專利名稱：：一種用于制備飼料的菌劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于制備飼料的菌劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：苜蓿青貯料是一種優(yōu)良的飼草，其具有適口性好、消化率高、保存期長(zhǎng)、調(diào)制方便、便于機(jī)械操作等特點(diǎn)。苜蓿青貯料作為一種高蛋白飼草，用于奶牛飼養(yǎng)，可以使奶牛的產(chǎn)奶量得到提高，比其它飼草青貯具有更好的效果。但是，苜蓿青貯料容易腐敗，限制了其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。導(dǎo)致腐敗的主要原因是苜蓿植株體內(nèi)蛋白質(zhì)含量高，緩沖能高，糖分含量低，有大量空氣存在于苜蓿中空的莖組織。防止苜蓿青貯料腐敗的方法就是向其中加入添加劑。我國(guó)傳統(tǒng)的青貯添加劑主要有甲酸、甲醛等，但這些添加劑具有腐蝕性，對(duì)家畜采食具有安全隱患，而且其還有添加量較大、成本高和操作不便等缺陷。目前普遍使用的青貯添加劑大多為純化的單一菌劑或簡(jiǎn)單混合菌劑，以簡(jiǎn)單混合菌劑居多。純化的單一菌劑是根據(jù)所需的功能要求從自然界中分離，純化后，在嚴(yán)格無菌條件下經(jīng)過純培養(yǎng)發(fā)酵，吸附于特定載體的菌劑，菌株多為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，已有研究結(jié)果證實(shí)植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)單菌劑效果并不理想；簡(jiǎn)單混合菌劑是將兩種或者兩種以上的乳酸菌按一定比例混合后，吸附于特定載體。但是這兩類菌劑的青貯效果并不很好，可能是以下原因?qū)е聦?duì)于單一菌劑，其中的單一菌失去了與其它菌共存的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致其產(chǎn)生乳酸的能力大大降低，單一菌對(duì)生長(zhǎng)條件的適應(yīng)范圍窄，對(duì)發(fā)酵條件要求高，發(fā)酵成本昂貴，單一菌孤立生長(zhǎng)，容易受到其它菌的污染和抑制，使得在青貯飼料中難以成為控制發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)菌；對(duì)于簡(jiǎn)單混合菌劑，其只是人為幾種菌的簡(jiǎn)單混合，各種菌間沒有協(xié)同作用，所以作用效果不明顯。苜蓿青貯能否成功的關(guān)鍵是乳酸菌能否迅速成為青貯飼料中的優(yōu)勢(shì)菌，如果自然發(fā)酵條件控制不好，不能使乳酸菌迅速生長(zhǎng)，其他微生物占優(yōu)勢(shì)，則使乳酸菌受到抑制，則苜蓿青貯失敗。因此，向青貯飼料中接種乳酸菌，增加乳酸菌的數(shù)量，促使產(chǎn)生大量乳酸，迅速降低飼料的PH值，是一種非常有效的手段。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于制備飼料的菌劑。本發(fā)明所提供的用于制備飼料的菌劑，其活性成份為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、韓國(guó)泡菜乳桿菌(Xactobacilluskimchii)、香腸乳桿菌(Xactobacillusfarciminis)禾口戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)。其中，所述植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、韓國(guó)泡菜乳桿菌(Lactobacilluskimchii)、香腸乳桿菌(Lactobacillusfarciminis)禾口戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)的集落形成單位數(shù)目比為50-55:15—20:15—20:5-20。所述植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、韓國(guó)泡菜乳桿菌(Lactobacilluskimchii)、香腸乳桿菌(Lactobacillusfarciminis)禾口戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)的集落形成單位數(shù)目比具體可以為55:20:15:10。所述植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)具體可為植物乳桿菌Lactobacillusplantarum)JCM1149T、所述韓國(guó)泡菜乳桿菌(Xactobacilluskimchii)具體可為韓國(guó)泡菜乳桿菌(Lactobacilluskimchii)KCTC8903PT、所述香腸乳桿菌(Xactobacillusfarciminis)具體可為香腸乳桿菌(Xactobacillusfarciminis)DSM202847、所述戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)具體可為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)DSM20314T。本發(fā)明的菌劑可以為液體型制劑，向本發(fā)明菌劑的活性成份的培養(yǎng)物中添加甘油和EDTA，即得到液體型菌劑；其中，所述活性成分、甘油和EDTA的配比為1X10"CFU:(1-5)g甘油:(l-2)gEDTA，優(yōu)選為1X10"CFU:2g甘油:lgEDTA。本發(fā)明的菌劑可以為固體型制劑，向本發(fā)明菌劑的活性成份的培養(yǎng)物中添加吸附載體，即得到固體型菌劑；吸附載體可以為麥飯石和/或秸稈粉；所述菌劑與所述吸附載體的配比為ixio6cFU:(i-io)g吸附載體，優(yōu)選為ixio6cfu:5g吸附載體。上述菌劑在制備青貯飼料中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，所述飼料具體可以為苜蓿。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照相比，使用本發(fā)明菌劑時(shí)，青貯料中的pH值下降快，在20h小時(shí)內(nèi)，pH值就已經(jīng)下降到4.0;與未接種發(fā)酵菌劑的青貯料相比，接種本發(fā)明菌劑的青貯飼料比未接種發(fā)酵菌劑的青貯料pH值降低了6.36%±0.58，乳酸含量提高了170.59%±4.27，干物質(zhì)含量提高了0.56%±0.28，蛋白損失率減少了81.15%士1.48，減少了青貯期間因雜菌的生長(zhǎng)所造成的干物質(zhì)損失，降低了氨態(tài)氮的產(chǎn)生，改善了青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)；分子生態(tài)學(xué)檢測(cè)手段-變性梯度凝膠電泳法(DGGE)結(jié)果表明，使用本發(fā)明菌劑時(shí)，接種菌很快占主要優(yōu)勢(shì)，成為其中的優(yōu)勢(shì)菌。本發(fā)明菌劑具有生態(tài)安全，應(yīng)用簡(jiǎn)易，成本低廉，青貯效果明顯等優(yōu)點(diǎn)；其中的菌的活性保持時(shí)間長(zhǎng)，活性穩(wěn)定，對(duì)動(dòng)物安全；其中的吸附載體，與乳酸菌復(fù)合菌系具有高度的親和力，對(duì)動(dòng)物安全，使菌劑保質(zhì)期長(zhǎng)，運(yùn)輸和使用方便，干燥、冷凍處理都不會(huì)降低活菌數(shù)量和活性。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中以植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)(購(gòu)于日本產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究所專利微生物保藏中心，菌種保存號(hào)為JCM1149T)、韓國(guó)泡菜乳桿菌(Lactobacilluskimchii)(購(gòu)于韓國(guó)生命工學(xué)研究所基因銀行，菌種保存號(hào)為KCTC8903PT)、香腸乳桿菌(Lactobacillusfarciminis)(購(gòu)于德國(guó)微生物菌種保藏中心，菌種保存號(hào)為DSM20284T)、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)(購(gòu)于德國(guó)微生物菌種保藏中心，菌種保存號(hào)為DSM203141)為制備菌劑的菌源。實(shí)施例1、菌劑的制備1、乳酸菌復(fù)合菌系培養(yǎng)物的制備MRS培養(yǎng)基的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>將植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)接種于MRS培養(yǎng)基中，在30°C，靜止培養(yǎng)ld，收集所有的發(fā)酵液作為培養(yǎng)物A;將韓國(guó)泡菜乳桿菌(Lactobacilluskimchii)接種于MRS培養(yǎng)基中，在30°C，靜止培養(yǎng)ld，收集所有的發(fā)酵液作為培養(yǎng)物B;將香腸乳桿菌(Lactobacillusfarciminis)接種于MRS培養(yǎng)基中，在30°C，靜止培養(yǎng)ld，收集所有的發(fā)酵液作為培養(yǎng)物C;將戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)接種于MRS培養(yǎng)基中，在30°C，靜止培養(yǎng)ld，收集所有的發(fā)酵液作為培養(yǎng)物D;將如上四種培養(yǎng)物A、B、C和D混合均勻，得到乳酸菌復(fù)合菌系培養(yǎng)物，其中四種菌的集落形成單位數(shù)目cfu比例為L(zhǎng)actobacillusplantarum:Lactobacilluskimchii:Lactobacillusfarciminis:Lactobacilluspentosus=55:20:15:10。2、固體劑型菌劑的制備以麥飯石、秸稈粉為吸附載體，將上述乳酸菌復(fù)合菌系培養(yǎng)物與吸附載體混勻，使菌吸附于吸附載體上，得到固體劑型的乳酸菌復(fù)合菌劑，其中菌系與載體的配比為lXl()6cfu/5g吸附載體。3、菌劑的效果檢測(cè)將步驟2得到的菌劑按1X109cfu活性成份菌/kg苜蓿的比例添加到苜蓿中，混勻，進(jìn)行青貯，青貯發(fā)酵條件為常溫厭氧發(fā)酵(將發(fā)酵裝置壓實(shí)密封)；期間在第l天、第2天、第5天、第10天、第20天、第30天檢測(cè)一次苜蓿青貯中的pH值，30天后，對(duì)苜蓿青貯進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。以未添加任何菌劑的苜蓿作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值，結(jié)果如下(1)乳酸含量及pH值的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與對(duì)照相比，使用本發(fā)明菌劑時(shí)，苜蓿青貯中的pH值下降快，在第1天，pH值就已經(jīng)下降到4.0;與對(duì)照相比，接種本發(fā)明菌劑的苜蓿發(fā)酵料比未接種發(fā)酵菌劑的苜蓿青貯料pH值降低6.36%±0.58，乳酸含量提高了170.59%±4.27;分子生態(tài)學(xué)檢測(cè)手段-變性梯度凝膠電泳法(DGGE)結(jié)果表明，使用本發(fā)明菌劑時(shí)，接種菌很快占主要優(yōu)勢(shì)，成為其中的優(yōu)勢(shì)菌。(2)苜蓿青貯的品質(zhì)檢測(cè)檢測(cè)指標(biāo)如下粗蛋白含量、干物質(zhì)含量、氨態(tài)氮含量；各指標(biāo)的檢測(cè)方法如下粗蛋白含量用凱氏定氮法測(cè)定，干物質(zhì)含量的測(cè)定方法是將苜蓿放入100度烘箱放置24h后稱重，氨態(tài)氮用蒸餾法測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照相比，使用本發(fā)明菌劑時(shí)，得到的苜蓿中干物質(zhì)含量提高了0.56%±0.28，蛋白損失率減少了81.15%±1.48。實(shí)施例2、菌劑的制備1、乳酸菌復(fù)合菌系培養(yǎng)物的制備方法如實(shí)施例1中所述，分別得到植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的培養(yǎng)物A，(Lactobacilluskimchii)的培養(yǎng)物B，(Lactobacillusfarciminis)的培養(yǎng)物C，Lactobacilluspentosus)的培養(yǎng)物D。將如上四種培養(yǎng)物A、B、C和D混合均勻，得到乳酸菌復(fù)合菌系培養(yǎng)物，其中四種菌的cfu比例為L(zhǎng)actobacillusplantarum:Lactobacilluskimchii:Lactobacillusfarciminis:Lactobacilluspentosus=50:15:15:20。2、液體劑型菌劑的制備液體載體的制備將甘油、EDTA混勻制成液體吸附載體；將上述液體吸附載體與步驟1得到的復(fù)合菌系培養(yǎng)物混勻，其中，活性成份菌與甘油和EDTA的配比是1X10"CFU:2g甘油:lgEDTA，得到液體劑型的乳酸菌復(fù)合菌劑。3、菌劑的效果檢測(cè)將步驟2得到的菌劑按1X109cfu活性成分菌/kg苜蓿的比例添加到苜蓿中，混勻，進(jìn)行青貯，青貯發(fā)酵條件為常溫厭氧發(fā)酵30d;期間在第1天、第2天、第5天、第10天、第20天、第30天檢測(cè)一次苜蓿青貯中的pH值，30天后，對(duì)苜蓿青貯進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。以未添加任何菌劑的苜蓿作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果如下(1)乳酸含量及pH值的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照相比，使用本發(fā)明菌劑時(shí)，苜蓿青貯中的pH值下降快，在第l天，pH值就已經(jīng)下降到4.1;發(fā)酵30天后，與對(duì)照相比，接種本發(fā)明菌劑的苜蓿發(fā)酵料比未接種任何發(fā)酵菌劑的苜蓿青貯料pH值降低6.1%±0.58，乳酸含量提高了169.0%±4.27，分子生態(tài)學(xué)檢測(cè)手段一變性梯度凝膠電泳法(DGGE)結(jié)果表明，使用本發(fā)明菌劑時(shí)，接種菌很快占主要優(yōu)勢(shì)，成為其中的優(yōu)勢(shì)菌。[OOM](2)苜蓿青貯的品質(zhì)檢測(cè)檢測(cè)指標(biāo)如下粗蛋白含量、干物質(zhì)含量、氨態(tài)氮含量；各指標(biāo)的檢測(cè)方法如下粗蛋白含量用凱氏定氮法測(cè)定，干物質(zhì)含量的測(cè)定方法是將苜蓿放入100度烘箱放置24h后稱重，氨態(tài)氮用蒸餾法測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照相比，使用本發(fā)明菌劑時(shí)，得到的苜蓿中干物質(zhì)含量提高了0.50%±0.28，蛋白損失率減少了80.0%±1.48。實(shí)施例3、菌劑的制備1、乳酸菌復(fù)合菌系培養(yǎng)物的制備方法如實(shí)施例1中所述，分別得到植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的培養(yǎng)物A，(Lactobacilluskimchii)的培養(yǎng)物B，(Lactobacillusfarciminis)的培養(yǎng)物C，Lactobacilluspentosus)的培養(yǎng)物D。將如上四種培養(yǎng)物A、B、C和D混合均勻，得到乳酸菌復(fù)合菌系培養(yǎng)物，其中四種菌的cfu比例為L(zhǎng)actobacillusplantarum:Lactobacilluskimchii:Lactobacillusfarciminis:Lactobacilluspentosus=55:20:20:10。2、固體劑型菌劑的制備以麥飯石、秸稈粉為吸附載體，將上述乳酸菌復(fù)合菌系培養(yǎng)物與吸附載體混勻，使菌吸附于載體上，得到固體劑型的乳酸菌復(fù)合菌劑，其中活性成份菌與吸附載體的配比為lXl()6cfu/g吸附載體。3、菌劑的效果檢測(cè)將步驟2得到的菌劑按1X109cfu活性成分菌/kg苜蓿的比例添加到苜蓿中，混勻，進(jìn)行青貯，青貯發(fā)酵條件為常溫厭氧發(fā)酵30d;期間在第1天、第2天、第5天、第10天、第20天、第30天檢測(cè)一次苜蓿青貯中的pH值，30天后，對(duì)苜蓿青貯進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。以未添加任何菌劑的苜蓿作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果如下(1)乳酸含量及pH值的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與對(duì)照相比，使用本發(fā)明菌劑時(shí)，苜蓿青貯中的pH值下降快，在第1天，pH值就已經(jīng)下降到4.2;與對(duì)照相比，接種本發(fā)明菌劑的發(fā)酵料比未接種發(fā)酵菌劑的苜蓿青貯料pH值降低5.9%±0.58，乳酸含量提高了168.0%±4.27;分子生態(tài)學(xué)檢測(cè)手段DGGE結(jié)果表明，使用本發(fā)明菌劑時(shí)，接種菌很快占主要優(yōu)勢(shì)，成為其中的優(yōu)勢(shì)菌。(2)苜蓿青貯的品質(zhì)檢測(cè)檢測(cè)指標(biāo)如下粗蛋白含量、干物質(zhì)含量、氨態(tài)氮含量；各指標(biāo)的檢測(cè)方法如下粗蛋白含量用凱氏定氮法測(cè)定，干物質(zhì)含量的測(cè)定方法是將苜蓿放入100度烘箱放置24h后稱重，氨態(tài)氮用蒸餾法測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照相比，使用本發(fā)明菌劑時(shí)，得到的苜蓿中干物質(zhì)含量提高了0.48%±0.28，蛋白損失率減少了79.0%±1.48。權(quán)利要求一種用于制備飼料的菌劑，其活性成份為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、韓國(guó)泡菜乳桿菌(Lactobacilluskimchii)、香腸乳桿菌(Lactobacillusfarciminis)和戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌齊U，其特征在于所述植物乳桿菌(Xactobacillusplantarum)、韓國(guó)泡菜乳桿菌(Xactobacilluskimchii)、香腸乳桿菌(Xactobacillusfarciminis)禾口戊糖乳桿菌(Xactobacilluspentosus)的集落形成單位數(shù)目比為50-55:15-20:15-20:5-20。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的菌齊U，其特征在于所述植物乳桿菌(Xactobacillusplantarum)、韓國(guó)泡菜乳桿菌(Xactobacilluskimchii)、香腸乳桿菌(Xactobacillusfarciminis)禾口戊糖乳桿菌(Xactobacilluspentosus)的集落形成單位數(shù)目比為55:20:15:io。4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的菌劑，其特征在于所述植物乳桿菌(Lactobacilluspiantarum)為植物乳桿菌(Lactobacilluspiantarum)JCM11497、所述韓國(guó)泡菜乳桿菌(Lactobacilluskimchii)為韓國(guó)泡菜乳桿菌(Lactobacilluskimchii)KCTC8903pT、所述香腸乳桿菌(Xactobacillusfarciminis)為香腸乳桿菌(Xactobaciliusfarciminis)DSM202847、所述戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)DSM20314T。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的菌劑，其特征在于所述菌劑中包括甘油和EDTA。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的菌劑，其特征在于所述活性成分、甘油和EDTA的配比為1X10"CFU:(1-5)g甘油(l-2)gEDTA，優(yōu)選為1X10"CFU:2g甘油lgEDTA。7.根據(jù)權(quán)利要求l-4中任一所述的菌劑，其特征在于所述菌劑中包括吸附載體；所述吸附載體為麥飯石和/或秸稈粉。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的菌劑，其特征在于所述菌劑與所述吸附載體的配比為ixio6cfu:(i-io)g吸附載體，優(yōu)選為ixio6cfu:5g吸附載體。9.權(quán)利要求1-8中任一所述菌劑在制備青貯飼料中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述飼料為苜蓿。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于制備飼料的菌劑及其應(yīng)用。該菌劑的活性成份為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、韓國(guó)泡菜乳桿菌(Lactobacilluskimchii)、香腸乳桿菌(Lactobacillusfarciminis)和戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)。本發(fā)明菌劑中的乳酸菌復(fù)合菌系中的四種菌間有高度的協(xié)同作用，能在未經(jīng)滅菌的天然原料中快速繁殖、定殖而占據(jù)優(yōu)勢(shì)，有效控制青貯料內(nèi)微生物區(qū)系，迅速產(chǎn)生大量乳酸，降低飼料的pH值到4.0左右，最大限度地減少青貯期間因雜菌的生長(zhǎng)所造成的干物質(zhì)損失和飼料品質(zhì)下降，降低了氨態(tài)氮的產(chǎn)生，改善了青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。與對(duì)照相比，用本發(fā)明菌劑作為添加劑的苜蓿青貯中乳酸生成量及生成速度顯著增加，得到的苜蓿飼料的蛋白含量、干物質(zhì)含量等都顯著提高。文檔編號(hào)C12N1/20GK101735964SQ20081022701公開日2010年6月16日申請(qǐng)日期2008年11月18日優(yōu)先權(quán)日2008年11月18日發(fā)明者崔宗均,王小芬,胡躍高申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)