專(zhuān)利名稱(chēng)：一株青霉菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株青霉菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
當(dāng)前世界正陷于能源危機(jī)，要改變現(xiàn)狀，需要尋找新的替代型能源，燃料乙醇 作為一種清潔可再生能源已在許多國(guó)家使用。
淀粉是植物重要的能量?jī)?chǔ)存形式(Steven Ball, Han-Ping Guan, Martha James. From glycogen to amylopectin: a model for the biogenesis of the plant starch granule[J]. Cell, 1996， 86:349-352.)，對(duì)于多種生物體具有重大的意義。淀粉 可以供給生物生命所需的能量，淀粉的降解產(chǎn)物可以制成各種各樣的產(chǎn)品，應(yīng)用于 人類(lèi)社會(huì)的各個(gè)方面。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，做好淀粉的綜合利用工作，對(duì)國(guó)計(jì)民生和 社會(huì)安定等多方面具有極大的促進(jìn)作用。淀粉是葡萄糖的聚合物，直鏈淀粉 (amylose)是以ct-1， 4糖苷鍵連接而成的沒(méi)有分枝的線形分子，支鏈淀粉 (amyl叩ectin)在線形分子上存在少數(shù)以a -1， 6糖苷鍵連接的支鏈(N. K. Matheson， R.A.Caldwell. Modeling of a (1-4) chain arrangements in a (1-4) (1-6) glucans: The action and outcome of P—amylase and尸5"ewo^/z cv as 5^wtzeri amylase on ana (1—4) (1—6) glucan model [J]. Carbohydrate Polymers, 2008， 72:625—637.)。 淀粉酶不是單一的某一種酶，而是能夠降解淀粉的酶的統(tǒng)稱(chēng)，依據(jù)淀粉酶的作 用方式可以將其分為外切型和內(nèi)切型兩大類(lèi)。內(nèi)切型淀粉酶能切開(kāi)淀粉分子內(nèi)部的 a-l， 4和ct-l， 6糖苷鍵，包括a-淀粉酶、普魯蘭酶和麥芽六糖酶等。外切型淀 粉酶包括P -淀粉酶、a -葡萄糖苷酶和葡萄糖淀粉酶等(N. S. Reddy， Annapoorna Ni咖agadda， K. R. S. Sambasiva Rao. An overview of the microbial a -amylase family [J]. African Journal of Biotechnology, 2003，2(12):645-648; Marc J E C， Van der Maarel， Bart v肌der Veen. Properties and applications of starch-converting enzymes of the a-amylase family[J]. Journal of Biotechnology, 2002， 94:137-155.)。 a -淀粉酶(a-1， 4-D-Glucanohydrolase; EC3. 2. 1. l)從 淀粉分子內(nèi)部水解a-l， 4糖苷鍵，不能水解a-1， 6糖苷鍵，水解a-1， 4糖苷 鍵的先后次序是無(wú)規(guī)律的。a -淀粉酶水解淀粉的終產(chǎn)物隨酶的性質(zhì)不同而不同
水解直鏈淀粉的最終產(chǎn)物一般含有麥芽低聚糖、麥芽糖和葡萄糖中的一種或幾種； 水解支鏈淀粉的最終產(chǎn)物除a-極限糊精外，還可能含有麥芽低聚糖、麥芽糖和葡 萄糖中的一種或幾種。普魯蘭酶(Amylopullulanase; EC: 3.2.1.41)水解淀粉內(nèi) 部a-1， 6糖苷鍵，起脫支鏈作用。麥芽六糖酶(Maltotetraose-forming alpha-amylase; EC: 3. 2. 1. 98)每次催化釋放6個(gè)葡萄糖單位。3-淀粉酶(P -amylase; EC: 3. 2. 1. 2)從淀粉分子的非還原性末端開(kāi)始，水解相間隔的a-1， 4 糖苷鍵，每次作用釋放出一個(gè)麥芽糖分子；不能水解a-l， 6糖苷鍵，遇此鍵即停 止水解作用。P-淀粉酶水解直鏈淀粉時(shí)產(chǎn)物全部為麥芽糖，水解支鏈淀粉時(shí)產(chǎn)物 為麥芽糖和P-極限糊精。a-葡萄糖苷酶(a-glucosidase; EC 3. 2. 1. 20)作用 于淀粉分子的非還原性末端，每次作用釋放出一個(gè)異頭碳為a -構(gòu)型的葡萄糖分子。 葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase; EC: 3. 2. 1. 3)俗稱(chēng)糖化酶，作用于淀粉分子的非還 原性末端，每次作用釋放出一個(gè)異頭碳為e-構(gòu)型的葡萄糖分子，不僅能水解a-l， 4糖苷鍵，還能微弱水解a-l， 6糖苷鍵，因此葡萄糖淀粉酶能把直鏈淀粉和支鏈 淀粉全部水解為葡萄糖。
以淀粉為原料生產(chǎn)燃料乙醇一般分為如下幾步去除雜質(zhì)、原料粉碎、原料降 解和醪液調(diào)節(jié)、發(fā)酵、蒸餾和后加工(章克昌，吳佩琮.酒精工藝手冊(cè)[M].北京 中國(guó)輕工業(yè)出版社，2000.)。在傳統(tǒng)工藝中，由于原料降解和微生物發(fā)酵產(chǎn)酒精兩 步工序所需的環(huán)境條件不同，為了能高效生產(chǎn)，這兩步工序是分開(kāi)進(jìn)行的，這就是 所謂的"兩步法"(Lee R Lynd, Paul J Weimer, Willem H van Zyl. Microbial cellulose utilization fundamentals and biotechnology[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2002, 66(3) :506 - 577.)。有的學(xué)者提出改進(jìn)的工藝，
是將原料降解和微生物發(fā)酵產(chǎn)酒精這兩步工序合并成一步的"一步法"，即"同步 糖化發(fā)酵，，(Per Sassner， Guido Zacchi. Integration options for high energy efficiency and i.mproved economics in a wood-to-ethanol process [J]. Biotechnology for Biofuels， 2008， 1 (4) : 1-11.)。相對(duì)于"兩步法"工藝，"同步 糖化發(fā)酵"工藝主要有四個(gè)優(yōu)點(diǎn)①可發(fā)酵性糖(原料降解的產(chǎn)物) 一產(chǎn)生就被發(fā) 酵微生物利用，其濃度可以一直維持在較低水平，消除了產(chǎn)物的反饋抑制，使得原 料的降解能更高效地進(jìn)行；②可發(fā)酵性糖一旦產(chǎn)生就被發(fā)酵微生物利用，使得雜菌 沒(méi)有可利用的碳源，可以一定程度抑制雜菌生長(zhǎng)；③在較低溫度下進(jìn)行原料的降解， 節(jié)省了傳統(tǒng)維持降解所用溫度所需的費(fèi)用，節(jié)省了生產(chǎn)成本；④縮減了單獨(dú)原料降
解的工序，提高了設(shè)備利用率(Sudip Roy， Ravindra D Gudi， K V Venkatesh， et al. Optimal control strategies for simultaneous saccharification and fermentation of starch[J]. Process Biochemistry, 2001， 36:713 - 722; Karin 0 hgren， Renata Bura， Gary Lesnicki. A comparison between simultaneous saccharif ication and fermentation and separate hydrolysis and fermentation using steam- pretreated corn stover[J]. Process
Biochemistry, 2007， 42:834-839.)。雖然淀粉"同步糖化發(fā)酵"生產(chǎn)酒精工藝具有 良好的應(yīng)用前景，但由于酵母菌發(fā)酵產(chǎn)酒精需要酸性低溫條件，目前仍缺乏可以在 酸性低溫條件高效發(fā)揮作用的淀粉酶。商業(yè)用的糖化酶來(lái)自于黑曲霉，最適作用溫 度是6(TC，在酵母菌發(fā)酵溫度(約3(TC)時(shí)，糖化酶只有在6(TC活力的三分之一， 盡管也能將該糖化酶用于淀粉同步糖化發(fā)酵工藝生產(chǎn)酒精，但糖化酶效率低下，這 是淀粉"同步糖化發(fā)酵"生產(chǎn)酒精高成本的原因之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株青霉菌株及其應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的青霉(尸e/^'cj77i鵬)菌株，名稱(chēng)為1-95，已于2008年08 月29日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址 為北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路)，保藏號(hào)為CGMCC No. 2645。
本發(fā)明還提供了利用該菌株生產(chǎn)淀粉酶的方法。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)淀粉酶的方法，是發(fā)酵青霉(尸e/n'^7h'咖印.)1-95 CGMCC No. 2645，得到淀粉酶。
發(fā)酵青霉l-95可采用如下培養(yǎng)基:每升培養(yǎng)基中含有8-12g可溶性淀粉、2-3g (NH4)2S04、 2-4gKH2P04、 4-6g胰蛋白胨、0. 1-0. 3gMgS(V 7H20、 0. 10-0. 15g CaCl2、 0. 020-0. 030g FeS04* 7H20; pH5-6。優(yōu)選采用如下培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含有10g 可溶性淀粉、2.5g (NH》2S04、3gKH2P04、5g胰蛋白胨、0.2gMgS(V 7H20、 0. 13gCaCl2、 0. 0255g FeS(V 7H20; pH5. 5。
發(fā)酵青霉可采用真菌的常用培養(yǎng)溫度，優(yōu)選28。C。在2『C，發(fā)酵的第九天， 淀粉酶產(chǎn)量達(dá)到最高。
以上方法制備得到的淀粉酶也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該淀粉酶在pH3. 5-6. 5 均有活性，優(yōu)選pH4.5-5.5，最適pH值為5.0;該淀粉酶在15-7(TC溫度下均有活 性，優(yōu)選35-5(TC，最適溫度為45"C。
本發(fā)明所提供的青霉(尸e/LZ'w7h'鵬)1-95 CGMCC No. 2645和淀粉酶均可應(yīng)用 于酒精生產(chǎn)中。
本發(fā)明所提供的青霉(尸e/w'd7h'Mz ) 1-95 CGMCC No. 2645可通過(guò)發(fā)酵得 到淀粉酶，該淀粉酶的最適pH值為5.0，最適溫度為45"C。與現(xiàn)有的淀粉酶比較， 本發(fā)明的淀粉酶的最適作用條件更接近酵母菌的發(fā)酵條件。所以將本發(fā)明所提供的 青霉(尸e/w'cj7W朋7 sp. ) 1-95 CGMCC No. 2645或發(fā)酵該菌得到的淀粉酶應(yīng)用于同 步糖化發(fā)酵產(chǎn)酒精工藝中，有望解決糖化酶效率低下造成的淀粉"同步糖化發(fā)酵" 生產(chǎn)酒精高成本的問(wèn)題。
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。


圖1為菌株1-95在分離平板上的形態(tài)。
圖2為菌株1-95在分離平板上的淀粉降解圈。
圖3為菌株1-95在PDA平板上的形態(tài)。
圖4為菌株1-95在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)。
圖5為青霉1-95淀粉酶在不同pH條件下的活力曲線。
圖6為青霉1-95淀粉酶在不同溫度條件下的活力曲線。
圖7為青霉1-95淀粉酶的溫度耐受性分析。
圖8為青霉1-95淀粉酶水解淀粉的產(chǎn)物分析。
圖9為青霉1-95淀粉酶在發(fā)酵產(chǎn)酒精過(guò)程中的酒精含量和殘?zhí)呛俊?
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。以下實(shí)施例中所用 的DNA聚合酶等生化試劑購(gòu)自SIGMA，各種藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。 實(shí)施例l、青霉(尸e/w'cW"'MZ7印.)1-95 CGMCC No. 2645的獲得 一、菌株的獲得
1、 土壤樣品的采集
撥開(kāi)上層土，釆集約5cm處的松軟泥土。 土壤樣品采集地廣西壯族自治區(qū)梧 州市農(nóng)村。
2、 菌株的分離和初步篩選
用去離子水配制固體瓊脂培養(yǎng)基(諸葛斌，諸葛健.生淀粉糖化酶高產(chǎn)菌的選育 [J].微生物學(xué)通報(bào)，2001,28 (6) : 60-64.)，每升培養(yǎng)基中含有10g可溶性淀粉、3gNaN03、 lgKH2P04、 0. 5g KC1、 0. 5g MgS(V 7H20、 0. Olg FeS(V 7H20、 25g瓊脂; pH5. 5。將配制好的培養(yǎng)基在15磅/英寸2的壓力下濕熱滅菌20分鐘。
采用透明圈法(謝廣發(fā)，夏祖宏.篩選糖化菌的方法-透明圈法[J].中國(guó)釀 造.1998(1) :30)進(jìn)行分離和初步篩選，具體步驟如下
稱(chēng)取0. 5g 土壤樣品置于250mL小錐形瓶中，加入49. 5mL滅菌水，180rpm震蕩 60min，取懸濁液稀釋為10—3、 10—4、 10—5、 10—6、 10—7、 10一8和10—9共7個(gè)梯度，各稀 釋梯度取5(HtL涂分離平板，28t:恒溫培養(yǎng)4天后，觀察各平板菌落生長(zhǎng)情況，選 擇生長(zhǎng)真菌單菌落數(shù)量為15-20個(gè)的稀釋度涂大量平板，28。C培養(yǎng)5天后用碘液染 色，挑取有明顯淀粉降解圈的真菌菌落稀釋涂平板至純種，并保存純種。
3、淀粉降解菌的復(fù)篩
用去離子水配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基(張麗蘋(píng)，徐巖.酸性a -淀粉酶生產(chǎn)菌株的選 育的初步研究[J].工業(yè)微生物,2002， 32(4) :11- 14.)，每升培養(yǎng)基中含有10g 可溶性淀粉、2.5g (NH4)2S04、3gKH2P04、5g胰蛋白胨、0.2gMgS(V 7H20、 0. 13gCaCl2、 0.0255g FeS(V 7H20; pH5. 5。將配制好的培養(yǎng)基15磅/英寸2的壓力下濕熱滅菌 20分鐘。
具體的復(fù)篩步驟如下
將初篩獲得的真菌菌種平板活化后取孢子制成懸液，調(diào)孢子濃度為1X107個(gè) /mL，按照1%的接種量接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基(500mL三角瓶裝液量100mL)。溫度 28°C、轉(zhuǎn)速180rpm，震蕩培養(yǎng)5天后取粗酶液分別在3(TC和6(TC下測(cè)定淀粉酶活 力，從中篩選出淀粉酶活力最強(qiáng)的菌株1-95。
菌株1-95在分離平板上的形態(tài)見(jiàn)圖1，菌株1-95在分離平板上的淀粉降解圈 見(jiàn)圖2。
二、菌株鑒定
生長(zhǎng)特征菌株1-95在PDA平板上生長(zhǎng)緩慢，28。C培養(yǎng)5天后直徑僅1.5cra。 形態(tài)特征菌株1-95在PDA平板上生長(zhǎng)5天后的形態(tài)見(jiàn)圖3。菌落生長(zhǎng)初期菌 絲為白色，然后慢慢變黃，再分化出分生孢子梗，至分化出分生孢子時(shí)菌落變?yōu)榍?色。菌落初期為松散的絨毛狀，至分化出分生孢子時(shí)菌落變得致密。用光學(xué)顯微鏡 觀察到菌絲有隔，分生孢子梗為掃帚狀，共有二輪分生孢子小梗，在第二輪分生孢 子小梗的頂端分化出分生孢子(見(jiàn)圖4)。分生孢子為圓形或橢圓形。 參照《真菌鑒定手冊(cè)》將菌株1-95鑒定為青霉屬(尸朋A^'7h'咖)。
通過(guò)菌株1-95的生長(zhǎng)特征鑒定和形態(tài)特征鑒定，確認(rèn)菌株1-95為青霉屬 (尸朋ic^7i咖)。將青霉(尸朋ici77i鵬s; . ) 1-95保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 2645。
實(shí)施例2、青霉(尸朋icWh'鵬w. ) 1-95 CGMCC No. 2645生產(chǎn)的淀粉酶的酶 學(xué)特性
酶活力定義將可溶性淀粉溶于pH4. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，使其終 濃度為0.25% (每100毫升溶液中含有0.25克可溶性淀粉)，3(TC條件下，每小時(shí) 釋放出相當(dāng)于1毫克葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
酶活力測(cè)定方法采用DNS(3， 5-dinitrosalicylate)法。3， 5-二硝基水楊酸 (DNS)與還原糖共熱后被還原成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，該物質(zhì)在540 nm 處有特征吸收峰。在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖的量和棕紅色物質(zhì)顏色的深淺程度 成一定的比例關(guān)系，因此可以通過(guò)測(cè)定540 nm的光吸收值對(duì)還原糖進(jìn)行定量
(Miller G L Use of dinitrosalicyclic acid reagent for determination of reducing sugar. Biotechnol Bioeng Symp 1959,5:193-219.)。
青霉(尸e/7ic^7/〃//7 sp. ) 1-95 CGMCC No. 2645于28°C、 180rpm振蕩培養(yǎng)9 天后取發(fā)酵液13000rpm離心5min，上清液即為粗酶液。
一、 青霉1-95生產(chǎn)的淀粉酶的酶活力
將粗酶液稀釋20倍，作為待測(cè)酶液A;將粗酶液稀釋20倍，煮沸5min滅活， 作為待測(cè)酶液B(空白對(duì)照)。
1、 將可溶性淀粉溶于pH4.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，得到淀粉溶液(每 100毫升溶液中含有0.25克可溶性淀粉)。
2、 在350PL淀粉溶液中加入50PL待測(cè)酶液30。C反應(yīng)1小時(shí)。
3、 加兩倍體積DNS終止反應(yīng)并煮沸5min顯色。
4、 測(cè)定540 nm的光吸收值，計(jì)算酶活力。 設(shè)置三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
待測(cè)酶液的酶活力為1.50 U/mL，所以粗酶液的酶活力為30.00 U/mL。
二、 青霉1-95生產(chǎn)的淀粉酶的最適作用pH值
將粗酶液稀釋至5倍體積，作為待測(cè)酶液A;將粗酶液稀釋至5倍體積，煮沸 5min滅活，作為待測(cè)酶液B (空白對(duì)照)。
1、將可溶性淀粉分別溶于pH3. 5至6. 5 (以0. 5作為pH梯度)的磷酸氫二鈉- 檸檬酸緩沖液，得到淀粉溶液，各淀粉溶液中淀粉的終濃度均為0.25% (每100毫 升溶液中含有0.25克可溶性淀粉)。
2、 在350叱淀粉溶液中加入50叱待測(cè)酶液3(TC反應(yīng)15min。
3、 加兩倍體積DNS終止反應(yīng)并煮沸5min顯色。
4、 測(cè)定540 nm的光吸收值，計(jì)算酶活力。 設(shè)置三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
將待測(cè)酶液的酶活力乘以稀釋倍數(shù)，得到粗酶液的酶活力。粗酶液的酶活力為 10. 10 U/mL (pH3, 5) 、 30. 00 U/mL (pH4. 0) 、 39. 69 U/mL (pH4. 5) 、 42. 73 U/mL (pH5. 0) 、 37. 56 U/mL (pH5. 5) 、 28. 45 U/mL (p朋.0) 、 15. 08 U/mL (p服.5)。
以最高酶活力作為100%，其他pH值的酶活力折算為相對(duì)于最高酶活力的相對(duì) 酶活力。以pH值為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖，見(jiàn)圖5。
結(jié)果表明，青霉1-95生產(chǎn)的淀粉酶的最適作用pH約為5. 0。
三、青霉1-95生產(chǎn)的淀粉酶的最適作用溫度
將粗酶液稀釋至5倍體積，作為待測(cè)酶液A;將粗酶液稀釋至5倍體積，煮沸 5min滅活，作為待測(cè)酶液B (空白對(duì)照)。
1、 將可溶性淀粉溶于pH4. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，得到淀粉溶液(每 100毫升溶液中含有0.25克可溶性淀粉)。
2、 在350叱淀粉溶液中加入50HL待測(cè)酶液，分別在15-7CTC (以5。C作為溫 度梯度)反應(yīng)15min。
3、 加兩倍體積DNS終止反應(yīng)并煮沸5rain顯色。
4、 測(cè)定540 nm的光吸收值，計(jì)算酶活力。 設(shè)置三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
將待測(cè)酶液的酶活力乘以稀釋倍數(shù)，得到粗酶液的酶活力。粗酶液的酶活力為 15.45U/mL (15°C) 、 19. 10 U/mL (20°C) 、 22. 81 U/mL (25°C) 、 30. 00 U/mL (30 。C) 、 33.87 U/mL (35°C) 、 35.96 U/mL (40°C) 、 37.25 U/mL (45°C) 、 33.34 U/mL (50°C) 、 25.71U/mL (55°C) 、 17. 09 U/mL (60°C) 、 11. 20 U/mL (65°C)、 5.47 U/mL (70°C)。
以最高酶活力作為100%，其他溫度的酶活力折算為相對(duì)于最高酶活力的相對(duì) 酶活力。以溫度為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖，見(jiàn)圖6。
結(jié)果表明，青霉1-95生產(chǎn)的淀粉酶的最適作用溫度約為45°C。
四、 青霉1-95生產(chǎn)的淀粉酶的溫度耐受性
將粗酶液稀釋至4倍體積，作為酶液A;將粗酶液稀釋至4倍體積，煮沸5min 滅活，作為酶液B (空白對(duì)照)。取若干份酶液A，分別在35'C、 40°C、 45。C和50 。C下保溫1-6h;同樣，取若干份酶液B，分別在35'C、 40°C、 45。C和5(TC下保溫 1-6h。
1、 將可溶性淀粉溶于pH4.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，得到淀粉溶液，各 淀粉溶液中淀粉的終濃度均為0. 25%(每100毫升溶液中含有0. 25克可溶性淀粉)。
2、 每350叱淀粉溶液中加入5(HiL不同溫度處理后的酶液，3(TC反應(yīng)15min。
3、 加兩倍體積DNS終止反應(yīng)并煮沸5min顯色。
4、 測(cè)定540 nm的光吸收值，計(jì)算酶活力。 設(shè)置三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
將待測(cè)酶液的酶活力乘以稀釋倍數(shù)，得到粗酶液的酶活力。粗酶液的酶活力為 35。C處理lh:30. 00 U/mL、 2h: 29.96 U/mL、 3h: 30.00 U/mL、 4h: 30.00 U/mL、 5h: 29.38 U/mL、 6h: 29.18 U/mL; 40。C處理lh:23. 81 U/mL、 2h: 21.48 U/mL、 3h: 20.71 U/mL、 4h: 16.84 U/mL、 5h: 14.12 U/mL、 6h: 12.88 U/mL; 45。C處理 lh:5. 64 U/mL、 2h: 2.24 U/mL、 3h: 0 U/mL; 50。C處理lh: 1. 29 U/mL、 2h:0U/mL
以步驟一測(cè)定的粗酶液的酶活力作為100%，將不同溫度和時(shí)間處理后酶液的酶 活力折算為相對(duì)酶活力。以溫度為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖，見(jiàn)圖7。
結(jié)果表明，青霉1-95生產(chǎn)的淀粉酶在4(TC保溫lh后活性開(kāi)始稍有喪失，在 5(TC保溫lh后活性幾乎全部喪失，說(shuō)明該淀粉酶對(duì)溫度比較敏感。
五、 青霉1-95生產(chǎn)的淀粉酶的淀粉水解產(chǎn)物分析 將粗酶液稀釋至5倍體積，作為待測(cè)酶液。
1、 將可溶性淀粉溶于pH4.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，得到淀粉溶液，淀 粉的終濃度均為2% (每100毫升溶液中含有2克可溶液淀粉)。
2、 在350PL淀粉溶液中加入50叱待測(cè)酶液3(TC反應(yīng)。
3、 在反應(yīng)的不同時(shí)間取上清液，使得所有反應(yīng)時(shí)間作用產(chǎn)生的產(chǎn)物能夠反映 淀粉酶對(duì)可溶性淀粉的作用過(guò)程；將煮沸5min滅活的上清液作對(duì)照。
取10叱上清液樣品上樣，室溫下上行展開(kāi)5h (展開(kāi)液配方為正丁醇乙酸 水=4: 2: 1),展層結(jié)束后取出薄板吹干，密閉器皿中碘熏顯色。結(jié)果見(jiàn)圖8。圖 8中各泳道分別為M:葡萄糖和麥芽糖標(biāo)樣；泳道l:青霉1-95粗酶液；泳道2:
粗酶液與淀粉溶液在3(TC下保溫5分鐘；泳道3:粗酶液與淀粉溶液在3(TC下保溫
15分鐘；泳道4:粗酶液與淀粉溶液在3(TC下保溫30分鐘；泳道5:粗酶液與淀
粉溶液在3(TC下保溫60分鐘；泳道6:粗酶液與淀粉溶液在3(TC下保溫12()分鐘； 泳道7:粗酶液與淀粉溶液在3(TC下保溫240分鐘。
結(jié)果表明，青霉1-95生產(chǎn)的淀粉酶作用于可溶性淀粉并沒(méi)有首先釋放出葡萄 糖，而是釋放出寡糖，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)漸漸釋放出葡萄糖，最后產(chǎn)物只有葡萄 糖。推測(cè)青霉(尸ew'w7h'鵬)l-95生產(chǎn)的淀粉酶里含有a-淀粉酶，但不確定是否 含有其它的淀粉酶。
實(shí)施例3、利用青霉(尸e/^cWh'鵬印.)1-95 CGMCC No. 2645發(fā)酵產(chǎn)酒精
在A、 B和C三個(gè)5L三角瓶中裝4000mL高溫蒸煮液化之后的木薯醪液(廣西平 果凱特生物化工有限公司，總糖含量為17. 17%，液化率(還原糖占總糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 為35%)，降溫到3(TC后用鹽酸調(diào)節(jié)pH為4. 0，各添加50mL已活化的耐高溫釀酒高 活性干酵母(湖北省宜昌市安琪酵母股份有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)80000022)。按 照同步糖化發(fā)酵時(shí)間為64h計(jì)算需要添加酶量的理論值，確定添加量。青霉1-95 于28°C、 180rpm振蕩培養(yǎng)九天后取發(fā)酵液13000rpm離心5min，上清液即為粗酶液。 A、 B、 C三瓶木薯醪液進(jìn)行如下處理
A瓶(陰性對(duì)照)用蒸餾水定容至4500mL;
B瓶(理論值30倍的酶量)
加入粗酶液后，用蒸餾水定容至4500mL，使得B瓶中酶活力為8490 U/mL(30 。C、 pH4. 0);
C瓶(理論值100倍的酶量)加入粗酶液后，用蒸餾水定容至4500mL，使得 C瓶中酶活力為28300 U/mL(30。C、 pH4. 0);
在第16、 32、 48和64小時(shí)取發(fā)酵液測(cè)定酒份，并且在64h時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中的 殘余總糖量。酒份和殘余總糖量的測(cè)定依照文獻(xiàn)(胡嗣明，張?zhí)旌?酒精生產(chǎn)分析 檢驗(yàn)[M].輕工業(yè)出版社，1983.)所述方法進(jìn)行。設(shè)置3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均 值。
結(jié)果見(jiàn)圖9，圖9A為發(fā)酵液中的酒份隨時(shí)間變化的曲線；9B為發(fā)酵完成后， 發(fā)酵液中的殘余總糖量。結(jié)果表明添加了淀粉酶的試驗(yàn)組，酒份隨著發(fā)酵時(shí)間的 推移而增加，發(fā)酵完成時(shí)，A處理未測(cè)得到酒份；B處理產(chǎn)生酒份只有2.9; C處理 產(chǎn)生酒份為8. 8。 A處理的殘余總糖量為16. 8%，這與木薯液化醪的總糖17. 17%相
差不大，說(shuō)明由于未添加淀粉酶，木薯液化醪中的糊精未被降解成葡萄糖，酵母不 能利用來(lái)產(chǎn)生酒精，所以殘余總糖量幾乎與發(fā)酵開(kāi)始時(shí)相等。B處理的殘余總糖含
量為5.3%，說(shuō)明由于淀粉酶添加不夠，木薯液化醪中還有大部分原料未被降解。C 處理殘余糖含量是0. 5%，這與工業(yè)上的殘余總糖量大致相等，說(shuō)明淀粉原料被利用 得比較徹底。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明青霉1-95生產(chǎn)的淀粉酶可以在木薯淀粉液化醪的同步 糖化發(fā)酵工藝中發(fā)揮作用，并具有一定的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.青霉(Penicillium sp.)1-95CGMCC No.2645。
2、 一種制備淀粉酶的方法，是發(fā)酵青霉(尸朋iciJ7i咖印.)1-95 CGMCC No. 2645， 得到淀粉酶。
3、 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵青霉1-95所用的培養(yǎng)基如 下每升培養(yǎng)基中含有8-12g可溶性淀粉、2-3g (NH4)2S04、 2-4g KH2P04、 4-6g胰蛋 白胨、0. l-O. 3gMgS(V 7H20、 0. 10-0. 15g CaCl2、 0. 020-0. 030g FeS04' 7H20; pH5-6。
4、 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵青霉l-95所用的培養(yǎng)基如 下每升培養(yǎng)基中含有10g可溶性淀粉、2.5g (NH4)2S04、 3g KH2P04、 5g胰蛋白胨、 0.2g MgS(V 7H20、 0. 13g CaCl2、 0. 0255g FeS04* 7H20; pH5. 5。
5、 權(quán)利要求2至4中任一所述方法制備得到的淀粉酶。
6、 權(quán)利要求5所述淀粉酶在生產(chǎn)酒精中的應(yīng)用。
7、 青霉(尸ew'ci77^/i7印，)1-95 CGMCC No. 2645在生產(chǎn)酒精中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株青霉菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了青霉(Penicillium sp.)1-95 CGMCC No.2645，同時(shí)提供了發(fā)酵青霉(Penicillium)1-95 CGMCC No.2645得到的淀粉酶。本發(fā)明提供的淀粉酶的最適pH值為5.0，最適溫度為45℃。與現(xiàn)有的淀粉酶比較，本發(fā)明的淀粉酶的最適作用條件更接近酵母菌的發(fā)酵條件。所以將本發(fā)明所提供的青霉1-95或本發(fā)明提供的淀粉酶應(yīng)用于同步糖化發(fā)酵產(chǎn)酒精工藝中，有望解決糖化酶效率低下造成的淀粉“同步糖化發(fā)酵”生產(chǎn)酒精高成本的問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12P7/06GK101372673SQ20081022392
公開(kāi)日2009年2月25日 申請(qǐng)日期2008年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月9日
發(fā)明者馮家勛, 亮 冼, 劉君梁, 唐紀(jì)良 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)