專利名稱：產(chǎn)脫氧紫色桿菌素的重組惡臭假單孢菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)脫氧紫色桿菌素的重組惡臭假單孢菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
紫色桿菌素(violacein)、脫氧紫色桿菌素是微生物的代謝產(chǎn)物，屬于吲哚衍 生物，由兩個(gè)色氨酸分子氧化縮合而成。自從19世紀(jì)末紫色桿菌素被發(fā)現(xiàn)以來， 人們對其生物功能進(jìn)行了大量的探索，發(fā)現(xiàn)紫色桿菌素具有很強(qiáng)的生物活性(1) 具有廣譜的抗菌活性，如抗 5^aA/oj^/(9cocc<W5" s〃re〃5" 、 ^fe"7Jws sp， 5Z^repfococcws sp， 歷j^oZ s"e"'鵬 vVeisserig, / sewo^衡朋51 (Sanchez et al.， Reevaluation of the Violacein Biosynthetic Pathway and its Relationship to Indolocarbazole Biosynthesis. Chembiochem. 2006 7(8) ,1231—1240.); (2) 抗氧化(Konzen et al., Antioxidant properties of violacein: possible relation on its biological function. Bioorg Med Chem. 2006. 14(24), 8307-8313) ; (3)抗腫瘤細(xì)胞(de Carvalho et al., Cytotoxic activity of violacein in human colon cancer cells. Toxicol In Vitro. 2006. 20(8)， 1514-21); (4)抗病毒性；(5)抗原生動(dòng)物；(6)作為染料加工各種材質(zhì)布 料(Akira SHIRATA et al., Isolation of Bacteria Producing Bluish-Purple Pigment and Use for Dyeing. Japan Agricultural Research Quarterly. 2000. 34(2)， 131-140)?？傊?，紫色桿菌素具有很高的醫(yī)學(xué)價(jià)值及工業(yè)應(yīng)用前景。
在已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)紫色桿菌素的菌株中，對紫色色桿菌(Cw'ohce咖)的研究最 為廣泛。2003年，C 全基因組測序完成，為紫色桿菌素合成途徑解析
及應(yīng)用提供了保證。紫色桿菌素的生物合成涉及一個(gè)基因簇，長約7. 3 k b ，包 括5個(gè)基因，分別是VioA 、 VioB、 VioE、 VioC和VioD。
脫氧紫色桿菌素是比紫色桿菌素少一個(gè)氧原子的結(jié)構(gòu)類似物，通常伴隨紫色桿 菌素產(chǎn)生,是紫色桿菌素合成途徑的副產(chǎn)物。但是脫氧紫色桿菌素產(chǎn)量很低，分離 困難，因此對其性質(zhì)及生物活性研究較少。目前急需一種便利的方法來生產(chǎn)脫氧紫 色桿菌素，加強(qiáng)對脫氧紫色桿菌素的研究和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供產(chǎn)脫氧紫色桿菌素的重組惡臭假單孢菌及其應(yīng)用。 本發(fā)明所提供的重組惡臭假單孢菌，是將脫氧紫色桿菌素合成相關(guān)基因簇導(dǎo)入 惡臭假單孢菌中獲得的重組菌，所述脫氧紫色桿菌素合成相關(guān)基因簇編碼紫色桿菌
素合成途徑中的VioA、 VioB、 VioC和VioE四種酶。
紫色桿菌素合成途徑中的VioA、 VioB、 VioC和VioE四種酶是由一株產(chǎn)紫色桿 菌素的菌株-杜搟氏菌屬("wg朋e7"邵.)B2 CGMCC他2056的紫色桿菌素合成相 關(guān)基因簇編碼的。杜搟氏菌屬(Zfeg朋eWasA) B2CGMCC他2056合成紫色桿菌素 能力較強(qiáng)，其紫色桿菌素合成相關(guān)基因簇是一個(gè)新的基因簇。
其中，所述VioA為序列表中的序列2;所述VioB為序列表中的序列3;所述 VioC為序列表中的序列4;所述VioE為序列表中的序列5。
所述脫氧紫色桿菌素合成相關(guān)基因簇具體可為如下l)或2)或3)的DNA分
子
1) 其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；
2) 在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼紫色桿菌素合 成途徑中的VioA、 VioB、 VioC和VioE四種酶的DNA分子；
3) 與l)的基因具有90X以上的同源性，且編碼紫色桿菌素合成途徑中的VioA、 VioB、 VioC和VioE四種酶的DNA分子。
所述步驟3)中的DNA分子，與l)的DNA分子最好有95X以上的同源性。 上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC， 0. 5% SDS的溶液中，在68°C下雜交，然后用
2XSSC， 0. 1% SDS和1 XSSC， 0. 1% SDS各洗膜一次。
所述惡臭假單孢菌可以為惡臭假單孢菌屬的各種常見菌株如惡臭假單孢菌
DSM 1693、惡臭假單孢菌ATCC 17485或惡臭假單孢菌NCIMB 10432。 所述重組惡臭假單孢菌可用來生產(chǎn)脫氧紫色桿菌素。 本發(fā)明的另一目的是提供一種生產(chǎn)脫氧紫色桿菌素的方法。 本發(fā)明所提供的生產(chǎn)脫氧紫色桿菌素的方法，是以L-色氨酸為底物利用所述的
重組惡臭假單孢菌發(fā)酵生產(chǎn)脫氧紫色桿菌素。
其中，所述發(fā)酵生產(chǎn)中，發(fā)酵培養(yǎng)基為NaH2P04 2H20 1. 3 g/L、 Na2HP04 12H20 3. 0 g/L、 NH4C1 0. 9 g/L、 K2HP04 3H20 7. 5 g/L、 lOOmM MgS04 7H20 10 mL/L、甘 油3 mL/L和酵母提取物1. 0 g/L。所述L-色氨酸在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為 0. 3-0. 5g/L，優(yōu)選為0. 4g/L。所述發(fā)酵培養(yǎng)基還含有誘導(dǎo)劑。所述誘導(dǎo)劑可根據(jù)構(gòu) 建脫氧紫色桿菌素合成相關(guān)基因簇表達(dá)載體的出發(fā)載體的不同，選擇不同的誘導(dǎo) 齊U。如選用pET系列載體用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，如選用pCOM系列載體，所述誘導(dǎo)劑具 體可為正己烷。所述正己烷的終濃度為1.0 mmol/L。
脫氧紫色桿菌素是紫色桿菌素合成途徑的副產(chǎn)物，通常產(chǎn)量很低，分離困難， 無法進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)及應(yīng)用。本發(fā)明的重組惡臭假單孢菌生產(chǎn)脫氧紫色桿菌素，其 產(chǎn)率較高，通常的搖瓶培養(yǎng)就可以達(dá)到1.5g/L發(fā)酵液，且提取方便，分離純化簡 單；并且，本發(fā)明的重組菌尸.p〃fi^ -VioAD是惡臭假單胞菌，方便控制，便于 工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為重疊延伸PCR重組脫氧紫色桿菌素合成相關(guān)基因簇。 圖2為PCR擴(kuò)增獲得紫色桿菌素合成相關(guān)基因簇片段A、 B、 C和D的結(jié)果。 圖3為高效液相色譜結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、產(chǎn)脫氧紫色桿菌素的重組菌尸.P"^Ws -VioAD 1)脫氧紫色桿菌素合成相關(guān)基因簇
將杜搟氏菌屬("收朋e77a )B2 CGMCC Na2056接入液體培養(yǎng)基(淀粉15g/L、 硫酸亞鐵0. 03g/L、硝酸鉀lg/L、磷酸氫二鉀0. 7g/L、硫酸鎂0. 5g/L、色氨酸 0.5g/L， pH為7.0)， 25°C， 200rpm培養(yǎng)36小時(shí)，按上海生工基因組DNA提取試 劑盒說明書提取杜搟氏B2菌基因組DNA。
根據(jù)紫色桿菌素基因簇序列，釆用01igo 7.10軟件設(shè)計(jì)3對引物，引物序列 如表l，其中P1、P2擴(kuò)增vioA及部分vioB基因部分序列，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為片段A！ P3、 P4擴(kuò)增部分vioB及vioC基因，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為片段B; P5、 P6擴(kuò)增vioE基 因，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為片段C; P4和P5兩條引物之間有48bp的重復(fù)序列(圖l)。
表l. PCR引物設(shè)計(jì)
引物 s薩仏", 酶切
泊n 引物序列 pa
編號 位點(diǎn)
Pl 5' -GGATcATTAATGACAAATTATTCTGACATTTGCATAG-3' ^se I
P2 5'-AAGAGTGGACTTGGCGGCCGCTTCGACCTG-3' tVW I
P3 5'-TATAAGCGGCCGCCAAGTCCAC-3' Abfl
P4 5' -TGGCGTGCGGTGGCATGGCGTCTCCTTAGTTTACCCTTCCAAGTTTGTACC-3' —
P5 5' -GGTACAAACTTGGMGGGTAAACTAAGGAGACGCCATGCCACCGCACG-3' —
P6 5' -GGAATGTCCTCGAGTTCCGACACGAAAACGCTGGC-3' J力o7 I
分別使用Pl和P2 、 P3和P4及P5和P6引物及高保真Pfu DNA聚合酶對杜搟 氏B2菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50 y L ， DNA模板為0. 5 u g , 上下游引物各25 pmol ，2. 5U Pfu DNA聚合酶。
擴(kuò)增片段A和B采用表2中的PCR程序I ，擴(kuò)增片段C采用表2中的PCR程 序II。
表2. PCR擴(kuò)增程序
PCR程序步驟循環(huán)次數(shù)溫度設(shè)定及時(shí)間
1194。C，3 min
I23094。C1 min， 57°C1min，72°C 3min
3172。C10 min
1194°C，3 min
II23094°C1 min， 68°C1min,72°C 1min
3172°C10 min
III1194°C，3 min
2294°C1 min， 50°C172。C 5min
33094。C1 min， 50°C1min，72°C 5min
4172。C10 min
PCR產(chǎn)物片段B和C按1 : 1的體積比混合，然后稀釋10倍，作為進(jìn)一步PCR
擴(kuò)增的模板。
PCR反應(yīng)體系為50 L ，上述含有片段B、C的混合物1. 5 u L ， 2. 5U TaKaRa Pfu DNA聚合酶。PCR反應(yīng)程序?yàn)镻CR程序III，當(dāng)運(yùn)行完第2步時(shí)停止程序，向反應(yīng)體 系中加入P3、 P6引物各25pmol后接著運(yùn)行PCR程序m中的3、 4步驟，將片段B 和C連接在一起形成片段D。用PCR產(chǎn)物試劑盒純化片段D，將片段D克隆到pMD18-T 載體中，獲得pMD18-T-D載體，測序，測序結(jié)果表明片段D的核苷酸序列為序列表 中序列1自5'末端第3058-6198位所示。
PCR擴(kuò)增獲得紫色桿菌素基因簇片段A、 B、 C和D的結(jié)果如圖2所示。 用Ae I和船t I雙酶切片段A、 K I和J力oJ I雙酶切pMD18-T-D載體及7Vye I和 5"WI雙酶切表達(dá)載體pC0M10 (Smits T. H. M. et al. ， New alkane-responsive expression vectors for ￡ co/i and尸sei/G^M o朋5". Plasmid 200L 46, 16 - 24.)(清華大學(xué))回收3057bp的片段A、 3140bp的片段D和pCOM10載體酶切后的大片段， 將上述回收的三個(gè)片段在T4 DNA連接酶的作用下連接構(gòu)建重組表達(dá)載體pC0M10Vio AD。將重組表達(dá)載體pC0M10VioAD轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂 于含卡那霉素(50y g/ml)的LB平板上，挑取轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)后采用堿裂解法提取質(zhì)粒， 篩選含插入片斷的陽性克隆，進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明VioAD片段的核苷酸序列如 序列表中序列l(wèi)所示，序歹Ul自5'末端第l-1308位為VioA基因，編碼紫色桿菌素合 成途徑中的VioA酶(序列表中序列2);自5'末端第1305-4322位為VioB基因，編碼 紫色桿菌素合成途徑中的VioB酶(序列表中序列3);自5'末端第4323-5612位為 VioC基因，編碼紫色桿菌素合成途徑中的VioC酶(序列表中序列4);自5'末端第 5622-6197為VioE基因，編碼紫色桿菌素合成途徑中的VioE酶(序列表中序列5)。 VioAD片段中不含有紫色桿菌素基因簇中的VioD基因。該VioAD即為脫氧紫色桿菌 素合成相關(guān)基因簇。
2)表達(dá)VioA、 VioB、 VioC和VioE四種酶的重組惡臭假單孢菌尸./w"A-Vio
△D
將重組載體pC0M10VioAD轉(zhuǎn)入惡臭假單孢菌6^ewG^/z cwas pwf^/sJ mt-2 NCIMB 10432，獲得重組菌尸./ 〃"Wa -VioAD，以pC0M10載體轉(zhuǎn)入尸se〃flto 70朋s ;wz^Va mt-2 NCIMB 10432，獲得的重組菌尸.；w"Va"pC0M10為對照。
在LB培養(yǎng)基中37"C培養(yǎng)菌體濃度0D,為0. 7，加入體積百分含量為0. 05%正 己烷，2(TC誘導(dǎo)30h。將50mL發(fā)酵液在7000Xg下離心10min，棄上清液，在沉淀 物中加入同體積的去離子水后用漩渦混合器將其混勻洗滌，在7000Xg下離心 10min，然后加入無水乙醇50mL，用漩渦混合器將其充分混勻，將洗滌液7000Xg 離心10min，上清轉(zhuǎn)移到另外的干凈的容器中，重復(fù)加入無水乙醇溶液，如上步驟 直到菌體呈現(xiàn)灰白色為止，合并所有的乙醇提取溶液。
在尸./w"A"pC0M10的乙醇溶液中沒有得到藍(lán)色物質(zhì)；在尸.-VioAD 的乙醇溶液中得到藍(lán)色物質(zhì)，將尸./w"'A -VioAD的乙醇溶液減壓蒸餾獲得的物 質(zhì)溶于100%甲醇中進(jìn)行高效液相色譜分析，使用Agilent-1100高效液相色譜儀， 色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18, 150ramX4mm， 5 n m;柱溫30°C ;洗脫劑為 體積比為70%的甲醇水溶液；流速L0mL/rain ;檢測波長570nm。
高效液相色譜檢測結(jié)果如圖3所示，表明尸./wWA -VioAD的乙醇溶液中的 藍(lán)色物質(zhì)與杜搟氏菌屬"wg^W" B2紫色桿菌素副產(chǎn)物——脫氧紫色桿菌素保留 時(shí)間一致(4. 9min)，并且只有一個(gè)峰值。說明尸.；w^Va-VioAD的乙醇溶液中的 藍(lán)色物質(zhì)為脫氧紫色桿菌素。圖3中，I:杜搟氏菌屬(Duganella sp. ) B2 CGMCC N22056所產(chǎn)色素高效液相色譜圖，第一峰為紫色桿菌素，第二峰為脫氧紫色桿菌素; II:尸./w"cfe -VioAD所產(chǎn)色素高效液相譜圖。
上述結(jié)果說明重組惡臭假單孢菌尸.p^iWs -VioAD能表達(dá)紫色桿菌素合成途 徑中的VioA、 VioB、 VioC和VioE 4種酶，可以合成脫氧紫色桿菌素。
實(shí)例2、重組菌尸.-VioAD生產(chǎn)脫氧紫色桿菌素
將尸.pw^Va-VioAD接入添加色氨酸的E2液體培養(yǎng)基(NaH2P04 2H20 1. 3 g/L， Na2HP04 12H20 3 . 0 g/L， NH4C1 0. 9 g/L， K2HP04 3H20 7. 5 g/L， lOOmM MgS04 7H20 10 niL/L ,甘油3 mL/L，酵母提取物1. 0 g/L， pH為7. 0)，色氨酸的終濃度為0. 4g/L， 3(TC， 200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。次日按10ml/100ral的接種量，接種至新鮮的含卡那 霉素(50u g/ml)的添加色氨酸(終濃度0. 4g/L)的E2液體培養(yǎng)基中3(TC繼續(xù)發(fā) 酵培養(yǎng)3-4 h至OD,為1.0時(shí)加誘導(dǎo)劑正己烷(0.05 ml/100ml)進(jìn)行誘導(dǎo)，20" 誘導(dǎo)培養(yǎng)30 h，離心收集菌體，菌體用乙醇進(jìn)行提取，得到藍(lán)紫色物質(zhì)。
將杜搟氏菌屬(A/g朋e7"印.)B2 CGMCC Ns2056接入液體培養(yǎng)基(淀粉 15g/L、硫酸亞鐵0.03g/L、硝酸鉀lg/L、磷酸氫二鉀0. 7g/L、硫酸鎂0. 5g/L、 色氨酸0.5g/L， pH為7.0)， 25°C， 200rpm培養(yǎng)36小時(shí)，離心收集菌體，菌體用 乙醇進(jìn)行提取，得到藍(lán)紫色物質(zhì)。
對上述兩種藍(lán)紫色物質(zhì)分別進(jìn)行高效液相色譜檢測，方法同實(shí)施例l。
尸.-VioAD的藍(lán)紫色物質(zhì)的高效液相色譜檢測結(jié)果表明該藍(lán)紫色物質(zhì) 為脫氧紫色桿菌素。杜搟氏菌屬(Zfeg朋e7h ) B2 CGMCC N22056的藍(lán)紫色物質(zhì) 的高效液相色譜檢測結(jié)果表明該藍(lán)紫色物質(zhì)為紫色桿菌素和脫氧紫色桿菌素的混 合物。
對尸.p〃^Va -VioAD和杜搟氏菌屬(A/卵7 e7i3印.)B2 CGMCC Ns2056生產(chǎn)的 脫氧紫色桿菌素進(jìn)行定量分析。
定量分析是通過測定藍(lán)紫色物質(zhì)(色素)的乙醇溶液在最大吸收波長的吸光度 值來衡量，Duganella sp B2所產(chǎn)脫氧紫色桿菌素測定波長為562nm，以無水乙醇作 空白對照，通過吸光度值——色素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相對應(yīng)的色素濃度值，每個(gè)試 驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，得到的吸光系數(shù)e為14.852 1 g 1 cnT1。
定量分析結(jié)果表明，尸.P""^-VioAD生產(chǎn)的脫氧紫色桿菌素的量較高，最終 產(chǎn)量達(dá)1.5g/L (平均值)，遠(yuǎn)高于杜搟氏菌屬("wg朋e^a卬.)B2 CGMCC Na2056 的脫氧紫色桿菌素的合成量(0. 16g/L)。
序列表
〈110>清華大學(xué)
〈120>產(chǎn)脫氧紫色桿菌素的重組惡臭假單孢菌及其應(yīng)用
<130> CGGNARW81756 <160> 1
〈210〉 1 <211> 6197 <212> 腿
<213>杜搟氏菌屬("^"朋eL/s印.)B2 CGMCC 2056 〈400〉 1
atgacaaatt attctgacat ttgcatagtt ggcgcaggca tagggggcct cagttgtgcg 6G
acccagttga tcaacgccgc cgccggcaag aatttacgga tcagggtgtt cgacatggat 120
acgacggtgg gcgggcgcat ccagtcgcat aaagtagacg aggaggaaat cgccgaactc 180
ggcgccgccc gctactcgcc gcaactccat ccgcatttcg agcaactcat gcaggaatgc 240
gggctggcgc atgcgaccta ccctttcacc caggtggtgt cgctcgatca ggcgcaggag 300
aaactgaagg caactctgct gagcctgagt gcgatgctga aaaaacatcc gaacga/ttcc 360
ttccttgaat tcgtcagcca gtacctgggc gccgccgaag cgacccgcat gatcaaggcg 420
accggttacg acgccttgct gctgccggtg gtctcggcag cgatggccta cgacatcatc 480
aaaaagcacc cggaaacaca aagctttacc gaaaacgccg ccaacgagtg gcgctatgcc 540
accgacggct acagcgagct gctgcgtcag ttgcagcgcc aggcccagga cgccggcgtg 600
gaattccggc tggggcatcg cttgctgtxg gttgaaaagt ccggcaccga ccatgtcctc 660
gccttccgcc atatgggcga tactcagatg caccgggcgc gccatgtgat cacgaccctc 720
ccgccgaccg ccatgaagcg cctgaacatg gattttccgg ccgccttcag tcccttccag 780
tacgattccc tgcctttgtt caaaggattc ctgaccttcg aaacagcctg gtgggacgcg 840
ctcgggctga ccgaca^agt gctgatggcc gataatcctc ttcggaaaat ctacttcaag 900
ggcgacaaat acctggtgtt ctacaccgac agcgccagcg ccacctattg gcgggagtac 960
ctggagcaag gggaagacgt ttacctggac cgggtccgcc atcacctgaa agaagtgctg 1020
ccgctgaacg gtcagccgct gccgcagatc aaggcgcatt tttacaagca ctggccgcat 1080
ggcgtcgagt tcagcctgga gccggaagcc gagcatccag caaccctgct ccaccgcgac 1140
ggcatcatct cctgctcgga cgcgtatacc tcgcattgcg gctggatgga aggcagcttg 1200
atxagcgccg ggcacgctac ccgcctgttg ctggaacggc tcagccatcc gccagcacaa 1260
tccgggcacg actttaccct cgccacctct cttactgagc gcgcatgagc attctxgact 1320
ttccccgctt tcattttcgg gggtttgccc gcgctaatgt gcccactgcc aaccgcaata 1380
cgcacggcca "tatcgatatc gcgacgaatg cggtatcgat cgcgggcgaa ccattcgacc 1440
tgagccgccc gccgtcggaa ttccatgagc acatgaaaca gcttgctccc aggttcgatg 1500
cggcgggcaa gccggatccg gagggcatct tcagcgaggc ggccggctac aatttttgcg 1560
gcaacaatca cttttcgtgg gaaaacgcca ggatcaccgg cgtccagctg cgcgatggcg 1620
aggtcgatac cgaggacgcg ctggtcggcg cc犯gctggc cctgtgggga cattacaacg 1680
actatctgcg caccacggtc aaccgcgcca gatgggtcga caacaacccc gccgagccgg 1740
acaccaccct catttacgcg ggccagttca cgctcagcgg caagcaagcc acgcccaaca 1800 caccgagcct gttcagcgcc gatatcgggc aggcgcattc ggtacgctgg gtcggcagcg 1860
gccatatcag cgagcgcagc gggcattttc tcgacgatga attcggccgt tccaggctgt 1920
tccagttttc cgtggcgaag ctcgatccgc atttcctctt caatccggac acaccgctgc 1980
cggccagcat gcgcgccttg ca卿ggcgc ttgccgacga ggatgtgctg gggctgacgg 2040
tccagtatgc gctgttcaat atgtcgacgc cgcagaaacc cgattcgccg gtgttctacg 2100
acctggccgg cggcatcggc ctgtggcgcc gcgacgagct ggccacctat ccggccggcc 2160
gtttgctgct gccgcgccag agcagcctgg ggccggtact ggtgaaggtg catgcggacc 2220
gggtgtcggt gaatatgccg acggccatcc cgttcaccac gcgcgaggcc ggcgccgtgt 2280
ccgaacagca tcctacccat gcgctgggcg gcaagcttgc gctgggcgat ctcatgctgc 2340
acggtgccac cggcaagctg atcgcccgca tcccgcaaca gctgtacctc gactactggc 2400
gccatcatgg tgtcttcgat gtgccgctgc tccacccggc cacggcctcg ggttcgctca 2460
gcatgtccag cgcgcaggcg cagtgggacg aagccgactg ggtgctgcag tccgacagca 2520
accatctgta tctggaagcg cccaaccggc aacgacagca ggactttccg cagacgatca 2580
cggtacaaag ccgcttgcgc ggcgagctgg cggcgcatcc ggcgctgacg gcgcaggcgc 2640
aggatggcga gatcgtcggc gtgcgcgtgg cgccatcggc gctgggagtt ggctatgcgg 2700
acctgaccct cacgggccgc cgttcaggcg cgacccgcat catgctgggc gaggcacagg 2760
ggcagcagtt catcggcgcg agggtgctgc ccgacgactg gcatctggac gacataccgg 2820
ccgaacaggt cgattacgcc tttctctacc agcacgtgat gagctactac gagctggtct 2880
atcccttcat gtcggacaag gtgttcagcc tggcggacca ctgcaagtgc gaaacctatt 2940
cgcgcctgat gtggcagatg tgcgatccgc agaaccggga caagagctat tacatgccga 3000
gcacgcgtga actgtcgctg ccgaaatcgc gcctgttcct gaaatacctg acccaggtcg 3060
aagcggccgc caagtccacg cttcctcaag cggtcgcacc gcatgtcatc ggctgcaagg 3120
ccgagtggat cgccgagctg aaaaaggcga tcgacctgga actgtcgctc atgctgcagt 3180
acctgtacgc cgcgtatgcc attcccaact atgcgcaggg agtgaaactg gtcgaggccg 3240
gccgctggct gccggacgag ctggagctgg cctgcggcac cgaggaccgg cgccgcaaca 3300
gcggagcgcg tggcgccctg ctcgaaatcg cccatgaaga aatgattcac tacctgatgg 3360
tcaacaatgt gctgatggcg ctcggcgagc cgttctacgc cggcgccccg gcgctgggag 3420
aacaggcgcg ccagcgcttc ggcctggaca cggaatttgc cttcgaccct ttttccgagc 3480
atgtgctggc cagattcgtg cgtttcgagt ggcccgacta tcttcccacg cccggtaaat 3540
cgatcgccac cttctatgcg gcgatccgcc aggccgtggc cgatctgccc gatctgttcg 3600
acgccgacgg cggcaaacgc ggcggcgagc accacctgtt cctcaaagag ctcaccaacc 3660
gcgcctatcc cgcctatcag ctggaagtta gcgacicgcga cagcgcgctg ttcgcgctcg 3720
acttcgtcac cgaacagggc gaagggg"tgg cggtggaatc gccccatttc gccgtgtcgc 3780
atttccagcg gctgcgcgcc ctggccggcc gcttttcggc acgcgaaaaa ccgttcgaac 3840
cggccgtgcc ggcgctgaaa aatccggtac tcgacccacg cgccgactgc accgtggtga 3900
ccgatcccaa ggcccgttcg ctgatgcagc txtaxxaggg ctgctatgaa ctgaccttcg 3960
cgctgatggc gcaccacttc gcgcaaaagc cgctgggcag cctgcgccgc txgcgcctga 4020
tgaeitgcctc catcgacettc atgaccggtt tgctgcggcc cttgtcggcc gcgctgatga 4080
acatgccgtc cggcgtaccc gggcgcaacg ccggaccgcc cgtgcccggg ccggccgaca 4140
ccgccatcag cagtgactac agcctgggat gcgagctgct ggcgcagaaa tgcctggccc 4200
tggcgc3gta cgcgcgcagc ctggaggccg 3ggtggccag cacggcgcag 3tcgac3tgt 4260
tggagttctt taatcagc犯ctgaccgatt tatctcgggg a肌gatgtxa agagaggcct 4320
gaatgcacaa aatcatcatc gtgggcggcg gcctggcggg cagcctgacc gccacttatc 4380
tggcgcagcg cggacatgag gtccacgtta tcgaaaagcg cggcgatccg ctgcgggcgg 4440
agtcagccaa cgccgatccg g,tcaactcgc gcgccattgg cgtgagcatg accgtgcgcg 4500
gcatcaaggc agtgctggcg gccggcatca gcaaggagga gctcgatcgg tgcggcgaac 4560
cggtcgtcgg catggcattt tcggtcggcg gcggccacaa ggtgcgcgaa ctgaccccgc 4620
tcgaaggctt gtttcccttg tcgctggacc gcaccgcgtt ccagcgcctg ctgaacaagt 4680
acgccgtcat gcacaaagtg aactattact tcgagcataa atgcctggac ctggacctgg 4740
acaagaaatc cgtgctgatc cagggcccgg acggcgcctt gcggcatctg caaggcgacc 4800
tgatcatcgg ggccgacggc gcccactccg ccgtgcggcg cgccatgcaa gccggcatgc 4860
ggcgcttcca gttcgaacaa tccttcttcc gccacggcta caagaccctg gtactgccga 4920
acgccgcggg actgggcttc cgcaaggatx tgctgtattt cttcggcatg gattccaagg 4980
gccagtttgc cggccgcgca gccaccatcc cggacggcag catcagcttx gccctctgcc 5040
tgccctacac cggcacgccc agcctggcca cgcgcgaccg cgccgccatg ggggagtttt 5100
tcagccgcta cttcggcatc ctgccaccgg ccagccggga agagctggtg aatcagttca 5160
tcgcgctgcc tagcaacgac ctcatcaatg tccgctccag caccttccat tacaagagca 5220
atgtcctgct gatcggcgat gcggcgcatg cgaccgcccc cttcctcggt cagggcatga 5280
acatggcgct ggaagacgtc tacgtcttca tcaccttgct ggaaaagcat cgcgatgacc 5340
tgggcctggt cUgixggag Utacggggc agcgcaaggt gcaggccgac gccatgcagg 5400
atatggcgat cgccaactac gaaatgctga gcaacccgaa ttttattttc ttcctgcaaa 5460
cccgctacac ccgctacatg cacaagaaa1: ttcccagtgt ttatccgccc gacatggcgg 5520
agaagctgta cttcacatcg gttccctacg atgtgctgca acaaatccag aagaagcaaa 5580
acgtttggta caaacttgga agggtaaact aaggagacgc catgccaccg cacgccaccc 5640
cgccgctgct gccgatgcaa tggagcagcg cctacatctc gtattggtcg ccgatgcggg 5700
aagacgacga ggtcacttcc ggctattgct ggttcgacta tgcccgcgac att"tgccgca 5760
tcgacggcct gttcaatccc tggtcggaaa aggagacggg acaccggctc tggatgtcgg 5820
aaatcggcga cgccaggcgc ggacaaagcc gcaaacagaa agtcgcttat gccagggagg 5880
cggagccggc cggcgtgaag ctgtacgagc gggcgctggc cgatgaggtc acgcccttcc 5940
acgagctgtt cctgccgcag gcgatcctga tcgacggcga agcgcgtcat gacggccgcc 6000
acacggtgct gggccaggcg gccgacgcct gggtggtgga gcggccgggc aaagccgcct 6060
cggtgttcta tctccaggcc ggcggcaatc acttgctgcg catggtcacc ggcaacgacg 6120
cgcagcatca gtcggtacgc gactttccga acttccttgc cggcgacatc gcggccagcg 6180 ttttcgtgtc ggaataa 6197
<210〉 2 〈211〉 435 <212> PRT
〈213〉 杜搟氏菌屬("yg朋e^a ) B2 CGMCC 2056 <400> 2
Met Thr Asn Tyr Ser Asp lie 1 5 Leu Ser Cys Ala Thr Gin Leu 20
Arg lie Arg Val Phe Asp Met 35
Ser His Lys Val Asp Glu Glu
50 55 Tyr Ser Pro Gin Leu His Pro 65 70 Gly Leu Ala His Ala Thr Tyr 85
Gin Ala Gin Glu Lys Leu Lys 100
Leu Lys Lys His Pro Asn Asp 115
Leu Gly Ala Ala Glu Ala Thr
14
Cys lie
lie Asn
25 Asp Thr 40
Glu lie
His Phe
Pro Phe
Ala Thr 105 Ser Phe 120
Arg Met
Val Gly 10
Ala Ala
Thr Val
Ala Glu
Glu Gin
75 Thr Gin 90
Leu Leu Leu Glu lie Lys
Ala
Ala
Gly
Leu
60
Leu
Val
Ser
Phe
Ala
Gly
Gly
Gly
45
Gly
Met
Val
Leu
Val 125 Thr
lie Gly Gly 15
Lys Asn Leu 30
Arg lie Gin
Ala Ala Arg
Gin Glu Cys 80
Ser Leu Asp 95
Ser Ala Met 110
Ser Gin Tyr Gly Tyr Asp
130 135 140
Ala Leu Leu Leu Pro Val Val Ser Ala Ala Met Ala Tyr Asp lie lie 145 150 155 160
Lys Lys His Pro Glu Thr Gin Ser Phe Thr Glu Asn Ala Ala Asn Glu
165 170 175
Trp Arg Tyr Ala Thr Asp Gly Tyr Ser Glu Leu Leu Arg Gin Leu Gin
180 185 190
Arg Gin Ala Gin Asp Ala Gly. Val Glu Phe Arg Leu Gly His Arg Leu
195 200 205
Leu Ser Val Glu Lys Ser Gly 'Thr Asp His Val Leu Ala Phe Arg His
210 215 220
Met Gly Asp Thr Gin Met His Arg Ala Arg His Val lie Thr Thr Leu 225 230 235 240
Pro Pro Thr Ala Met Lys Arg Leu Asn Met Asp Phe Pro Ala Ala Phe
245 250 255
Ser Pro Phe Gin Tyr Asp Ser Leu Pro Leu Phe Lys Gly Phe Leu Thr 260 265 270
Phe Glu Thr Ala Trp Trp Asp Ala Leu Gly Leu Thr Asp Lys Val Leu
275 280 285
Met Ala Asp Asn Pro Leu Arg Lys lie Tyr Phe Lys Gly Asp Lys Tyr
290 295 300
Leu Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ser Ala Thr Tyr Trp Arg Glu Tyr 305 310 315 320
Leu Glu Gin Gly Glu Asp Val Tyr Leu Asp Arg Val Arg His His Leu
325 330 335
Lys Glu Val Leu Pro Leu Asn Gly Gin Pro Leu Pro Gin lie Lys Ala
340 345 350
His Phe Tyr Lys His Trp Pro His Gly Val Glu Phe Ser Leu Glu Pro
355 360 365
Glu Ala Glu His Pro Ala Thr Leu Leu His Arg Asp Gly lie lie Ser
370 375 380
Cys Ser Asp Ala Tyr Thr Ser His Cys Gly Trp Met Glu Gly Ser Leu 385 390 395 400
lie Ser Ala Gly His Ala Thr Arg Leu Leu Leu Glu Arg Leu Ser His
405 410 415
Pro Pro Ala Gin Ser Gly His Asp Phe Thr Leu Ala Thr Ser Leu Thr 420 425 430
Glu Arg Ala 435
<210> 3 <211> 1005 <212> PRT
<213〉 杜搟氏菌屬("〃ga"e27a sp. ) B2 CGMCC 2056 〈400〉 3
Met Ser 1
Ala Asn
Ala Thr
Pro Pro
50 Asp Ala 65
Gly Tyr
lie Thr
Leu Val
Arg Thr 130 Pro Asp 145
Gin Ala
Ala His
Gly His
Ser Val 210 Leu Pro
lie
Val
Asn
35
Ser
Ala
Asn
Gly
Gly 115 Thr
Thr
Thr
Ser
Phe 195
Ala
Ala
Leu
Pro
20
Ala
Glu
Gly
Phe
Val 100 Ala
Val
Thr
Pro
Val 180 Leu
Lys
Ser
Asp 5
Thr
Val
Phe
Lys
Cys
85
Gin
Lys
Asn
Leu
Asn 165 Arg
Asp
Leu
Met
Phe
Ala
Ser
His
Pro
70
Gly
Leu
Leu
Arg
lie 150 Thr
Trp
Asp
Asp
Arg
Pro
Asn
lie
Glu
55
Asp
Asn
Arg
Ala
Ala 135 Tyr
Pro
Val
Glu
Pro 215 Ala
Arg
Arg
Ala
40
His
Pro
Asn
Asp
Leu 120 Arg
Ala
Ser
Gly
Phe 200 His
Leu
Phe
Asn
25
Gly
Met
Glu
His
Gly 105 Trp
Trp
Gly
Leu
Ser 185 Gly
Phe
Gin
His 10
Thr
Glu
Lys
Gly
Phe
90
Glu
Gly
Val
Gin
Phe 170 Gly
Arg
Leu
Glu
Phe
His
Pro
Gin
lie
75
Ser
Val
His
Asp
Phe 155 Ser
His
Ser
Phe
Ala
Arg
Gly
Phe
Leu
60
Phe
Trp
Asp
Tyr
Asn 140 Thr
Ala
lie
Arg
Asn 220 Leu
Gly Phe Ala Arg 15
His lie Asp lie 30
Asp Leu Ser Arg 45
Ala Pro Arg Phe
Ser Glu Ala Ala 80
Glu Asn Ala Arg 95
Thr Glu Asp Ala 110
Asn Asp Tyr Leu 125
Asn Pro Ala Glu
Leu Ser Gly Lys 160
Asp lie Gly Gin 175
Ser Glu Arg Ser 190
Leu Phe Gin Phe 205
Pro Asp Thr Pro Ala Asp Glu Asp
225
Val Leu
Gin Lys
Leu Trp
Leu Pro 290 Asp Arg 305
Glu Ala
Lys Leu
lie Ala
Gly Val 370 Leu Ser 385
Leu Gin
Arg Gin
Gly Glu
Glu lie 450 Ala Asp 465
Leu Gly Asp Asp Phe Leu Met Ser
Gly
Pro
Arg 275 Arg
Val
Gly
Ala
Arg 355 Phe
Met
Ser
Gin
Leu 435 Val
Leu
Glu
Trp
Tyr 515 Asp
Leu
Asp 260 Arg
Gin
Ser
Ala
Leu 340 lie
Asp
Ser
Asp
Asp 420 Ala
Gly
Thr
Ala
His 500 Gin
Lys
Thr 245 Ser
Asp
Ser
Val
Val 325 Gly
Pro
Val
Ser
Ser 405 Phe
Ala
Val
Leu
Gin 485 Leu
His
Val
230 Val
Pro
Glu
Ser
Asn 310 Ser
Asp
Gin
Pro
Ala 390 Asn
Pro
His
Arg
Thr 470 Gly
Asp
Val
Phe
Gin
Val
Leu
Leu 295 Met
Glu
Leu
Gin
Leu 375 Gin
His
Gin
Pro
Val 455 Gly
Gin
Asp
Met
Ser
Tyr
Phe
Ala 280 Gly
Pro
Gin
Met
Leu 360 Leu
Ala
Leu
Thr
Ala 440 Ala
Arg
Gin
lie
Ser 520 Leu
Ala
Tyr 265 Thr
Pro
Thr
His
Leu 345 Tyr
His
Gin
Tyr
lie 425 Leu
Pro
Arg
Phe
Pro 505 Tyr
Ala
Leu 250 Asp
Tyr
Val
Ala
Pro 330 His
Leu
Pro
Trp
Leu 410 Thr
Thr
Ser
Ser
lie 490 Ala
Tyr
Asp
235 Phe
Leu
Pro
Leu
lie 315 Thr
Gly
Asp
Ala
Asp 395 Glu
Val
Ala
Ala
Gly 475 Gly
Glu
Glu
His
Asn
Ala
Ala
Val 300 Pro
His
Ala
Tyr
Thr 380 Glu
Ala
Gin
Gin
Leu 柳 Ala
Ala
Gin
Leu
Cys
Met
Gly
Gly 285 Lys
Phe
Ala
Thr
Trp 365 Ala
Ala
Pro
Ser
Ala 445 Gly
Thr
Arg
Val
Val 525 Lys
Ser
Gly 270 Arg
Val
Thr
Leu
Gly 350 Arg
Ser
Asp
Asn
Arg 430 Gin
Val
Arg
Val
Asp 510 Tyr
Cys
240 Thr Pro 255
lie Gly
Leu Leu
His Ala
Thr Arg 320 Gly Gly 335
Lys Leu
His His
Gly Ser
Trp Val 400 Arg Gin 415
Leu Arg
Asp Gly
Gly Tyr
lie Met ■ Leu Pro 495
Tyr Ala Pro Phe Glu Thr
530 Tyr Ser 545
Ser Tyr
Leu Phe
Leu Pro
lie Ala 610 Gin Tyr 625
Lys Leu
Cys Gly
Leu Glu
Val Leu 690 Gly Glu 705
Asp Pro
Pro Asp
Ala lie
Gly Gly 770 Asn Arg 785
Ala Leu Val Glu Leu Ala
Arg
Tyr
Leu
Gin 595 Glu
Leu
Val
Thr
lie 675 Met
Gin
Phe
Tyr
Arg 755 Lys
Ala
Phe
Ser
Gly
Leu
Met
Lys 580 Ala
Leu
Tyr
Glu
Glu 660 Ala
Ala
Ala
Ser
Leu 740 Gin
Arg
Tyr
Ala
Pro 820 Arg
Met
Pro 565 Tyr
Val
Lys
Ala
Ala 645 Asp
His
Leu
Arg
Glu 725 Pro
Ala
Gly
Pro
Leu 805 His
Phe
Trp 550 Ser
Leu
Ala
Lys
Ala 630 Gly
Arg
Glu
Gly
Gin 710 His
Thr
Val
Gly
Ala 790 Asp
Phe
Ser
535 Gin
Thr
Thr
Pro
Ala 615 Tyr
Arg
Arg
Glu
Glu 695 Arg
Val
Pro
Ala
Glu 775 丁yr
Phe
Ala
Ala
Met
Arg
Gin
His 600 lie
Ala
Trp
Arg
Met 680 Pro
Phe
Leu
Gly
Asp 760 His
Gin
Val
Val
Arg
Cys
Glu
Val 585 Val
Asp
lie
Leu
Asn 665 lie
Phe
Gly
Ala
Lys 745 Leu
His
Leu
Thr
Ser 825 Glu
Asp
Leu 570 Glu
lie
Leu
Pro
Pro 650 Ser
His
Tyr
Leu
Arg 730 Ser
Pro
Leu
Glu
Glu 810 His
Lys
Pro 555 Ser
Ala
Gly
Glu
Asn 635 Asp
Gly
Tyr
Ala
Asp 715 Phe
lie
Asp
Phe
Val 795 Gin
Phe
Pro
540 Gin
Leu
Ala
Cys
Leu 620 Tyr
Glu
Ala
Leu
Gly 700 Thr
Val
Ala
Leu
Leu 780 Ser
Gly
Gin
Phe
Asn
Pro
Ala
Lys 605 Ser
Ala
Leu
Arg
Met 685 Ala
Glu
Arg
Thr
Phe 765 Lys
Asp
Glu
Arg
Glu
Arg
Lys
Lys 590 Ala
Leu
Gin
Glu
Gly 670 Val
Pro
Phe
Phe
Phe 750 Asp
Glu
Gly
Leu 830 Pro
Asp Lys 560 Ser Arg 575
Ser Thr
Glu Trp
Met Leu
Gly Val 640 Leu Ala 655
Ala Leu
Asn Asn
Ala Leu
Ala Phe 720 Glu Trp 735
Tyr Ala
Ala Asp
Leu Thr
Asp Ser 800 Val Ala 815
Arg Ala Ala Val
835 840 845
Pro Ala Leu Lys Asn Pro Val Leu Asp Pro Arg Ala Asp Cys Thr Val
850 855 860
Val Thr Asp Pro Lys Ala Arg Ser Leu Met Gin Leu Tyr Gin Gly Cys 865 870 875 880
Tyr Glu Leu Thr Phe Ala Leu Met Ala His His Phe Ala Gin Lys Pro
885 890 895
Leu Gly Ser Leu Arg Arg Ser Arg Leu Met Asn Ala Ser lie Asp lie
900 905 910
Met Thr Gly Leu Leu Arg Pro Leu Ser Ala Ala Leu Met Asn Met Pro
915 920 925
Ser Gly Val Pro Gly Arg Asn Ala Gly Pro Pro Val Pro Gly Pro Ala
930 935 940
Asp Thr Ala lie Ser Ser Asp Tyr Ser Leu Gly Cys Glu Leu Leu Ala 945 950 955 960
Gin Lys Cys Leu Ala Leu Ala Gin Tyr Ala Arg Ser Leu Glu Ala Glu
965 970 975
Val Ala Ser Thr Ala Gin lie Asp Met Leu Glu Phe Phe Asn Gin Gin
■ 985 990
Leu Thr Asp Leu Ser Arg Gly Lys Met Ser Arg Glu Ala 995 1000 1005
<210〉 4 <211〉 429 〈212〉 PRT
〈213〉 杜搟氏菌屬(Zfe卵/ eWa印.)B2 CGMCC 2056 〈400〉 4
Met His Lys 1
Ala Thr Tyr
Arg Gly Asp 35
Ser Arg Ala 50
Leu Ala Ala 65
lie lie lie Val Gly Gly Gly Leu Ala Gly Ser Leu Thr
5 10 15
Leu Ala Gin Arg Gly His Glu Val His Val lie Glu Lys 20 25 30
Pro Leu Arg Ala Glu Ser Ala Asn Ala Asp Pro Val Asn
40 45 lie Gly Val Ser Met Thr Val Arg Gly lie Lys Ala Val
55 60 Gly lie Ser Lys Glu Glu Leu Asp Arg Cys Gly Glu Pro 70 75 80
Val Val Gly Met
Leu Thr Pro Leu 100
Phe Gin Arg Leu 115
Tyr Phe Glu His 130
Leu lie Gin Gly 145
lie lie Gly Ala
Ala Gly Met Arg 180
Tyr Lys Thr Leu 195
Asp Leu Leu Tyr 210
Arg Ala Ala Thr 225
Pro Tyr Thr Gly
Gly Glu Phe Phe 260
Glu-Glu Leu Val 275
Asn Val Arg Ser 290
Gly Asp Ala Ala 305
Met Ala Leu Glu
Arg Asp
Val Gin
Leu Ser 370
Asp
Ala 355 Asn
Leu 340 Asp
Pro
Ala
85
Glu
Leu
Lys
Pro
Asp 165 Arg
Val
Phe
lie
Thr 245 Ser
Asn
Ser
His
Asp 325 Gly
Ala
Asn
Phe
Gly
Asn
Cys
Asp 150 Gly
Phe
Leu
Phe
Pro 230 Pro
Arg
Gin
Thr
Ala 310 Val
Leu
Met
Phe
Ser
Leu
Lys
Leu 135 Gly
Ala
Gin
Pro
Gly 215 Asp
Ser
Tyr
Phe
Phe 295 Thr
Tyr
Val
Gin
lie 375
Val
Phe
Tyr 120 Asp
Ala
His
Phe
Asn 200 Met
Gly
Leu
Phe
lie 280 His
Ala
Val
Leu
Asp 360 Phe
Gly
Pro 105
Ala
Leu
Leu
Ser
Glu 185 Ala
Asp
Ser
Ala
Gly 265 Ala
Tyr
Pro
Phe
Ser 345 Met
Phe
Gly
90
Leu
Val
Asp
Arg
Ala 170 Gin
Ala
Ser
lie
Thr 250 lie
Leu
Lys
Phe
lie 330 Glu
Ala
Leu'
Gly
Ser
Met
Leu
His 155 Val
Ser
Gly
Lys
Ser 235 Arg
Leu
Pro
Ser
Leu 315 Thr
Phe
lie
Gin
His
Leu
His
Asp 140 Leu
Arg
Phe
Leu
Gly 220 Phe
Asp
Pro
Ser
Asn 300 Gly
Leu
Thr
Ala
Thr 380
Lys Val Arg Glu 95
Asp Arg Thr Ala 110
Lys Val Asn Tyr 125
Lys Lys Ser Val
Gin Gly Asp Leu 160
Arg Ala Met Gin 175
Phe Arg His Gly 190
Gly Phe Arg Lys 205
Gin Phe Ala Gly
Ala Leu Cys Leu 240
Arg Ala Ala Met 255
Pro Ala Ser Arg 270
Asn Asp Leu lie 285
Val Leu Leu lie
Gin Gly Met Asn 320
Leu Glu Lys His 335
Gly Gin Arg Lys 350
Asn Tyr Glu Met 365
Arg Tyr Thr ArgTyr Met His Lys Lys Phe Pro Ser Val Tyr Pro Pro Asp Met Ala Glu 385 390 395 400
Lys Leu Tyr Phe Thr Ser Val Pro Tyr Asp Val Leu Gin Gin lie Gin
405 410 415
Lys Lys Gin Asn Val Trp Tyr Lys Leu Gly Arg Val Asn 420 425
<210> 5 〈211〉 191 <212> PRT
<213> 杜搟氏菌屬("wg3"^Z/a sp. ) B2 CGMCC 2056 <400〉 5
Met Pro 1
Ala Tyr
Ser Gly
Gly Leu 50
Met Ser 65
Val Ala
Arg Ala
Gin Ala
Val Leu 130 Ala Ala 145
Met Val
Pro
lie
Tyr 35 Phe
Glu
Tyr
Leu
lie 115 Gly
Ser Thr Asn Phe Leu
His
Ser
20
Cys
Asn
lie
Ala
Ala 100 Leu
Gin
Val
Ala
5 Tyr
Trp
Pro
Gly
Arg
85
Asp
lie
Ala
Phe
Gly Asn
165 Ala Gly 180
Thr
Trp
Phe
Trp
Asp
70
Glu
Glu
Asp
Ala
Tyr 150 Asp
Asp
Pro
Ser
Asp
Ser 55 Ala
Ala
Val
Gly
Asp 135 Leu
Ala
lie
Pro Leu Leu Pro 10
Pro Met Arg Glu 25
Tyr Ala Arg Asp 40
Glu Lys Glu Thr
Arg Arg Gly Gin 75
Glu Pro Ala Gly 90
Thr Pro Phe His 105
Glu Ala Arg His 120
Ala Trp Val Val
Gin Ala Gly Gly 155
Gin His Gin Ser 170
Ala Ala Ser Val 185
Met
Asp
lie
Gly 60 Ser
Val
Glu
Asp
Glu 140 Asn
Val
Phe
Gin
Asp
Cys 45 His
Arg
Lys
Leu
Gly 125 Arg
His
Arg
Val
Trp
Glu 30
Arg
Arg
Lys
Leu
Phe 110 Arg
Pro
Leu
Asp
Ser Ser 15
Val Thr
lie Asp
Leu Trp
Gin Lys
80 Tyr Glu 95
Leu Pro His Thr Gly Lys
Leu Arg 160 Phe Pro 175 Ser Glu 190
權(quán)利要求
1.重組惡臭假單孢菌，是將脫氧紫色桿菌素合成相關(guān)基因簇導(dǎo)入惡臭假單孢菌中獲得的重組菌，所述脫氧紫色桿菌素合成相關(guān)基因簇編碼紫色桿菌素合成途徑中的VioA、VioB、VioC和VioE四種酶。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組惡臭假單孢菌，其特征在于所述VioA為序列表 中的序列2;所述VioB為序列表中的序列3;所述VioC為序列表中的序列4;所述 VioE為序列表中的序列5。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組惡臭假單孢菌，其特征在于所述脫氧紫色 桿菌素合成相關(guān)基因簇是如下l)或2)或3)的DNA分子1) 其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；2) 在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼紫色桿菌素合成 途徑中的VioA、 VioB、 VioC和VioE四種酶的DNA分子；3) 與l)的DNA分子具有90X以上的同源性，且編碼紫色桿菌素合成途徑中的 VioA、 VioB、 VioC和VioE四種酶的DNA分子。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一所述的重組惡臭假單孢菌，其特征在于所述惡臭 假單孢菌為惡臭假單孢菌(尸sewob/zw;7as /wWA9 mt-2 NCIMB 10432。
5、 一種生產(chǎn)脫氧紫色桿菌素的方法，是以L-色氨酸為底物利用權(quán)利要求1至4中 任一所述的重組惡臭假單孢菌發(fā)酵生產(chǎn)脫氧紫色桿菌素。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵生產(chǎn)中，發(fā)酵培養(yǎng)基包含 NaH2P04'2H20 1.0—2,0 g/L、 Na2HP04 12H20 3 . 0—4. 0 g/L 、 NH4C1 0.5—1.0 g/L 、 K2HP04 3H20 7 . 0-8 . 0 g/L、 lOOmM MgS04 7H20 10-15 mL/L、甘油3-4 mL/L和酵母提 取物O. 5-1. 5 g/L。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基還含有L-色氨酸； 所述L-色氨酸的濃度為0. 3-0. 5g/L。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基還含有誘導(dǎo)劑。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)劑為正己垸。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述正己烷的濃度為0.05 ml/訓(xùn)ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了產(chǎn)脫氧紫色桿菌素的重組惡臭假單孢菌及其應(yīng)用。本發(fā)明的重組惡臭假單孢菌將脫氧紫色桿菌素合成相關(guān)基因簇導(dǎo)入惡臭假單孢菌中獲得的重組菌，所述脫氧紫色桿菌素合成相關(guān)基因簇編碼紫色桿菌素合成途徑中的VioA、VioB、VioC和VioE四種酶。所述重組惡臭假單孢菌可用來生產(chǎn)脫氧紫色桿菌素。生產(chǎn)脫氧紫色桿菌素的方法是以L-色氨酸為底物利用所述重組惡臭假單孢菌發(fā)酵生產(chǎn)脫氧紫色桿菌素。本發(fā)明的重組惡臭假單孢菌生產(chǎn)的脫氧紫色桿菌素，其產(chǎn)率較高，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/40GK101368169SQ200810224359
公開日2009年2月18日 申請日期2008年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月17日
發(fā)明者姜瑞波, 翀 張, 王海勝, 蔣培霞, 邢新會(huì) 申請人:清華大學(xué)