。3.用22k人類全基因組寡核苷酸芯片分析具有不同術(shù)后無瘤生存時間HCC患者的肝癌組織表達(dá)譜。本發(fā)明釆用CapitalBio公司的人類全基因組寡核苷酸芯片進(jìn)行分析,該芯片共含有21571條70mer長度的01igoDNA,每條01igoDNA代表了人的一個基因其中21329條OligoDNA是來自于Qiagen公司的HumanGenomeOligoSetVersion2.1;242條OligoDNA為博奧公司合成。同時，該芯片上還包括人的12個看家基因作為陽性對照，12條人工合成的與人基因沒有同源性的70merOligoDNA作為陰性對照，酵母的8個基因間序列作為外標(biāo)，Hex作為點樣陽性對照。該芯片為雙通道芯片，每張芯片同時與一個來自實驗樣品的標(biāo)記RNA以及作為對照的癌旁組織混合標(biāo)本的標(biāo)記RNA進(jìn)行雜交。4.樣品RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記a.雙鏈cDNA合成取5g總RNA，以T7-01igo(，dT)15，(5'-AAACGACGGCCAV-3，V可以是G、C和A,上海博亞生物技術(shù)有限公司)為引物，用8cDNASynthesisKit(Promega，USA)合成雙鏈cDNA;雙鏈合成后用PCRNucleoSpinExtractIIKit(MN)純化。b.體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA用T7RiboMAXExpressLargeScaleRNAProductionSystem(Promega)將雙鏈cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA;然后用RNAClean-upKit(MN)純化。c.隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄取2gcRNA,用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，200u/pl(Invitrogen)，9RandomPrimer進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用PCRNucleoSpinExtractIIKit(MN)純化。d.cDNA用KLENOW酶標(biāo)記取2gcRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以9RandomPrimer為引物進(jìn)行KLENOW酶(Takara，Japan)標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物用PCRNucleoSpinExtractIIKit(MN)純化，純化后抽干。標(biāo)記過程中dATP,dGTP,dTTP終濃度為120M,dCTP終濃度為60M，Cy5-dCTP,Cy3-dCTP終濃度為40M。Cy5國dCTP、Cy3-dCTP(AmershamPharmaciaBiotech,Inc.,Piscataway,NJ，USA);dNTP，10mMeach(上海英駿生物技術(shù)有限公司)；RandomPrimer,9mer(上海英駿生物技術(shù)有限公司)；5.標(biāo)記的DNA溶于301雜交液中(3xSSC,0.2%SDS，5xDenhart，s，25%甲酰胺)，于42。C雜交過夜。雜交結(jié)東后，先在42。C左右含0.2%SDS，2xSSC的液體中洗5min,而后在0.2xSSC中室溫洗5min。玻片甩干后即可用于掃描。6.芯片用LuxScan10KA雙通道激光掃描儀(Capita舊io公司)進(jìn)行掃描，分別掃描Cy5和Cy3的單色熒光圖進(jìn)行疊加，然后釆用GenePixPro4.0圖像分析軟件(AxonInstruments公司)對芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號；再對芯片上的數(shù)據(jù)用Lowess方法進(jìn)行歸一化。二、具有不同術(shù)后無瘤生存時間肝癌患者的表達(dá)譜比較1.實驗組患者間的臨床指標(biāo)分析為了比較三個實驗組的患者在臨床指標(biāo)上有無差異，我們釆用SPSS11.0對三組患者的性別、年齡、HBV感染等12個指標(biāo)進(jìn)行了方差分析。2.非監(jiān)督聚類分析所有的芯片分析原始數(shù)據(jù)用R軟件包進(jìn)行Lowess歸一化后，選取至少在9各樣本中有可監(jiān)測表達(dá)水平的基因進(jìn)行后續(xù)分析。用CLUSTER3.0進(jìn)行非監(jiān)督聚類分析，用TREEVIEW軟件顯示聚類分析的結(jié)果。3.各實驗組患者間的差異基因分析用斯坦福大學(xué)開發(fā)的SAM3.0軟件進(jìn)行微陣列顯著性分析，選取在各實驗組有差異表達(dá)的基因。選取的標(biāo)準(zhǔn)為該基因在兩個比較組之間的表達(dá)的倍數(shù)差異大于1.5,SAM分析的Q值小于0.2(即假陽性發(fā)現(xiàn)率小于20%)。4.各實驗組間的差異生物學(xué)通路分析用BioRag.(www.biorag.org)網(wǎng)站中的PathwayMiner將用上述方法選出的差異基因定位到KEGG數(shù)據(jù)庫中的各個生物學(xué)通路中，并對這些含有差異基因的生物學(xué)通路進(jìn)行顯著性檢驗，將pO.Ol的通路定義為差異生物學(xué)通路。5.差異表達(dá)基因的生物學(xué)驗證'.為了驗證芯片分析的結(jié)果，我們釆用了qRT-PCR，WesternBlot和免疫組化驗證部分差異基因。三、復(fù)發(fā)預(yù)測模型的建立1.患者分組為了建立和評估分類預(yù)測模型，用一個隨機(jī)數(shù)發(fā)生器從所有參與表達(dá)譜分析的32個患者中隨機(jī)選取21個患者作為選取基因和建立預(yù)測模型的"訓(xùn)練組樣本"，剩佘的11個患者用作評估預(yù)測模型的獨立"檢測組樣本"。2.用于預(yù)測的基因選取利用BoandJonassen(GenomeBiology3(4):research0017.1-0017.11，2002)等開發(fā)的Greedy-pair方法選取基因用于構(gòu)建復(fù)發(fā)預(yù)測模型，使用BRB-armyTool中整合的程序進(jìn)行分析。大概的方法如下整個基因選取過程在21個訓(xùn)練組樣本中進(jìn)行，沒有檢測組樣本參與。首先，對所有基因在訓(xùn)練組樣本中的S、M組和L組間的表達(dá)差異進(jìn)行獨立樣本t檢驗，根據(jù)各個基因的t值將所有基因按照差異的顯著性進(jìn)行排序。接下來的程序?qū)⒁獮樯鲜雠判蛑胁町愖铒@著的基因Gi找一個配對的Gj，使得這一對基因能夠獲得最佳的分類判別效果。為此，用Gi與剩佘所有基因組成兩個基因的線性分類預(yù)測模型，找出預(yù)測效果最好的模型，該模型中與Gi配對的基因即為Gj,選出的Gi和Gj即為Greedy-pair法挑出的第一對基因。之后，剔除挑出的兩個基因，用剩余的基因重復(fù)上一過程n次，即可挑選出預(yù)測能力較強(qiáng)的n對基因。結(jié)果，一共選取了50對基因用于預(yù)測模型構(gòu)建。3.預(yù)測模型構(gòu)建用上一環(huán)節(jié)選出的n對基因基于PAM構(gòu)建復(fù)發(fā)預(yù)測模型。首先用選出的第一對基因基于PAM構(gòu)建預(yù)測模型，用21個訓(xùn)練組樣本訓(xùn)練預(yù)測模型；用CrossValidation驗證該模型對訓(xùn)練組樣本的預(yù)測效果，同時用該模型預(yù)測ll個檢測樣本的復(fù)發(fā)結(jié)局；最后用訓(xùn)練組樣本CrossValidation的準(zhǔn)確度和該模型在11個檢測樣本中的預(yù)測表現(xiàn)來評價該預(yù)測模型。之后，按順序每次向該模型中加入一對用Greedy-pair選出的基因并重復(fù)上述過程，直至模型中包含全部50對基因為止。按照上述步驟總共建立50個預(yù)測模型，根據(jù)50個預(yù)測模型的預(yù)測表現(xiàn)選取預(yù)測最好的預(yù)測模型，即為我們所構(gòu)建的用于預(yù)測原發(fā)性肝癌患者根治術(shù)后3年內(nèi)實驗結(jié)果1.實驗患者臨床指標(biāo)分析和非監(jiān)督聚類結(jié)果各實驗組之間的臨床指標(biāo)除TNM外沒有明顯的差異(見表2),表明原發(fā)性肝癌患者即便有類似的臨床特征卻可以出現(xiàn)截然不同的臨床結(jié)局。在聚類分析中總共有12660個基因進(jìn)入了后期分析，利用這些基因?qū)λ械膶嶒灅颖具M(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)大部分具有類似術(shù)后無瘤生存時間的患者被聚到一起(圖3),說明具有類似術(shù)后無瘤生存時間肝癌患者的基因表達(dá)譜類似，而術(shù)后無瘤生存時間不同的患者間原發(fā)腫瘤的基因表達(dá)譜確明顯不同。這一結(jié)果提示，利用手術(shù)切除的原發(fā)腫瘤標(biāo)本來預(yù)測該患者術(shù)后的復(fù)發(fā)是可行的。表2:實驗患者的lls床指標(biāo)分析臨床指標(biāo)Sm戶性別(男/女)9/28/010/30.314年齡(年)47.4±14.561.0±6.648.1±11.90.064HBV(+a)9/15/27/10.592AFP(<20ng/mL，or>20ng/mL)5/54/34/40.965ALT(<40U/L，or>40U/L)9/13/45/30.121AST(<40U/L，or>40U/L)8/24/32/60.066總膽紅素(um/L)11.6±3.113.1±4.818.8土23.70.54腫瘤直徑(cm)5.3±2.86.7±3.78.1±3.20.193tnm分期(i+u/m+iv)3/88/07/6氺+0.004肝硬化(無/有)2/80/63/50.255原發(fā)灶(單個/多個)9/14/14/40.163飲酒(否/是)6/42/34/40.7822.差異基因和差異通路研究發(fā)現(xiàn)有381個基因在S和M組差異表達(dá)，368個基因在M和L組差異表達(dá)，63個基因在S和L組差異表達(dá)，分別對應(yīng)7，19和5個差異通路。比較這些差異基因和通路發(fā)現(xiàn)S組和M組和L組相比的差異基因有34個相同，差異通路有5個相同；而M組和L組和S組相比的差異基因只有2個相同，沒有相同的差異通路(圖4)。這一實驗結(jié)果提示1年內(nèi)復(fù)發(fā)的肝癌患者及1-3年內(nèi)復(fù)發(fā)的肝癌患者與3年內(nèi)不復(fù)發(fā)的肝癌患者相比具有相似的差異表達(dá)模式，可能是類似的機(jī)制導(dǎo)致了肝癌患者在l年內(nèi)及l(fā)-3年內(nèi)的復(fù)發(fā)。因此，需要進(jìn)一步研究3年內(nèi)復(fù)發(fā)與3年內(nèi)不復(fù)發(fā)患者的差異表達(dá)模式，以探討導(dǎo)致部分肝癌患者早期復(fù)發(fā)而部分患者能夠長期無瘤生存的機(jī)制。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)有271個基因在3年內(nèi)復(fù)發(fā)的患者(S、M組)和3年內(nèi)不復(fù)發(fā)的患者(L組)間差異表達(dá)，其中269個在S、M組高表達(dá)；有21個通路在兩組患者間差異表達(dá)，其中包含了15個在M和L組差異表達(dá)的通路以及在S和L組差異表達(dá)的全部5個通路(圖3)。這一結(jié)果也支持類似的機(jī)制導(dǎo)致了肝癌患者在1年內(nèi)及1-3年內(nèi)的復(fù)發(fā)。3.差異基因的生物學(xué)驗證用qRT-PCR驗證了HLA-DP，DQ，DR和CIITA四個基因，用westernblot驗證了CIITA的表達(dá)和用免疫組化驗證了HLA-DP,DQ，DR在一組獨立肝癌患者肝癌組織中的表達(dá)。這些試驗結(jié)果均與芯片分析結(jié)果一致，證明基因芯片分析結(jié)果的可靠性。4.復(fù)發(fā)預(yù)測模型發(fā)明人構(gòu)建了50個基于不同基因的預(yù)測模型，當(dāng)該模型包含4或8個基因的時候預(yù)測準(zhǔn)確度最高(圖2)。此時，該模型可以100%的判斷出21個訓(xùn)練樣本的分組；并正確地預(yù)測了11個檢測樣本中IO例患者是否在根治術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)。該模型中的8個基因見表1，其中包含了4個免疫相關(guān)基因HLA-DQB1和HLA-DRA是抗原遞呈途徑中的關(guān)鍵分子，CD3D是重要的免疫分子CD3的重要組分，COS-22是免疫球蛋白的組分，提示免疫因素是影響原發(fā)性肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的重要因素。實施例2從Qiagen公司購買針對人HLA-DQBl、HLA-DRA、RHBDD2、CD3D、SAMD9、LCN1、0A1和COS-22基因序列的特異70-mer寡核苷酸探針。將上述設(shè)計的探針交付博奧公司，點制僅含檢測上述8種基因的mRNA序列的基因芯片。參照文獻(xiàn)(荷蘭Agendia公司的MammaPrint。參考文獻(xiàn)AnnuskaMGlas，AmoFloore,LeonieJMJDelahayeetal.Convertingabreastcancermicroarraysignatureintoahigh-throughputdiagnostictest.BMCGenomics2006,7:278)公開的方法，對實施例1中所述的ll個檢測樣本進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果用實施l建立的模型進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖2c所示，圖中以準(zhǔn)確度表示預(yù)測結(jié)果的可信度，本例以0.5為界表示預(yù)測結(jié)果。結(jié)果表明，使用該芯片準(zhǔn)確預(yù)測11個檢測樣本中10例患者是否在根治術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)。具體預(yù)測方法如下利用表3中HLA-DQB1、HLA-DRA、RHBDD2、CD3D、SAMD9、LCN1、OA1和COS-22等八個基因在21例肝癌患者中的數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集(trainingset)。其中包含9個3年內(nèi)不復(fù)發(fā)的HCC患者和12個3年內(nèi)復(fù)發(fā)的HCC患者的初次手術(shù)標(biāo)本中HLA-DQB1、HLA-DRA等8個基因相對于癌旁混合標(biāo)本的相對表達(dá)值以2為底取log后的數(shù)值。同時，將有待預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的HCC患者初次手術(shù)標(biāo)本中，HLA-DQB1、HLA-DRA等8個基因相對于癌旁混合標(biāo)本的相對表達(dá)值以2為底取log后的數(shù)值，作為預(yù)測數(shù)據(jù)集(testset)(表4)。使用PAM程序(PredictionAnalysisofMicroarrays)(參考文獻(xiàn)EricBairl，RobertTibshirani.PLoSBIOLOGY,April2004，Volume2,Issue4,0511。程序和說明書下載網(wǎng)址http:〃www-stat.stanford.edu/~tibs/PAM/)按照程序說明進(jìn)行模型訓(xùn)練和預(yù)測。首先，使用K-Nearest-Neighbor方法，設(shè)定10個Neighbor數(shù)，對該訓(xùn)練數(shù)據(jù)集進(jìn)行訓(xùn)練，訓(xùn)練后設(shè)置閾值(Threshold)為0,再預(yù)測testset數(shù)據(jù)集中的HCC患者的術(shù)后的復(fù)發(fā)結(jié)局，輸出預(yù)測結(jié)果(是否復(fù)發(fā))和預(yù)測可能性分布圖(PlotTestProbabilities)。表3:預(yù)測模型訓(xùn)練數(shù)據(jù)集<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>權(quán)利要求1、一種基因芯片，其具有針對下述基因產(chǎn)生的RNA進(jìn)行檢測的探針HLA-DQB1、HLA-DRA、RHBDD2和CD3D。2、如權(quán)利要求l所述的基因芯片，其還具有針對選自下述基因產(chǎn)生的RNA進(jìn)行檢測的探針WMD9、LCiW、04/和COS-"。3、如權(quán)利要求l所述的基因芯片，其具有針對下述基因產(chǎn)生的RNA進(jìn)行檢測的探針//Z^-Z)gi^、//U-Di^、W/7^aD2、CZ)1D、4、如權(quán)利要求13任一項所述的基因芯片，其特征在于，所述探針來自下述相應(yīng)基因的核酸序列、其互補(bǔ)序列，或者它們的片段:肌」-Z)，、肌^-D脫i/ffiDZ)2、CA5"、&4MD9、丄C7W、04/或COS-22。5、一種試劑盒，其包括針對下述基因產(chǎn)生的RNA或表達(dá)產(chǎn)物測定的試劑ittyM)^57、//ZJ-D/^、W//^DZ)2和CD3D。6、如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其還包括針對下述基因產(chǎn)生的RNA或表達(dá)產(chǎn)物測定的試劑&4MZ)9、丄C7W、047和COS-22。7、如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其包括針對下述基因產(chǎn)生的RNA或表達(dá)產(chǎn)物測定的試劑//丄J-Z)g^、/tt^-DiM、i/^Z)D2、CZ)3"、5^MD9、丄CiW、a4/和cas-22。8、如權(quán)利要求57任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述的盒為a)檢測RNA的試劑盒熒光定量PCR檢測試劑盒，原位雜交及原位RT-PCR，Nouthern檢測試劑盒；或b)檢測表達(dá)產(chǎn)物的試劑盒ELISA試劑盒或抗體芯片試劑盒。全文摘要本發(fā)明提供了一種肝癌術(shù)后預(yù)后的方法，包括對HLA-DQB1、HLA-DRA、RHBDD2、CD3D、SAMD9、LCN1、OA1和COS-22基因的差異表達(dá)分析。本發(fā)明還提供了用于肝癌預(yù)后的基因芯片和試劑盒。本發(fā)明基因芯片包括上述基因的核酸序列、互補(bǔ)序列或者它們的片段；本發(fā)明試劑盒包括對上述基因產(chǎn)生的RNA或表達(dá)產(chǎn)物測定的全部或部分試劑。實驗表明，本發(fā)明提供的基因芯片或試劑盒對肝癌術(shù)后三年內(nèi)是否復(fù)發(fā)預(yù)測的準(zhǔn)確率達(dá)90％以上。文檔編號C12Q1/68GK101457254SQ200810223720公開日2009年6月17日申請日期2008年10月9日優(yōu)先權(quán)日2008年10月9日發(fā)明者張恒輝,謝興旺,陳紅松申請人:北京大學(xué)人民醫(yī)院