專利名稱：一種阿維鏈霉菌基因工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種能提高 阿維菌素產(chǎn)量的基因工程菌及其構(gòu)建方法與其在生產(chǎn)阿維菌素中的 應(yīng)用。
背景技術(shù)：
阿維菌素是由阿維鏈霉菌(5^eptom;;ces "v^vw衍fc )發(fā)酵時(shí)產(chǎn) 生的一組高效殺蟲的十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，它的天然產(chǎn)物共 有八個(gè)組分(Ala， Alb, A2a， A2b， Bla， Blb， B2a， B2b ),其中Bl組 分的殺蟲活性最強(qiáng)，主要作為殺蟲劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，幾乎抗所 有與農(nóng)業(yè)有關(guān)的線蟲和節(jié)肢動(dòng)物。阿維菌素的作用機(jī)理與常規(guī)化學(xué) 殺蟲劑不同，它們并不抑制膽堿酯酶，也不抑制蛋白質(zhì)的合成，而 是線蟲及節(jié)肢動(dòng)物類寄生蟲的神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)Y-氨基丁酸(GABA) 的激活劑，從而阻斷線蟲神經(jīng)元之間、節(jié)肢動(dòng)物神經(jīng)末梢和肌細(xì)胞 間的神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)，使寄生蟲麻痹致死。而哺乳動(dòng)物外周神經(jīng)傳導(dǎo) 遞質(zhì)為乙酰膽堿，以GABA作傳導(dǎo)遞質(zhì)的神經(jīng)僅存在于中樞神經(jīng)系 統(tǒng)，在正常使用的劑量下，由于哺乳動(dòng)物的血腦屏障作用，導(dǎo)致藥 物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布的濃度很低，不足以引起GABA的釋放，所 以對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性很小，選擇性極高。由于阿維菌素具有獨(dú)特的 作用機(jī)制，不易使害蟲產(chǎn)生抗性和交叉抗性，對(duì)作物極安全，不殺 傷天敵，有利于保持生態(tài)平衡，且易降解、無(wú)殘留，對(duì)人、畜和環(huán) 境有高度安全性，使之成為了生物農(nóng)藥的奇葩，被我國(guó)農(nóng)業(yè)部推薦 為無(wú)公害農(nóng)藥，具有非常廣闊的巿場(chǎng)前景和應(yīng)用價(jià)值。目前，阿維 菌素已在國(guó)內(nèi)實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，取得了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。但我 國(guó)阿維菌素的生產(chǎn)菌株還存在著發(fā)酵單位低，生產(chǎn)成本高等問題。
如何提高阿維菌素的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，是阿維菌素研究中一個(gè) 永恒的主題。因此，通過(guò)基因工程手段改造阿維鏈霉菌以提高阿維 菌素的產(chǎn)量，具有重要的意義。
核糖體循環(huán)因子(RRF, ribosome recyling factor)廣泛存在于細(xì)菌 中，其功能是在蛋白合成過(guò)程中與負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)位的延伸因子(EF-G)協(xié)同 作用催化完成蛋白質(zhì)合成的最后一步——翻譯終止后核糖體復(fù)合物 的解體。此外，RRF還在肽鏈的延伸過(guò)程中維持了翻譯的忠實(shí)性。 本發(fā)明嘗試?yán)煤颂求w循環(huán)因子在阿維鏈霉菌中的過(guò)量表達(dá)來(lái)提高 阿維菌素的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種阿維鏈霉菌的基因工程菌，與其出發(fā) 菌株相比其阿維菌素的產(chǎn)量得到了提高。本發(fā)明的目的還在于提供 所述基因工程菌的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的基因工程菌，是將阿維鏈霉菌中編碼核糖體循環(huán)因子 的//r基因通過(guò)表達(dá)載體引入阿維鏈霉菌中得到的核糖體循環(huán)因子 過(guò)表達(dá)的重組菌。
本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的，提供一種構(gòu)建上述工程菌的方法，其 首先將阿維鏈霉菌中編碼核糖體循環(huán)因子的基因克隆到表達(dá)載 體中，再將該表達(dá)載體引入阿維鏈霉菌獲得重組菌。
所述表達(dá)載體可以是整合型表達(dá)載體或高拷貝質(zhì)粒表達(dá)載體。
具體可釆用如下方法構(gòu)建工程菌，用PCR擴(kuò)增阿維鏈霉菌中編 碼核糖體循環(huán)因子(RRF)的，基因及其自身啟動(dòng)子，分別構(gòu)建^r 基因的多拷貝或整合型表達(dá)質(zhì)粒，并將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化 到阿維鏈霉菌菌株中得到重組菌；或用PCR擴(kuò)增阿維鏈霉菌中#r 基因的結(jié)構(gòu)基因，將之置于紅霉素抗性基因強(qiáng)啟動(dòng)子ermE*p之下， 分別構(gòu)建^r基因的多拷貝或整合型表達(dá)質(zhì)粒，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒 分別轉(zhuǎn)化到阿維鏈霉菌菌株中得到重組菌。 用于構(gòu)建^T基因表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種大腸桿菌-
鏈霉菌穿梭載體，如多拷貝質(zhì)粒載體pKC1139、 pKC505、 pIJ653、 pIJ8154，或整合型質(zhì)粒載體pSET152、 pIJ8600、 p脳60，優(yōu)選為 pKC1139和pSET152。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，以pKC1139為出發(fā)載體構(gòu)建的A基 因表達(dá)載體為pFRl-1139(含#r基因及其自身啟動(dòng)子)和pFR4-1139 (>r基因置于紅霉素抗性基因強(qiáng)啟動(dòng)子之下)；以pET 15 2 為出發(fā)載體構(gòu)建的戶r基因表達(dá)載體為pFRl-152(含戶r基因及其自 身啟動(dòng)子)和pFR4-152 (>r基因置于紅霉素抗性基因強(qiáng)啟動(dòng)子 之下)。
將^r基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化阿維鏈霉菌的方法優(yōu)選為PEG介導(dǎo)的 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，為提高轉(zhuǎn)化效率，可先將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到限制修 飾作用缺陷的大腸桿菌ET12567中，從中提取質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化阿維鏈霉 菌的原生質(zhì)體；但也可以采用其它生物工程領(lǐng)域中常用的方法，例 如電轉(zhuǎn)化法、接合轉(zhuǎn)移法等。
用于構(gòu)建重組菌的出發(fā)菌株可為任意一種阿維鏈霉菌的菌株， 優(yōu)選為阿維菌素的高產(chǎn)菌株。
本發(fā)明構(gòu)建的重組阿維鏈霉菌基因工程菌可直接用于阿維菌素 的發(fā)酵生產(chǎn)，使阿維菌素的產(chǎn)量提高，從而降低生產(chǎn)成本。


圖1為含有^r基因及其自身啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒pFRl-1139 (圖 1A)和pFRl-152 (圖1B)的質(zhì)粒圖譜；圖2為含有^r基因及紅霉 素抗性基因強(qiáng)啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒pFR4-1139 (圖2A)和pFR4-152 (圖2B)的質(zhì)粒圖譜；
圖3為阿維鏈霉菌野生型菌株ATCC31267及其不同轉(zhuǎn)化子的阿 維菌素發(fā)酵單位；
圖4為阿維鏈霉菌GB-165及其不同轉(zhuǎn)化子的阿維菌素發(fā)酵單
位；
圖5為阿維鏈霉菌76-02-e及其不同轉(zhuǎn)化子的阿維菌素發(fā)酵單
位；
圖6為>r過(guò)表達(dá)菌株ATCC31267(pFRl-1139)與ATCC31267的
阿維菌素發(fā)酵單位曲線圖7為戶r過(guò)表達(dá)菌株ATCC31267(pFRl-1139)與ATCC31267的
菌體生長(zhǎng)曲線。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明 的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步 驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所 熟知的常規(guī)手段。
實(shí)施例1、 //r基因表達(dá)載體的構(gòu)建
一、含有^T基因及其自身啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒的構(gòu)建
1、含自身啟動(dòng)子的^r基因的擴(kuò)增
設(shè)計(jì)引物，用于PCR擴(kuò)增位于阿維鏈霉菌染色體上含自身啟動(dòng) 子的^r基因[NCJ)03155.4 (3224362 ... 3223805)]，上游引物Primer Fl ( CCGACATGACCGCGATCAC )位于/〃起始密碼子上游300 bp 處， 下游引 物 Primer Rl
(CGO^rrCGTCATGCGCATCGTACGTGG,帶下劃線堿基為限制 性內(nèi)切酶五coRI識(shí)別位點(diǎn))位于#r終止密碼子下游150 bp處，擴(kuò) 增產(chǎn)物應(yīng)為976 bp。
以阿維鏈霉菌野生型菌株ACTT31267的總DNA為模板，Primer Fl和Primer Rl為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95°C, 4 min; (95°C, lmin; 60°C, 1 min; 72°C， 1 min)x25個(gè)循環(huán)；72°C, lOmin。 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約lkb處有一條特異性的
擴(kuò)增條帶。
2、重組質(zhì)粒pFRl-1139和pFRl-152的構(gòu)建
用DNA回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與T載體pMD18-T (TaKaRa公司)進(jìn)行連接，經(jīng)過(guò)測(cè)序比對(duì)表明，所擴(kuò)增的片段確實(shí) 為含自身啟動(dòng)子的>r基因。將含有>r基因的T載體經(jīng)5amHI和 M"dIII酶切，回收1008 bp的々r片段，將此片段連接到經(jīng)萬(wàn)awHI 和歷'"din酶切的pIJ2925載體(Janssen G R, and Bibb M J. Derivatives of pUC18 that have 3g711 sites flanking a multiple cloning site and that retain ability to identify recombinant clones by visual screening of ^&c/zeWc/n'a co/z' colonies. Gene, 1993， 124:133—134 )上， 命名為pFRl-2925，酶切驗(yàn)證。然后將驗(yàn)證正確的pFRl-2925用Bg/II 和五coRI酶切，回收約1020 bp的^r片段。將此片段分別與經(jīng)5"mHI 和五coRI酶切的載體pKCl 139 (Bierman M， Logan R, O'Brien K," a/. Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Esc/zen'c/w'a co// to 5^e/ tom;^c&s1 spp. Gene， 1992， 116:43-49 )和經(jīng)同樣 酶切的載體pSET152(參考文獻(xiàn)同pKC1139)相連，連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn) 化大腸桿菌DH5(x的感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司)。從轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì) 粒進(jìn)行PCR和酶切驗(yàn)證，將正確的重組質(zhì)粒分別命名為pFRl-1139 和pFRl-152。 pFRl-1139為多拷貝的質(zhì)粒，pFRl-152為整合型質(zhì)粒， 它們都帶有^r基因及其自身啟動(dòng)子。pFRl-1139和pFRl-152的質(zhì) 粒圖譜如圖l所示。
二、含有^r基因及紅霉素抗性基因強(qiáng)啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒的構(gòu)建
1、^r結(jié)構(gòu)基因的擴(kuò)增
設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增位于阿維鏈霉菌染色體上含有核糖體結(jié)合 位點(diǎn)(ribosome binding site, RBS)的#r結(jié)構(gòu)基因序列，上游引物 Primer F4 (GA^04rC7lCCTACTCAAGACACGCAGGAG ，帶下劃線 堿基為限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn))位于#r起始密碼子上游20 bp
處，下游引物 Primer R4 (CCC^GC77lGTCATGCGCA TCGTACGTGG,帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶W/wdlll識(shí)別位點(diǎn)) 位于7 r終止密碼子下游120bp處，擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)為700 bp。
以阿維鏈霉菌野生型菌株ACTT31267的總DNA為模板、Primer F4和PrimerR4為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同本實(shí)施例中的 "一"。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，在700bp處有一條擴(kuò)增條帶。
2、重組質(zhì)粒pFR4-1139和pFR4-152的構(gòu)建
回收擴(kuò)增產(chǎn)物，將之與T載體pMD18-T (TaKaRa公司)進(jìn)行 連接，經(jīng)過(guò)測(cè)序比對(duì)表明，所擴(kuò)增的片段確實(shí)為不含啟動(dòng)子而含有 核糖體結(jié)合位點(diǎn)的戶r結(jié)構(gòu)基因。用Bg/II和W"dlII酶切含^r結(jié)構(gòu) 基因的T載體，回收700 bp的^r結(jié)構(gòu)基因片段，將此片段連接到 經(jīng)5awHI和W"dIII酶切的含有紅霉素抗性基因強(qiáng)啟動(dòng)子Ovw五，) 的pIJ117載體(將含有的Sg/n片段插入到pIJ2925的相應(yīng)酶 切位點(diǎn)上構(gòu)建而成)上，得重組質(zhì)粒pFR4-117,酶切鑒定。然后將正 確詢pFR4-117用Bg/II酶切，回收約1 kb的^7w￡*p + >r片段，將 此片段分別與經(jīng)BamHI酶切的載體pKC1139和經(jīng)同樣酶切的載體 pSET152相連，連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。從轉(zhuǎn)化子中提取 質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切驗(yàn)證，將正確的重組質(zhì)粒分別命名為 pFR4-1139和pFR4-152。 pFR4-1139為多拷貝的質(zhì)粒，pFR4-152為 整合型質(zhì)粒，這兩個(gè)質(zhì)粒中的#r結(jié)構(gòu)基因均置于紅霉素抗性基因強(qiáng) 啟動(dòng)子之下。pFR4-1139和pFR4-152的質(zhì)粒圖譜如圖2所 示。
實(shí)施例2、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
通過(guò)實(shí)施例1 一共構(gòu)建了四種々r基因的表達(dá)質(zhì)粒載體，分別為 pFRl-1139、 pFRl-152、 pFR4-1139和pFR4-152,作為對(duì)照的原始質(zhì) 粒為pKC1139和pSET152。現(xiàn)對(duì)這六種質(zhì)粒的特點(diǎn)作簡(jiǎn)要說(shuō)明(表 1)。
表l含有^r基因的重組質(zhì)粒及原始質(zhì)粒的特點(diǎn)_
質(zhì)粒 _ft^_
大腸桿菌鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，高拷貝 大腸桿菌鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，整合型 含有/w基因及其自身啟動(dòng)子的高拷貝質(zhì)粒 含有/w基因及其自身啟動(dòng)子的整合型質(zhì)粒 含有紅霉素抗性基因強(qiáng)啟動(dòng)子(em^》)及/at結(jié)構(gòu)基因的高
拷貝質(zhì)粒
含有紅霉素抗性基因強(qiáng)啟動(dòng)子(enw五V)及/〃結(jié)構(gòu)基因的整 _合型質(zhì)粒_
由于阿維鏈霉菌中存在很強(qiáng)的限制修飾作用，用提自 // DH5oc的質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化阿維鏈霉菌，轉(zhuǎn)化效率極低，有時(shí)甚至得不到 轉(zhuǎn)化子。而用來(lái)自沒有限制修飾作用的受體菌A //ET12567的質(zhì) 粒，其轉(zhuǎn)化效率明顯提高。因此，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒以及對(duì)照質(zhì) 粒先分別轉(zhuǎn)化到E ET12567 ( Kieser T, Bibb M J， Buttner M J，" a/. Practical 5Vr，o附少cas Genetics, 2000, Norwich: The John Innes Foundation.)中以獲得非甲基化的DNA,然后再用非甲基化的質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)化阿維鏈霉菌的原生質(zhì)體。
本例選用了三種不同的阿維鏈霉菌菌株做出發(fā)菌株 ATCC31267、 GB-165和76-02-e。 ATCC31267是阿維鏈霉菌野生型 菌株，產(chǎn)灰色孢子；GB-165 (蔡玉娟.產(chǎn)綠孢子阿維鏈霉菌遺傳改 造和發(fā)酵條件的研究.碩士學(xué)位論文，2006，北京中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)) 是本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)誘變和基因工程手段得到的只產(chǎn)阿維菌素B組分的阿 維鏈霉菌菌株，產(chǎn)綠色孢子；76-02-e(郭偉群.阿維菌素高產(chǎn)菌株的 選育和發(fā)酵條件的優(yōu)化.碩士學(xué)位論文，2007，北京中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)) 是本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)多輪誘變得到的一株阿維菌素高產(chǎn)菌株，僅產(chǎn)少量的 孢子。制備這三種阿維鏈霉菌菌株的原生質(zhì)體，用從五. //ET12567 中提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，涂于已吹干的不加抗生素的RM14平 板上，28。C培養(yǎng)16-20 h后，在平板上涂1 mL含1000嗎安普霉素 的水溶液，在28。C繼續(xù)培養(yǎng)7-10天，長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)化子。由于
pKC1139 pSET152 pFRl國(guó)1139 pFRl-152
pFR4-1139 pFR4-152
阿維鏈霉菌的轉(zhuǎn)化子在RM14再生培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢，故各挑取三個(gè) 轉(zhuǎn)化子，接種于含IO嗎/mL安普霉素的YMS平板上，28'C培養(yǎng)7 天恢復(fù)產(chǎn)孢。轉(zhuǎn)化子經(jīng)質(zhì)粒提取及PCR驗(yàn)證正確后，進(jìn)行下一步的 發(fā)酵研究。
本實(shí)施例中大腸桿菌的轉(zhuǎn)化、阿維鏈霉菌原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn) 化方法、RM14及YMS培養(yǎng)基的配制參見蔡玉娟的碩士論文(蔡玉 娟.產(chǎn)綠孢子阿維鏈霉菌遺傳改造和發(fā)酵條件的研究.碩士學(xué)位論 文，2006,北京中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué))。
實(shí)施例3、轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵研究
一、ATCC31267及其轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵研究
1. 阿維鏈霉菌的搖瓶發(fā)酵
種子培養(yǎng)基可溶性淀粉30 g，麥芽膏2g,大豆蛋白胨2g， CoCl2'6H20 5 mg，加蒸餾水至1 L，調(diào)pH至7.0-7.2。
發(fā)酵培養(yǎng)基可溶性淀粉50 g，酵母粉12 g, MgS04.7H20 0.5 g， K2HPO43H2O0.5g， KC14g; CaC03 2 g, CoCl2-6H20 5 mg,加 蒸餾水至1 L，調(diào)pH至7.0-7.2。
阿維鏈霉菌野生型菌株ATCC31267及其不同的轉(zhuǎn)化子在YMS 培養(yǎng)基上長(zhǎng)出豐富的孢子后接種于種子培養(yǎng)基(裝量為100 mL/500 mL三角瓶)中，28°C搖床培養(yǎng)24小時(shí)(轉(zhuǎn)速180 rpm,偏心距2.5 cm )。 按5 %接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(裝量為50 mL/300 mL三角瓶)中， 28。C培養(yǎng)10天(轉(zhuǎn)速250rpm,偏心距2.5cm),放瓶，用HPLC法 測(cè)定阿維菌素的發(fā)酵單位，結(jié)果如圖3所示。
2、 發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析
1) 樣品處理取1.0mL發(fā)酵液，加入4.0mL甲醇，浸泡30 分鐘以上，每隔10分鐘振蕩一次，4000 rpm離心10分鐘,取上清
液進(jìn)樣分析；
2) HPLC分析條件ds反相柱，柱長(zhǎng)150 mm，柱內(nèi)徑4.6mm，
柱溫40。C，流動(dòng)相為甲醇水(85:15),流速1.0mL/min，進(jìn)樣體積 10|iL,波長(zhǎng)為246 nm。
圖3的發(fā)酵結(jié)果表明，對(duì)照質(zhì)粒pKC1139和pSET152的轉(zhuǎn)化對(duì) 阿維菌素的產(chǎn)量影響不大，而含有^r表達(dá)載體的ATCC31267轉(zhuǎn)化 子的阿維菌素發(fā)酵單位與出發(fā)菌株相比均明顯增加，兩種含有高拷 貝重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子的阿維菌素發(fā)酵單位增加了 3-3.7倍，兩種含有整 合型重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子的阿維菌素發(fā)酵單位增加了 71%-86%。由此可 以確定基因在ATCC31267中的劑量效應(yīng)。含^r基因質(zhì)?？截悢?shù)
的增加導(dǎo)致^r表達(dá)量的增加，高拷貝的y^基因?qū)Π⒕S菌素合成的 促進(jìn)作用優(yōu)于低拷貝的>r基因。比較用于表達(dá)^r基因的兩種不同 啟動(dòng)子對(duì)阿維菌素產(chǎn)量的影響，可以看出，含有^r基因自身啟動(dòng)子 的兩種轉(zhuǎn)化子的阿維菌素發(fā)酵單位均高于含有紅霉素抗性基因強(qiáng)啟 動(dòng)子(e環(huán)五Y)的兩種轉(zhuǎn)化子，可能在表達(dá)時(shí)紅霉素抗性基因強(qiáng)啟 動(dòng)子(e，五^)并不優(yōu)于>r基因的自身啟動(dòng)子。 二、 GB-165及其轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵研究
搖瓶發(fā)酵及HPLC分析方法同本實(shí)施例中的"一"，不同之處在 于所用的發(fā)酵培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基G:可溶性淀粉95g,花生蛋白 粉25 g，棉籽蛋白7 g,麥芽糖3 g， MgS04.7H20 0.3 g， CoClr6H20 7.5 mg， (NH4)2S04 0.1 g， CaC031 g, K2HP04.3H20 0.3 g， ZnS04.7H20 2mg，加蒸餾水至1L,調(diào)pH至7.0-7.2。
從圖4的發(fā)酵結(jié)果可以看出，^r基因在GB-165中的過(guò)表達(dá)同 樣可以促進(jìn)阿維菌素的合成，而且高拷貝的y r基因?qū)Π⒕S菌素合成 的促進(jìn)作用優(yōu)于低拷貝的>r基因。
同樣，含有,r基因自身啟動(dòng)子的兩種轉(zhuǎn)化子的阿維菌素發(fā)酵單 位均略高于含有紅霉素抗性基因強(qiáng)啟動(dòng)子(wm五^)的兩種轉(zhuǎn)化子， 再次表明紅霉素抗性基因強(qiáng)啟動(dòng)子(^附￡*; )在表達(dá)>r時(shí)并不優(yōu)于 戶r基因的自身啟動(dòng)子。
三、76-02-e及其轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵研究
搖瓶發(fā)酵及HPLC分析方法同本實(shí)施例中的"一"，不同之處在 于76-02-e的孢子不豐富，種子培養(yǎng)時(shí)間為40-46小時(shí)，所用的發(fā)酵 培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基E:玉米淀粉120 g，花生餅粉26 g,豆餅粉2 g,酵母粉8g， (NH4)2S04 0.25 g, CoCl2.6H20 25 mg, MnS04'4H20 30 mg,加自來(lái)水至1L， pH自然。
圖5的發(fā)酵結(jié)果表明，在高產(chǎn)菌株76-02-e中表達(dá)^r基因仍然 可以促進(jìn)阿維菌素的合成，同樣是高拷貝的^r基因?qū)股睾铣傻?促進(jìn)作用優(yōu)于低拷貝的>r基因。
與ATCC31267和GB-165轉(zhuǎn)化子不同的是，含紅霉素抗性基因 強(qiáng)啟動(dòng)子的76-02-e轉(zhuǎn)化子中阿維菌素的產(chǎn)量略高于含>r 基因自身啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化子，可能是由于76-02-e在々r基因表達(dá)調(diào)控 上與ATCC31267和GB-165有所不同。
實(shí)施例4、工程菌株的穩(wěn)定性考察
將所構(gòu)建的戶r基因過(guò)表達(dá)的工程菌株在YMS斜面上連續(xù)轉(zhuǎn)接 五次，發(fā)現(xiàn)該菌株與出發(fā)菌株在形態(tài)特征和培養(yǎng)特征上相同，生長(zhǎng) 狀態(tài)良好，性狀穩(wěn)定。經(jīng)轉(zhuǎn)接五次后的工程菌株再進(jìn)行搖瓶發(fā)酵， HPLC檢驗(yàn)阿維菌素產(chǎn)量均未發(fā)生明顯變化，說(shuō)明構(gòu)建的工程菌是 穩(wěn)定的。
實(shí)施例5、 frr基因過(guò)表達(dá)對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響
本實(shí)施例比較了 frr基因過(guò)表達(dá)菌株ATCC31267(pFRl-1139 )和 出發(fā)菌株ATCC31267在搖瓶發(fā)酵過(guò)程中阿維菌素產(chǎn)量和菌體干重 的變化情況。
搖瓶發(fā)酵及阿維菌素的HPLC分析方法同實(shí)施例3中的"一"， 不同之處在于選用可溶性的發(fā)酵培養(yǎng)基II發(fā)酵培養(yǎng)菌體，這是由于 阿維鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基中含有不可溶成分，不利于菌體干重的準(zhǔn)確 測(cè)定。不同時(shí)間取樣，分別測(cè)定阿維菌素的發(fā)酵單位(圖6)及菌體干重(圖7)。
發(fā)酵培養(yǎng)基II:可溶性淀粉70 g，酵母酶解粉16 g， MgS04.7H20 0.5 g, K2HP043H20 0.5 g, KC1 4 g, CoCl2'6H20 5 mg， 加蒸餾水至1 L，調(diào)pH至7.0-7.2。
菌體干重的測(cè)定將50ml發(fā)酵液過(guò)濾，菌體以蒸餾水洗凈， 烘干至恒重，稱菌體干重。
由圖6和圖7可知，ATCC31267(pFRl-1139)的阿維菌素產(chǎn)量和 菌體干重一直高于ATCC31267,表明過(guò)表達(dá)>r基因能促進(jìn)菌體生 長(zhǎng)?？梢?，T^基因過(guò)表達(dá)菌株中阿維菌素產(chǎn)量的提高原因有一部分 歸功于發(fā)酵液中菌體生物量的提高，還有一部分原因可能是戶r基因 的過(guò)量表達(dá)提高了阿維菌素生物合成基因簇中正調(diào)控基因rn^ 以及 阿維菌素生物合成相關(guān)酶類的表達(dá)量，但這一推測(cè)有待于進(jìn)一步通 過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
序列說(shuō)明
SEQ ID No.l&2為擴(kuò)增/廳基因及其啟動(dòng)子的引物Fl和Rl, SEQ ID No.3&4為擴(kuò)增基因的引物F4和R4。
<110> 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120> —種阿維鏈霉菌基因工程及其應(yīng)用
<130> KHP08112921.4
<160> 4
< 170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA <213>人工序列
<400> 1
ccgacatgac cgcgatcac 19
<210> 2
<211> 28
<212> DNA <213>人工序列
<400> 2
cggaattcgt catgcgcatc gtacgtgg 28
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<211> 29
<212> DNA <213>人工序列<400> 3
gaagatctcc tactcaagac acgcaggag 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA <213>人工序列
<400> 4
cccaagcttg tcatgcgcat cgtacgtgg 29
權(quán)利要求
1、一種基因工程菌，其是將阿維鏈霉菌中編碼核糖體循環(huán)因子的frr基因通過(guò)表達(dá)載體引入阿維鏈霉菌中得到的核糖體循環(huán)因子過(guò)表達(dá)的重組菌。
2、 如權(quán)利要求l所述的工程菌，其特征在于，所述表達(dá)載體為 整合型載體或高拷貝質(zhì)粒載體。
3、 如權(quán)利要求l所述的工程菌，其特征在于，所述表達(dá)載體中 ，基因的啟動(dòng)子為其自身啟動(dòng)子或者為啟動(dòng)子^^￡*/ 。
4、 如權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)所述的工程菌，其特征在于，所述表 達(dá)載體的出發(fā)載體為pKC1139、 pKC505、 pIJ653、 pIJ8154、 pSET152、 pIJ8600或pIJ8660。
5、 如權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的工程菌，其特征在于，所述表 達(dá)載體為pFRl-1139、 pFR4-1139、 pFRl-152或pFR4-152。
6、 權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的工程菌在制備阿維菌素中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能提高阿維菌素產(chǎn)量的基因工程菌，其是將阿維鏈霉菌中編碼核糖體循環(huán)因子的frr基因通過(guò)表達(dá)載體引入阿維鏈霉菌中得到的核糖體循環(huán)因子過(guò)表達(dá)的重組菌。本發(fā)明的基因工程菌可直接用于阿維菌素的發(fā)酵生產(chǎn)，提高阿維菌素的發(fā)酵單位，降低生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101386829SQ20081022453
公開日2009年3月18日 申請(qǐng)日期2008年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月20日
發(fā)明者淵 宋, 瑩 文, 李麗莉, 李季倫, 芝 陳 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)