專利名稱：：一種融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。技術(shù)背景尿酸氧化酶(UricaseorUrateOxidase,UOXEC1.7.3.3)是嘌呤代謝途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶，能催化尿酸形成尿囊素。尿酸和尿囊素是不同生物嘌呤代謝的最終產(chǎn)物，兩者的溶解性差別很大，尿酸在體內(nèi)的溶解度很低，約為llmg/dl水，而尿囊素為它的13.5倍，約為147mg/dl水。尿酸在體內(nèi)的累積可引起痛風(fēng)和尿酸鹽腎病(Duk-HeeKang,TakahikoNakagawa,LiliFengetal.ARoleforUricAcidintheProgressionofRenalDisease[J〗.《/^w.S"oc.A^p/zra/.,2002,13:2888-2897)。有研究表明，尿酸在體內(nèi)的積累與心、腎等組織器官的功能障礙有關(guān)，用尿酸氧化酶抑制劑溫和誘導(dǎo)的高尿酸小鼠模型，出現(xiàn)了腎動(dòng)脈病、腎損傷及高血壓等癥狀，去除抑制劑后癥狀的緩解和消失證明了尿酸是這些疾病的原因所在。研究表明，動(dòng)脈疾病可能與尿酸促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖有關(guān)。尿酸氧化酶基因(uox)是一個(gè)古老的基因，存在子原核生物和真核生物中(XiangweiWu，ChengChiLee,DonnaM.Muzfty,EtAl.Urateoxidase:Primarystructureandevolutionaryimplications[J]./Voc.Ato/Jeaaf,Sc/.，1989,86:9412-9416)。來源于不同生物的U0X基因同顏性不高，例如，枯草芽孢桿菌(5^///^犯^7/力和大豆的1](之間的序列同源性為25%，黃曲霉^avM力和大豆的UOX之間的序列同源性為29%，B.subtilis和A/7rn^s的UOX之間的序列同源性為36%，但是構(gòu)成活性位點(diǎn)的氨基酸殘基序列在所有的物種中都是保守的。UOX活性的喪失在許多親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種屬中發(fā)現(xiàn)，如鳥類、陸棲爬行動(dòng)物、圓口類、除雙翅目以外的昆蟲和環(huán)蟲類中。在人類和鳥類中缺少有活性的U0X，因而以尿酸作為嘌呤代謝的最終產(chǎn)物排出體外，導(dǎo)致了高尿酸癥和與之相關(guān)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(MasakoOda，YokoSatta,OsamuTakenaka,etal丄ossofUrateOxidaseActivityinHoinoidsanditsEvolutionaryImplications[J].Mo/.￡vo/.，2002,19(5):640-653)，人血清中尿酸的濃度比其它哺乳動(dòng)物高五十倍。敲除uox基因的大鼠引發(fā)了嚴(yán)重的的祖先到現(xiàn)代人的UOX基因都存在一個(gè)單一無義突變，使得蛋白的翻譯過程提前終止，導(dǎo)致了uox活性的喪失。在靈長類動(dòng)物中，原猴亞目和老世界猴表現(xiàn)出了相對于大鼠和兔子中等水平的UOX活性；與之相比，人屬和一些新世界猴則沒有表現(xiàn)出任何可以檢測到的UOX活性。人的UOX基因與老世界猴的UOX基因的同源性為96%，說明在進(jìn)化中存在一個(gè)突發(fā)事件，導(dǎo)致人的UOX基因沉默；新世界猴與人的親緣關(guān)系比它與老世界猴的要近，因此新世界猴的UOX的失活不太可能與人的uox的突變一樣。人體內(nèi)的高尿酸可能由幾個(gè)原因造成，隨著年齡的增大，人體功能衰退，導(dǎo)致排尿酸尿能力減弱，尿酸在腎小管及集尿管內(nèi)沉積，引起了痛風(fēng)。此外，對于腫瘤患者而言，治療過程中導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞的大量死亡，使得體內(nèi)的尿酸濃度急劇升高，即所謂的腫瘤溶解綜合征(TumorLysisSydrome，TLS)。TLS最常出現(xiàn)于兒童急性白血病及淋巴瘤，成人腫瘤患者偶爾也會出現(xiàn)，治療過程中伴隨著骨髓和淋巴的快速增生，通常會導(dǎo)致腎衰竭和其它器官的損傷。臨床上用于治療高尿酸癥的藥物主要包括別嘌呤醇、鹵化尿液、水合或透析等。通過抑制黃嘌呤氧化酶的活性，別嘌呤醇減少了尿酸的生成，但增加了尿酸前體(黃嘌呤和次黃嘌呤)對腎臟的負(fù)擔(dān)，而黃嘌呤在尿中的溶解度比尿酸更低，因此別嘌呤醇治療高尿酸癥常常導(dǎo)致黃嘌呤腎病和結(jié)石，而且體內(nèi)原有的尿酸不受別嘌呤醇的影響，只能靠病人自身排出。鹵化和水合只能部分增加尿酸的排泄量，都不是理想的方法，可能需要不時(shí)透析。UOX通過酶的直接催化將尿酸氧化成尿囊素，而后者在尿液中的溶解量相對于前者成倍增加，應(yīng)用UOX在臨床上治療TLS的高危病人被證明是肪止發(fā)生TLS的有效方法(Annemans,K.Moeremans，M.Lamotte,etal.Pan-Europeanmulticentreeconomicevaluationofrecombinanturateoxidase(rasburicase)inpreventionandtreatmentofhyperuricaemiaandtumourlysissyndromein.ha6matologicalcancerpatients[J〗.CareOmcer,2003，11:249—257;StantonC.Goldmaft,JohnS.Holcenberg,JerryZ.Finklestein,etal.Arandomizedcomparisonbetweenrasburicaseandallopurinolinchildrenwithlymphomaorleukemiaathighriskfortumorlysis[J].5/ood,2001,97(10):2998-3003)。在隨機(jī)抽取的TLS高危病人中，分別用別嘌呤醇、重組U0X、鹵化和水合進(jìn)行治療，結(jié)果表明，重組UOX可以在四個(gè)小時(shí)之內(nèi)使血漿中的尿酸水平顯著下降2.6倍，并且保持在8mg/L以下；而用別嘌呤醇治療的病人在96小時(shí)之后尿酸水平會達(dá)到重組uox治療的水平，但產(chǎn)生的尿酸前體-黃嘌呤和次黃嘌呤加重了腎臟的負(fù)擔(dān)，有時(shí)需要透析除去。實(shí)驗(yàn)表明，重組uox可以有效地防止高白血球的兒童急性白血病患者在治療過程中出現(xiàn)TLS癥狀。大量的數(shù)據(jù)表明，在防止和治療在腫瘤患者化療過程中出現(xiàn)的TLS癥狀方面，重組U0X比別嘌呤醇更為有效和安全。注射尿酸氧化酶至少可以短暫減輕高尿酸血癥及高尿酸尿。因?yàn)槟蛩嵫趸甘侨梭w外源性蛋白，重復(fù)注射重組UOX會產(chǎn)生抗UOX的抗體，抑制了UOX的活性?？梢酝ㄟ^應(yīng)用可溶性聚合物屏蔽酶分子的表面，降低抗原性和免疫原性，并延長酶分子的半衰期(Davis,Y.K.Park,A.Abochowski,F.F.Davis,Hypouricaemiceffectofpolyethyleneglycolmodifiedurateoxidase,Lancet2(1981)281—283.中國專利CN1896231A)。目前PEG修飾的U0X在國外已進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)。人血清白蛋白(HSA)是一種可溶性單體蛋白質(zhì)，構(gòu)成血液中蛋白總量的一半。白蛋白作為一種基本載體，攜帶并傳遞脂肪酸、類固醇和激素分子等，其穩(wěn)定的惰性性質(zhì)是維持血壓的一個(gè)重要因素。血清白蛋白是一種球狀、非糖基化的、分子量為65kD的血清蛋白質(zhì)。人血清白蛋白基因位于第4號染色體上，有16961個(gè)堿基對，分為15個(gè)間隔區(qū)，經(jīng)RNA加工拼接后形成的niRNA可編碼一個(gè)具有585個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，這一蛋白再經(jīng)過高爾基體的轉(zhuǎn)化加工，去除引導(dǎo)多肽而分泌到細(xì)胞外。血清白蛋白有35個(gè)半胱氨酸殘基，在血液中是一個(gè)有17個(gè)二硫鍵的單體。利用微生物表達(dá)重組白蛋白的方法已在專利文獻(xiàn)中公開(EP330451;EP361991;CN1119352C)。白蛋白是血液中的主要成分，在人體內(nèi)的含量為40克/升血液，半衰期壽命為14-20天。利用基因工程技術(shù)，將人血清白蛋白與人生長激素、干擾素或白介素-2等生物活性因子構(gòu)建融合蛋白并在酵母中進(jìn)行表達(dá)，已在中國專利(CN1515591A;CN1269840C)中公開，通過與白蛋白融合可以提高生物活性因子在血液中的半衰期。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的融合蛋白包括尿酸氧化酶和白蛋白，所述尿酸氧化酶可以直接連接在所述白蛋白的N末端或C末端形成融合蛋白，也可以通過一個(gè)連接肽來連接所述白蛋白和所述尿酸氧化酶以形成融合蛋白。所述連接肽的長度為2-100個(gè)氨基酸，優(yōu)選為5-50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選為5-20個(gè)氨基酸。連接肽的長度可短至所述白蛋白大分子對所述尿酸氧化酶形成的位阻保持最小，如(G4S)h。連接肽有利于尿酸氧化酶與其底物尿酸的結(jié)合，但連接肽的加入可能使融合蛋白在作為藥物使用時(shí)產(chǎn)生額外的免疫原性，最優(yōu)選的是沒有連接肽。上述融合蛋白既可以是分泌型表達(dá)蛋白，也可以是細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白，具體可為分泌型表達(dá)蛋白。所述尿酸氧化酶為非人源的尿酸氧化酶，如來源于微生物(如黃曲霉(Aspergillusflavus)、假絲酵母(Candidautilis)、枯草桿菌(Bacillussp.)等)、植物(如大豆(Glycinemax)根瘤等)、無脊柱動(dòng)物(如果蠅(Drosophilamelanogaster))或有脊柱動(dòng)物(如豬、牛、羊、狒狒)等的尿酸氧化酶，或其突變體。所述白蛋白為與人血清白蛋白具有90%以上同源性的蛋白，具體可為人血清白蛋白。所述融合蛋白具體可為下述l)、2)、3)或4)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)；3)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；4)將序列表中序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3)衍生的蛋白質(zhì)。上述2)或4)的融合蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述2)的融合蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列1的自5'端第13-2703位堿基所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對的錯(cuò)義突變得到。上述4)的融合蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列3的自5'端第10-2772位堿基所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對的錯(cuò)義突變得到。上述融合蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述融合蛋白的編碼基因具體可為如下l)一6)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列1自5'末端第13-2703位脫氧核糖核苷酸；2)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼所述融合蛋白的DNA分子；3)與l)的基因具有90%以上的同源性，且編碼所述融合蛋白的DNA分子；4)其編碼序列是序列表中序列3自5'末端第10-2772位脫氧核糖核苷酸；5)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列3限定的DNA序列雜交且編碼所述融合蛋白的DNA分子；6)與4)的基因具有90%以上的同源性，且編碼所述融合蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在6xSSC，0.5。/。SDS的溶液中，在65。C下雜交,然后用2xSSC,0.1%SDS和lxSSC,0.1%SDS各洗膜一次。擴(kuò)增上述融合蛋白編碼基因全長或任一片段的引物對，含有上述融合蛋白編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體，具體可為pPIC質(zhì)粒。所述宿主包括但不局限于哺乳動(dòng)物(如人、猴、鼠、兔等)、魚、昆蟲、植物、酵母、真菌和細(xì)菌等，優(yōu)選為酵母屬，包括但不局限于釀酒酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、漢遜酵母(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、念珠菌屬(Candida)、孢園酵母屬(Tarulaspora)和裂殖酵母屬等；更優(yōu)選地為畢赤酵母屬巴斯德菌種(Pichiapastoris)。本發(fā)明將非人源的尿酸氧化酶和人血清白蛋白融合制備成融合蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該融合蛋白和非人源的尿酸氧化酶具有相似的體內(nèi)和體外生物活性，且免疫原性極大地降低，可以解決異源尿酸氧化酶在用于人體治療過程中所產(chǎn)生的免疫原性問題，可用于制備治療高尿酸血癥和痛風(fēng)癥的藥物。本發(fā)明的融合蛋白具有以下優(yōu)點(diǎn)1)對人體而言免疫原性極低；2)可以延長尿酸氧化酶在人體內(nèi)的半衰期；3)可以重復(fù)給藥，提高疾病的治療效果；4)保持尿酸氧化酶原有的分解尿酸的活性；5)減少潛在的尿酸氧化酶使用時(shí)伴隨的副作用或毒性，主要是減少抗體的產(chǎn)生和減少過敏反應(yīng)。圖1為含有融合蛋白編碼基因的重組載體的構(gòu)建過程圖2為融合蛋白HSA-UO在酵母中的表達(dá)和純化結(jié)果圖3為融合蛋白HSA-U0和rU0在大鼠體內(nèi)的免疫原性測定結(jié)果具體實(shí)施方式實(shí)施例l、白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白的制備1、人血清白蛋白編碼基因的獲得以人胎肝cDNA文庫(購自Clontech公司，產(chǎn)品編號637230)為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增不含信號肽編碼序列的人血清白蛋白基因(HSA)，具體引物如下-HSA5:5'-TCGCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGG-3'(Xho1)，HSA3:5'-TTGGATCCACCTCCACCGGAACCTCCACCTCCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTG-3'(BamHI)。PCR擴(kuò)增體系:人胎肝cDNAl，L，HSA5引物和HSA3引物各0.5叱，dNTP2叱，KODDNAPolymerase0.l叱，10XKODbuffer2叱，MgS042叱，ddH2035叱，總體積50叱。PCR反應(yīng)條件為94°C30s，53°C30s，72°C2min，共30個(gè)循環(huán)。對PC財(cái)廣增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，獲得約1700bp的條帶；純化并回收該條帶進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，所獲得的條帶的核苷酸序列即為人血清白蛋白的編碼基因，將其命名為^W。以人胎肝cDNA文庫(購自Clontech公司，產(chǎn)品編號637230)為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增含信號肽的人血清白蛋白基因(SHSA)，具體引物如下SHSA5:5'-GACGGATCCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCC-3'(BamHI)，SHSA3:5'-TTGAATTCACCTCCACCGGAACCTCCACCTCCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTG-3'(EcoRI)。PC財(cái)廣增體系:人胎肝cDNA1.0叱，SHSA5引物和SHSA3引物各0.5叱，dNTP2nL，KODDNAPolymerase0.1ML，10XKODbuffer2nL，MgS042叱，ddH2035叱，總體積50叱。PCR反應(yīng)條件為94°C30s，53°C30s，72。C2min，共30個(gè)循環(huán)。對PC財(cái)廣增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，獲得約1800bp的條帶；純化并回收該條帶進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，所獲得的條帶的核苷酸序列即為含有信號肽的人血清白蛋白的編碼基因，將其命名為5F6^。2、尿酸氧化酶編碼基因的獲得以含有黃曲霉尿酸氧化酶基因的質(zhì)粒pET-UO(吳偉立，方宏清等.尿酸氧化酶的表達(dá)純化及活性形式鑒定。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2005，29(2):124-126.)為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增UOX基因，具體引物如下AFU5:5'-CGTAGATCTATGTCAGCAGTAAAAGCAGCAC-3'(BglII)AFU3:5'-TGGAATTCTTACAATTTAGACTTCTGAGAGGAAC-3，(EcoRI)。PCR擴(kuò)增體系pET-UO質(zhì)粒l.0叱，AFU5引物和AFU3引物各0.5叱，dNTP2叱，K0DDNAPolymerase0.l叱，10XK0Dbuffer2叱，MgS042nL，ddH2035叱，總體積50叱。PCR反應(yīng)條件為94°C30s,53°C30s，72°Clmin，共30個(gè)循環(huán)。對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，獲得約900bp的條帶；純化并回收該條帶進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，所獲得的條帶的核苷酸序列即為黃曲霉尿酸氧化酶的編碼基因，將其命名為力/^m;為了提高在酵母中的表達(dá)水平，根據(jù)酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)優(yōu)化了尿酸氧化酶基因〃M，并委托上海生工公司進(jìn)行人工合成，將合成的尿酸氧化酶基因W24插入到pMD18載體上，將得到的重組載體命名為pMD18-U0A。3、重組載體pPIC9-HSAL2U0的構(gòu)建(^K^M/^m之間有兩個(gè)GGGGS)將上述步驟l獲得的^W經(jīng)XhoI和BamHI雙酶切后插入到經(jīng)同樣酶切的pIB2載體(IrinaBSears,JamseO'Connor,OliviaWRossanese,BenjaminSGlick.AversatilesetofvectorsforconstitutiveandregulatedgeneexpressioninPichiapastoris.Yeast,14(8)783-790，1998)中，將測序鑒定正確的重組載體命名為pIB2-HSA。pIB2載體的多克隆位點(diǎn)依次有Xho1、BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)。將上述步驟2獲得的JH/flT基因經(jīng)BglII和EcoRI雙酶切后插入到經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切的上述構(gòu)建的pIB2-HSA載體中，將測序鑒定正確的重組載體命名為pIB2-HSAL2U0。pIB2-HSAL2U0經(jīng)XhoI和EcoRI雙酶切后，得到不帶信號肽但帶有連接肽的人血清白蛋白和尿酸氧化酶的融合基因，將其命名為MHft^K^iY/6的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示，其編碼的融合蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。將上述獲得的融合基因^K4Z2〃瀬入到經(jīng)XhoI和EcoRI雙酶切的pPIC9載體(購自Invitrogen公司，目錄號K1710-01)中，將獲得的重組載體命名為pPIC9-HSAL2U0。重組載體pPIC9-HSAL2U0的具體構(gòu)建過程如圖l所示。4、重組載體pPIC9-SHSAL2U0A的構(gòu)建將上述步驟l獲得的6F54經(jīng)BaraHI和EcoRI雙酶切后分別插入到經(jīng)同樣酶切的pIB2載體(IrinaBSears,JamseO'Connor,OliviaWRossanese,BenjaminSGlick.AversatilesetofvectorsforconstitutiveandregulatedgeneexpressioninPichiapastoris.Yeast,14(8)783-790,1998)中，將經(jīng)測序鑒定正確的重組載體命名為pIB2-SHSA。將上述步驟2獲得的重組載體pMD18-U0A用Bgl—n和EcoRI雙酶切后，回收約900bp的W^基因片段，插入到經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切的上述步驟3獲得的pIB2-HSA載體中，將經(jīng)測序鑒定正確的重組載體命名為pIB2-HSAL2U0A。pIB2-HSAL2U0A經(jīng)Ndel(位于AK4基因中)和EcoR工雙酶切后回收約1700bp的目的片段，插入到經(jīng)NdeI(位于#5>1基因中)禾口EcoRI雙酶切的pIB2-SHSA載體中，將經(jīng)測序鑒定正確的重組載體命名為pIB2-SHSAL2U0A。pIB2-SHSAL2U0A經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切，回收約2800bp的小片段，得到帶有信號肽并帶有連接肽的人血清白蛋白和尿酸氧化酶的融合基因，將其命名為■MK4Z^/fl4，SW5^Z^/創(chuàng)的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3所示，其編碼的融合蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4所示。將該基因插入到經(jīng)經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切的pPIC9載體(購自Invitrogen公司，目錄號K1710-01)中，將經(jīng)測序鑒定正確的重組載體命名為pPIC9-SHSAL2U0A。重組載體pPIC9-SHSAL2U0A的具體構(gòu)建過程如圖1所示。5、將重組質(zhì)粒pPIC9-HSAL2U0和pPIC9-SHSAL2U0A分別轉(zhuǎn)入畢赤酵母中表達(dá)相應(yīng)的融合蛋白將上述步驟3和步驟4獲得的重組質(zhì)粒pPIC9-HSAL2U0和pPIC9-SHSAL2U0A用SalI進(jìn)行線性化后分別電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母菌GS115中，將獲得的重組菌分別涂布在MD培養(yǎng)基(1.34%質(zhì)量百分含量酵母基本氮源、4X10—5%質(zhì)量百分含量生物素、1%質(zhì)量百分含量葡萄糖和2%質(zhì)量百分含量瓊脂粉)平板上，3(TC培養(yǎng)2天以上。對長出的單克隆先進(jìn)行PCR鑒定，然后再將所有的PCR陽性克隆按照Invitrogen公司操作手冊中的要求進(jìn)行表達(dá)篩選，獲得高表達(dá)的菌株。具體篩選方法如下取3ml40ixmol/L的尿酸溶液，分別加入100u1上述含有重組質(zhì)粒pPIC9-HSAL2U0或pPIC9-SHSAL2U0A的重組菌的培養(yǎng)上清液，室溫或37。C放置5min后，用0.3ml質(zhì)量百分含量為20。/o的KOH終止反應(yīng)，測定293nm處吸光值的變化。吸光值變化越大，表明重組菌表達(dá)的融合蛋白中的尿酸氧化酶活性越高，相應(yīng)融合蛋白的表達(dá)水平也越高。6、融合蛋白HSAUOA的表達(dá)和純化將上述步驟5篩選得到的高表達(dá)HSAUOA融合蛋白的重組菌接種到裝有200mLBMG培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行增殖，將得到的發(fā)酵液作為種子液；將上述種子液再轉(zhuǎn)接至裝有3L基礎(chǔ)培養(yǎng)基(40g/L甘油，18g/LK2S04，15g/LMgS04.7H20，4.13g/LKOH，0.9g/LCaS04.2H20，13.3mL/LH線)的5L發(fā)酵罐中，30°CpH5.0的條件下進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵20小時(shí)后第I相結(jié)束，按0.8ml/min的流速流加質(zhì)量百分含量為5%的甘油100ml。2小時(shí)后發(fā)酵第II相結(jié)束，調(diào)培養(yǎng)溫度至2(TC，調(diào)pH至6.5，再在培養(yǎng)基中加入3g大豆蛋白胨，按0.2ml/min的流速流加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，90小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵，離心收集上清。在上述上清液中加入硫酸銨至上清液中硫酸銨的摩爾濃度為l.2M，用25raM磷酸緩沖液(PH7.0)+1.2M硫酸銨組成的混合液預(yù)平衡Phenyl柱，上樣，然后用含有l(wèi).2M至0M硫酸銨的25mM磷酸緩沖液(PH7.0)梯度洗脫，收集活性峰，濃縮至10-15ml。再用25mM磷酸緩沖液(PH7.0)+0.15M氯化鈉組成的混合液預(yù)平衡Superdex200柱，將上述濃縮液上樣，收集活性峰。將收集到的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖2所示。圖2中，Marker為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為上述發(fā)酵液上清的SDS-PAGE結(jié)果，2、3為疏水層析收集到的活性峰的SDS-PAGE結(jié)果，4為凝膠過濾收集到的活性峰的SDS-PAGE結(jié)果。實(shí)施例2、融合蛋白在大鼠體內(nèi)的免疫原性的測定將雄性SD大鼠分為兩組，分別為HSAUOA融合蛋白組和rUO蛋白組(rUO蛋白的制備過程參見吳偉立，方宏清等.尿酸氧化酶的表達(dá)純化及活性形式鑒定。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2005，29(2):124-126.)，每組五只大鼠，分別靜脈注射上述實(shí)施例1制備的HSAUOA融合蛋白和按照上述文獻(xiàn)方法制備的rUO蛋白。HSAUOA融合蛋白組的給藥劑量為0.9mg/kg體重，rU0組的給藥劑量為0.3mg/kg體重。每周給藥一次，連續(xù)給藥四周。分別于第一次給藥前和第一次給藥后14、21、28和35天采血，分離血清，放于4t:冰箱待測，并連續(xù)觀察2個(gè)月。以rUO包被酶聯(lián)板，采用ELISA法測定抗體滴度，實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，大鼠靜脈連續(xù)注射HSAUOA融合蛋白及rUO蛋白后，抗體滴度隨時(shí)間變化的結(jié)果如圖3和表1所示。從表l中可以看出，靜脈注射HSAUOA融合蛋白后，大鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體水平明顯低于靜脈注射rUO后大鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體水平(P〈0.05)，并且連續(xù)靜脈注射rU0后，大鼠體內(nèi)抗體水平呈不斷升高趨勢，而連續(xù)靜脈注射HSAUOA融合蛋白后，大鼠體內(nèi)的抗體水平未見明顯升高。從圖3中可以看出，注射上述實(shí)施例1制備的HSAUOA融合蛋白后第14d、21d、28d和35d，大鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體滴度分別為20、120、100和40;注射rUO蛋白后第14d、21d、28d和35d，大鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體滴度分別為416、1000、9600和32000。_表1大鼠連續(xù)靜脈注射HSAUOA及rUO后的抗體滴度_<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><160>4〈210>1〈211〉2706<212〉DNA<213>人工序列<220><223><400〉1ctcgagaaaagagatgcacaca卿gtgaggttgctcatcggtttELa^gatttggg卿360gaa^atttca^a^gccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagtgtccattt120gaagatcatgtaaaattagtgaatg犯gtaactgaatttgca^aacatgtgttgctgat180gagtX3gctg3a^attgtg3caaatcacttcataccctttttggagacaaattatgcaca240gttgcaactcttcgtgaaacctatggtga3atggctgactgctgtgc^aacaagaacct300aatgcttcttgcaa^ca^aagatgacaaccc^acctcccccgattggtg360卿CC8gELggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgaca3tttttg3a^420aaatacttatatgaa3ttgccagaagacatccttacttttatgccccggaactccttttc480tttgctaaaaggtataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgataaagctgcc540tgcctgttgccaaagctcgatgaacttcggg^tg鄉(xiāng)gg3aggcttcgtctgccaaacag600agactcaagtgtgccagtctctttcaaagc660gctcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcag^gtttcca^gttagtgaca720gatcttaccaaagtccacacgg犯tgctgccatggagatctgcttgaatgtgctgatgac780agggcggaccttgccaagtatatctgtgaacgatctccagtaaactgaag840gaatgctgtgaaaaacctctgttgg3a^3tcccactgcattgccgaagtggaaaatgat■g卿tgcctgctgacttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgc960a^aactatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaatatgcaaga1020aggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgccaagacatatgaaaccact1080ctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctcatgaatgctatgccaaagtgttcgatgaa1140tttaaacctcttgtggaagagcctcagaataaaattgtgagctttttgag1200cagcttggagagtacaaattccagaatgcgctattagttcgttacaccaagaaagtaccc1260caagtgtcaactccaactcttgt卿ggtctaggaaaagtgggcsgca^1320tgttgtaaacatcctg肌gc犯daa^atgccctgtgcagaagactatctatccgtggtc1380ctgaaccagttatgtgtgttgcatgeLgaaaacgccagtaagtgacagagtcaccaaatgc1440tgcacagaatccttggtgaacaggcgaccatgcttttcagctctggaagtcga^tga^ica1500tacgttcccaaELgagttta^tgctg￡La^ca<ttcaccttcca^tgcagatatatgcacactt1560tctg卿3ggcccaaggcaaaagtgctgcagctgcaagtctc3gcagt犯gacgagaaga_g卿ttg卿33ga^cEicca_tccatcctggattgtctgccatccgcgacagatatcaagtggcttcctgcgacgtcgatggtgcctaagtgaagataacacgccagcagcgscctgagctcagtcggaccttgtaaagagacaaatcaaaagagcaaggctgacgaaagctgccttaa_gcsgcacgccggtgtccacctcttacactttacatcacgcacacacttaccgctggacgcg鄉(xiāng)3ga3cgtctctgtcgtgacg叫taccacttggcatcgatgctacgtgccagcgttg3tCg3g3CggC3CMgggccaacggtctca^gaaa^caaactgaaagctta^ggagaccaggcttaggactacggcaaggacggtgtaccaaggccgsccgccaagcagC3ttg3g33gccggatggacgcggaatgtgcggcctgacccaccacacttgtggaag組ctgggccactgcaggccacttgtcgagtaccctcca^aacgatcaagtgtactgcacttggttatggatgtgctttgccgggtggaggttgacaatgtccgagatgaccgaacagcgtcaaaccccgttatacaaccacaattgacggcacaggtggacggtgctg33geiaaggagacctttcagtggacgctcgcgaggtcgttgccta8ccggca￡ig3accgtcggccttgagcttgtatttcgcagcagg鄉(xiāng)gtaaccggtggagggcgtctacaatctgtgtgctttgtcgcaacctcctcccgatccatgccgc3gCC3C3CCCtggtcgaggggcaccaactcgggaccgtattccaggaggttcactctgaatggc卿gcaacgccgaggtgttcctctcagaaacac^gttttgtagagaaaacttgtttggatctatgggttcacaagtctggagggtcgactccattgctgttcggctcacgtcaactcactccttcC犯gggC3tCgcagttctggcctgagcaccccgctcgcacgacttttgctaatcctggcgtttcgaaatccttcgctcctga_3gtcta_aa16201680174018001860192019802040210021602220228023402400246025202580264027002706〈210〉2〈211〉897<212〉PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉<400>2AspAlaHisLysGluAsnPheLys20GinCysProPhe35PheAlaLysThr50SerLeuHisThrSer5AlaGluCysLeuGluValAlaLeuVslLeuAspHisVal40ValAlaAsp55PheGlyAspHisArgPheLysAspLeuGlyGlu1015lieAlaPheAlaGinTyrLeuGin2530LysLeuValAsnGluValThrGlu45GluSerAlaGluAsnCysAspLys60LysLeuCysThrValAlaThrLeu65ArgGluGluArgProArgAspAsn130ArgHis145TyrLysCysLeuSerAlaArgAla210LysAla225ValHisArgAlaSerLysCyslie290LeuAla305GluAlaArgHisTyrGlu70ThrTyrGlyGlu85AsnGluCysPhe100LeuValArgPro115GluGluThrPheProTyrPheTyr150AlaAlaPheThr165LeuProLysLeu180LysGinArgLeu195PheLysAlaTrpGluPheAlaGlu230ThrGluCysCys245AspLeuAlaLys260LeuLysGluCys275AlaGluValGluAlaAspPheVal310LysAspValPhe325ProAspTyrSer340ThrThrLeuGlu355MetLeuGluLeu135AlaGluAspLysAla215ValHis丁yrCysAsn295GluLeuValLysAlaGinVal120LysProCysGluCys200ValSerGlylieGlu280AspSerGlyValCys360AspHis105AspLysGluCysLeu185AlaAlaLysAspCys265LysGluLysMetLeu345CysCys9075CysAspAlaAspLysAsnValMetCysThr125TyrLeuTyrGlu140LeuLeuPhePhe155GinAlaAlaAsp170ArgAspGluGlySerLeuGinLys205ArgLeuSerGin220LeuValThrAsp235LeuLeuGluCys250GluAsnGinAspProLeuLeuGlu285MetProAlaAsp300AspValCysLys315PheLeuTyrGlu330LeuLeuArgLeuAlaAlaAlaAsp365GinPro110AlalieAlaLysLys190PheArgLeuAlaSer270LysLeuAsnTyrAla350Pro80GluPro95AsnLeuPheHisAlaArgLysArg160AlaAla175AlaSerGlyGluPheProThrLys240AspAsp255lieSerSerHisProSerTyrAla320AlaArg335LysThrHisGluCysTyrAlaLys370GinAsnLeulie385TyrLysPheGinGinValSerThr420ValGlySerLys435AlaGluAspTyr450GluLysThrPro465LeuValAsnArgTyrValProLys500lieCysThrLeu515LeuValGluLeu530LysAlaValMet545AlaAspAspLysAlaAlaSerGin580GlyGlySerMet595ValArgValTyr610ValTyrGluMet625SerTyrThrLysLysAsnThrlieValLysAsn405ProCysLeuValArg485GluSerValAspGlu565AlaSerLysThrAla645TyrPheGin390AlaThrCysSerSer470ProPheGluLysAsp550ThrAlaAlaValVal630AsplieAsp375AsnLeuLeuLysVal455AspCysAsnLysHis535PheCysLeuValHis615CysAsnThrGluCysLeuValHis440ValArgPheAlaGlu520LysAlaPheGlyLys600LysValSerAlaPheGluValGlu425ProLeuValSerGlu505ArgProAlaAlaLeu585AlaAspLeuValLysLysLeuArg410ValGluAsnThrAla490ThrGinLysPheGlu570GlyAlaGluLeulie650GinProPhe395TyrSerAlaGinLys475LeuPhelieAlaVal555GluGlyArgLysGlu635ValAsnLeu380GluThrArgLysLeu460CysGluThrLysThr540GluGlyGlyTyrThr620GlyAlaProValGinLysAsnArg445CysCysValPheLys525LysLysLysGlyGly605GlyGluThrValGluGluProLeuLysLeu430MetValThrAspHis510GinGluCysLysSer590LysVallieAspThrGlyGlu400ValPro415GlyLysProCysLeuHisGluSer480GluThr495AlaAspThrAlaGinLeuCysLys560LeuVal575GlyGlyAspAsnGinThrGluThr640Serlie655ProProGluLeuHislie690MetAsp705GluGluAsplieSerGinThrTrp770LysGin785AspAlaGluAspGinlieProAsn850GinAsn865AsnGlyLeuPhe675HislieLysLysPhe755AspPheThrAsnLeu835LysThrLeu660GlyAlaAspArgSer740TrpArgSerTrpSer820AlaHisGlylieSerAlaGlyAsn725SerGlylieGlyAla805AlaArgTyrLysLys885lieHisLys710ValLeuPheLeuLeu790ThrSerGinPheAsn870CysLeuVal695ProGinSerLeuSer775GinAlaValGinGlu855AlaThr665GlyThrHisPhe680AsnlieValCysHisProHisSer715ValAspValVal730GlyLeuThrVal745ArgAspGluTyr760ThrAspValAspGluValArgSer795ArgGluValThr810GinAlaThrMet825LeulieGluThr840lieAspLeuSerGluValPheAla875ValGlyArgSer890lieHis700PheGluLeuThrAla780HisLeuTyrValTrp860ProSerGlu685ArglieGlyLysThr765ThrValLysLysGlu845HisGinGin670LysTrpArgLysSer750LeuTrpProThrMet830TyrLysSerLysTyrAsnThrArgAspSer720Glylie735ThrAsnLysGluGinTrpLysPhe■PheAla815AlaGluSerLeuGlyLeuAspPro880SerLys895<210>3<211>2781<212>DNA〈213>人工序列〈220〉<223〉<400〉3ggatccaccatgaagtgggtaacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttat60tccaggggtgtgtttcgtcgagatgcacacaagagtgaggttgctcatcggtttaiaagat120ttgggagaag犯aatttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcag180tgtccatttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgcaaaaacatgt240gttgctgatgagtcagctgaaaattgtgacaaatcacttcataccctttttggagacaaa300ttatgcacagttgcaactcttcgtgaaacctatggtgaaatggctgactgctgtgcaaaa360caagaacctgagagaaatgaatgcttcttgcaacacaaagatgacaacccaaacctcccc420cgattggtgagaccagaggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgacaatgaagagaca480tttttgaaaaaatacttatatgaaattgccagaagacatccttacttttatgccccggaa540ctccttttctttgctaaaaggtataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgat600aaagctgcctgcctgttgccaaagctcgatgaacttcgggatgaagggaaggcttcgtct660gccaaacagagactcaagtgtgccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaagca720tgggcagtagctcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcagaagtttccaag780t"tagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatggagatctgcttgaatgt840gctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgtgaaaatcaagattcgatctccagt900aaactgaaggaatgctgtgeiaaaacctctgttggaaaaatcccactgcattgccgaagtg%0gaaaatgatgagatgcctgctgacttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaag1020gatgtttgcaaaaactatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaa1080tatgcaagaaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgccaagacatat1140gaaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctcatgaatgctatgccaaagtg1200ttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagcctcagaatttaatcaaacaaaattgtgag1260ctttttgagcagcttggagagtacaaattccagaatgcgctattagttcgttacaccaag1320aaagtaccccaagtgtcaactccaactcttgtagaggtctcaagaaacctaggaaaagtg1380ggcagc^atgttgtaa^catcctga^gcaaaaagaatgccctgtgc3gaagactatcta1440tccgtggtcctgaaccagttatgtgtgttgcatgagaaaacgccagtaagtgacagagtc1500accaaatgctgcacagaatccttggtgaacaggcgaccatgcttttcagctctggaagtc1560gatgaaacatacgttcccaaagagtttaatgctgaaacattcaccttccatgcagatata1620tgcacactttctgagaaggagagacaaatcaagaaacaaactgcacttgttgagcttgtg1680^acac犯gcccaaggc3acaa^g3gca^ctg3￡i￡Lgctgttatgg￡itgatttcgcsgct1740tttgtagagaagtgctgcaaggctgacgataaggagacctgctttgccgaggagggtaaa1800aaacttgttgctgcaagtcaagctgccttaggcttaggaggtggaggttccggtggaggt1860ggatxtatgtccgctgttaaggctgctagatacggtaaggacaacgttagagtttacaag1920gttcacaaggacgagaagaccggtgttcaaaccgtttacgagatgaccgtttgtgttttg1980ttggagggtgagatcgagacctcctacaccaaggctgacaactccgttatcgttgctacc2040gactccatcaagaacaccatctacatcaccgctaagcaaaacccagttaccccaccagag2100ttgttcggttccatcttgggtacccacttcatcgagaagtacaaccacatccacgctgct2160cacgttaacatcgtttgtcacagatggaccagaatggacatcgacggtaagccacaccca2220cactccttcatcagagactccgaggagaagagaaacgttcaagttgacgttgttgagggt2280aagggtatcgacatcaagtcctccttgtccggtttgaccgttttgaagtccaccaactcc2340caattctggggtttcttgagagacgagtacaccaccttgaaggagacctgggacagaatc2400ttgtccaccgacgttgacgctacctggcaatggaagcaattctccggtttgcaagaggtt2460agatcccacgttccaaagttcgacgctacctgggctaccgctagagaggttaccttgaag2520accttcgctgaggacaactccgcttccgttcaagctaccatgtacaagatggctgagcaa2580atcttggctagacaacaattgatcgagaccgttgaatactccttgccaaacaagcactac2640ttcgagatcgacttgtcctggcacaagggtttgcaaaacaccggtaagaacgctgaggtt2700ttcgctccacaatccgacccaaacggtttgatcaagtgtaccgttggtagatcctcccaa2760aagtccaagttgtaagaattc2781<210>4〈211〉921〈212〉PRT<213〉人工序列<220><223>〈400〉4MetLysTrpValThrPhelieSerLeuLeuPheLeuPheSerSerAla151015TyrSerArgGlyValPheArgArgAspAlaHisLysSerGluValAla202530HisArgPheLysAspLeuGlyGluGluAsnPheLysAlaLeuValLeu354045lieAlaPheAlaGinTyrLeuGinGinCysProPheGluAspHisVal505560LysLeuValAsnGluValThrGluPheAlaLysThrCysValAlaAsp65707580GluSerAlaGluAsnCysAspLysSerLeuHisThrLeuPheGlyAsp859095LysLeuCysThrValAlaThrLeuArgGluThrTyrGlyGluMetAla100105110AspCysCysAlaLysGinGluProGluArgAsnGlirCysPheLeuGin115120125HisLysAspAspAsnProAsnLeuProArgLeuValArgProGluVal130135140AspValMetCysThrAlaPheHisAspAsnGluGluThrPheLeuLys145150155160LysTyrLeuTyrGlulieAlaArgArgHisProTyrPheTyrAlaPro165170175GluLeuLeuPhePheAlaLysArgTyrLysAlaAlaPheThrGluCys180185190CysGinAlaAlaAspLysAlaAlaCysLeuLeuProLysLeuAspGlu195200205LeuArgAspGluGlyLysAlaSerSerAlaLysGinArgLeuLysCys210215220AlaSerLeuGinLysPheGlyGluArgAlaPheLysAlaTrpAlaVal225230235240AlaArgLeuSerGinArgPheProLysAlaGluPheAlaGluValSer245250255LysLeuValThrAspLeuThrLysValHisThrGluCysCysHisGly260265270AspLeuLeuGluCysAlaAspAspArgAlaAspLeuAlaLysTyrlie275280285CysGluAsnGinAspSerlieSerSerLysLeuLysGluCysCysGlu290295300LysProLeuLeuGluLysSerHisCyslieAlaGluValGluAsnAsp305310315320GluMetProAlaAspLeuProSerLeuAlaAlaAspPheValGluSer325330335LysAspValCysLysAsnTyrAlaGluAlaLysAspValPheLeuGly340345350MetPheLeuTyrGluTyrAlaArgArgHisProAspTyrSerValVal355360365LeuLeuLeuArgLeuAlaLysThrTyrGluThrThrLeuGluLysCys370375380CysAlaAlaAlaAspProHisGluCysTyrAlaLysValPheAspGlu385390395400PheLysProLeuValGluGluProGinAsnLeulieLysGinAsnCys405410415GluLeuPheGluGinLeuGlyGluTyrLysPheGinAsnAlaLeuLeu420425430ValArgTyrThrLysLysValProGinValSerThrProThrLeuVal435440445GluValSerArgAsnLeuGlyLysValGlySerLysCysCysLysHis450455460ProGluAlaLysArgMetProCysAlaGluAspTyrLeuSerValVal465470475480LeuAsnGinLeuCysValLeuHisGluLysThrProValSerAspArg485490495ValThrLysCysCysThrGluSerLeuValAsnArgArgProCysPhe500505510SerAlaLeuGluValAspGluThrTyrValProLysGluPheAsnAla515520525GluThrPheThrPheHisAlaAsplieCysThrlxuSerGluLysGlu530535540ArgGinlieLysLysGinThrAlaLeuValGluLeuValLysHisLys545550555560ProLysAlaThrLysGluGinLeuLysAlaValMetAspAspPheAla565570575AlaPheValGluLysCysCysLysAlaAspAspLysGluThrCysPhe580585590AlaGluGluGlyLysLysLeuValAlaAlaSerGinAlaAlaLeuGly595600605LeuGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerMetSerAlaValLys610615620AlaAlaArgTyrGlyLysAspAsnValArgValTyrLysValHisLys625630635640AspGluLysThrGlyValGinThrValTyrGluMetThrValCysVal645650655LeuLeuGluGlyGlulieGluThrSerTyrThrLysAlaAspAsnSer660665670VallieValAlaThrAspSerlieLysAsnThrlieTyrlieThrAla675680685LysGinAsnProValThrProProGluLeuPheGlySerlieLeuGly690695700ThrHisPhelieGluLysTyrAsnHislieHisAlaAlaHisValAsn705710715720lieValCysHisArgTrpThrArgMetAsplieAspGlyLysProHis725730735ProHisSerPhelieArgAspSerGluGluLysArgAsnValGinVal740745750AspValValGluGlyLysGlylieAsplieLysSerSerLeuSerGly755760765LeuThrValLeuLysSerThrAsnSer'GinPheTrpGlyPheLeuArg770775780AspGluTyrThrThrLeuLysGluThrTrpAspArglieLeuSerThr785790795800AspValAspAlaThrTrpGinTrpLysGinPheSerGlyLeuGinGlu805810815ValArgSerHisValProLysPheAspAlaThrTrpAlaThrAlaArg820825830GluValThrLeuLysThrPheAlaGluAspAsnSerAlaSerValGin835840845AlaThrMetTyrLysMetAlaGluGinlieLeuAlaArgGinGinLeu850855■lieGluThrValGluTyrSerLeuProAsnLysHisTyrPheGlulie865870875880AspLeuSerTrpHisLysGlyLeuGinAsnThrGlyLysAsnAlaGlu885890895ValPheAlaProGinSerAspProAsnGlyLeulieLysCysThrVal■905910GlyArgSerSerGinLysSerLysLeu915920權(quán)利要求1、一種融合蛋白，包括尿酸氧化酶和白蛋白，所述尿酸氧化酶為非人源的尿酸氧化酶，優(yōu)選為來源于微生物的尿酸氧化酶；所述白蛋白為與人血清白蛋白具有90％以上同源性的蛋白，優(yōu)選為人血清白蛋白。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白還包括連接肽。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白為下述1)、2)、3)或4)的蛋白質(zhì):1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)；3)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；4)將序列表中序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3)衍生的蛋白質(zhì)。4、權(quán)利要求l-3中任一所述融合蛋白的編碼基因。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦耹)一6)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列1自5'末端第13-2703位脫氧核糖核苷酸；2)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼所述融合蛋白的DNA分子；3)與l)的基因具有90%以上的同源性，且編碼所述融合蛋白的DNA分子；4)其編碼序列是序列表中序列3自5'末端第10-2772位脫氧核糖核苷酸；5)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列3限定的DNA序列雜交且編碼所述融合蛋白的DNA分子；6)與4)的基因具有90%以上的同源性，且編碼所述融合蛋白的DNA分子。6、含有權(quán)利要求4或5所述基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征在于所述出發(fā)細(xì)胞為哺乳動(dòng)物、魚、昆蟲、植物或微生物細(xì)胞，優(yōu)選為微生物細(xì)胞。8、根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌，其特征在于所述出發(fā)菌為釀酒酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、漢遜酵母(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、念珠菌屬(Candida)、孢園酵母屬(Tarulaspora)或裂殖酵母屬的菌株；優(yōu)選為畢赤酵母屬巴斯德菌種(Pichiapastoris)。9、擴(kuò)增權(quán)利要求4或5所述基因的全長或任一片段的引物對。10、權(quán)利要求l一3所述的融合蛋白或權(quán)利要求4或5所述基因在制備治療和/或預(yù)防高尿酸血癥和痛風(fēng)癥藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的融合蛋白，包括尿酸氧化酶和白蛋白，所述尿酸氧化酶為非人源的尿酸氧化酶，優(yōu)選為來源于微生物的尿酸氧化酶；所述白蛋白為與人血清白蛋白具有90％以上同源性的蛋白，優(yōu)選為人血清白蛋白。本發(fā)明的融合蛋白具有以下優(yōu)點(diǎn)1)對人體而言免疫原性極低；2)可以延長尿酸氧化酶在人體內(nèi)的半衰期；3)可以重復(fù)給藥，提高疾病的治療效果；4)保持尿酸氧化酶原有的分解尿酸的活性；5)減少潛在的尿酸氧化酶使用時(shí)伴隨的副作用或毒性，主要是減少抗體的產(chǎn)生和減少過敏反應(yīng)。文檔編號C12N1/15GK101402688SQ20081022701公開日2009年4月8日申請日期2008年11月18日優(yōu)先權(quán)日2008年11月18日發(fā)明者戴紅梅,方宏清,李招發(fā),李樹龍,陳惠鵬申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所