專利名稱：誘導(dǎo)肝卵圓細胞向膽管細胞分化的方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)細胞分化的方法及其專用培養(yǎng)基，特別是涉及一種誘導(dǎo)肝卵圓細胞 向膽管細胞分化的方法及其專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
WB-F344細胞是一類從Fischer雄鼠肝臟分離出來的細胞，具有許多肝干/祖細胞 的特性1)它具有肝細胞和肝膽管細胞的表型特征；2)當它移植到大鼠的肝臟中后， 它能夠獲得肝細胞的型態(tài)和功能特征；3) WB-F344細胞經(jīng)過化學(xué)誘變后移植入大鼠肝 臟后能夠發(fā)展成為膽管癌，表明它具有向膽管細胞分化的潛能，這些特征都說明 WB-F344細胞是肝干/祖細胞。有研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉處理后的WB-F344細胞具有了膽管 細胞的一系列標志，說明WB-F344可在丁酸鈉的誘導(dǎo)下向膽管細胞分化。此外，還有研 究發(fā)現(xiàn)，把WB-F344細胞培養(yǎng)在Matrigel上時，細胞的生長開始停滯，細胞形成管腔 樣結(jié)構(gòu)，細胞開始收縮并沿管腔結(jié)構(gòu)方向拉伸，細胞的核質(zhì)比變大。對誘導(dǎo)的細胞進行 !iiRNA和蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn)，膽管細胞的標志如CK19、 Yp、 aquaporin以及BDS7等的表
達量都不同程度的上調(diào)。
小G蛋白Rho家族主要的生物學(xué)效應(yīng)是引起肌動蛋白細絲等細胞骨架蛋白重構(gòu)，從 而維持細胞的形態(tài)極性，促進細胞的變形、趨化運動和游走，此外，Rho家族成員也參 與對細胞周期的調(diào)控、細胞應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)等。在生物發(fā)育的過程中，具有多向分化潛 能干細胞的定向分化起著決定性作用，它們促成了胚胎發(fā)生、神經(jīng)發(fā)生、造血生成、骨 生成及肌肉生成等生物學(xué)過程，而在這些分化發(fā)育的過程中，小G蛋白家族尤其是RhoA 蛋白起到至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在傳統(tǒng)生物學(xué)模型果蠅(Drosophila)的胚胎發(fā) 育過程中，RhoA的缺乏會導(dǎo)致原腸胚形成的受阻，阇時細胞失去運動能力；此外，在 果蠅的神經(jīng)發(fā)生過程中，神經(jīng)母細胞的增殖和樹突的形成也受到RhoA的調(diào)控，當RhoA 失活時，果蠅的神經(jīng)發(fā)生受到抑制。Li Wei等在小鼠胚胎的發(fā)育過程中，用RhoGDI表 達來抑制RhoA的激活，發(fā)現(xiàn)RhoA的失活會導(dǎo)致發(fā)育7天的小鼠胚胎死亡(Wei L， Imanaka-Yoshida K， Wang L， et al. Inhibition of Rho family GTPases by Rho GDP dissociation inhibitor disrupts cardiac morphogenesis and inhibits cardiomyocyte proliferation. Development, 2002， 129 (7) : 1705 1714);另一方面， 在脊椎動物胚胎發(fā)育過程中，RhoA的過量表達也會導(dǎo)致胚胎體積的減小甚至胚胎的死 亡。在早期胚胎發(fā)育的神經(jīng)發(fā)生過程中，軸突的起始與生長、細胞的極化、神經(jīng)元的再生都受到Cdc42和Rac的調(diào)控，此外，RhoA的抑制會阻礙神經(jīng)系統(tǒng)形成，而RhoA活性 的逐步下調(diào)引發(fā)皮層神經(jīng)細胞的遷移。同樣，在造血系統(tǒng)發(fā)育過程中，RhoA也參與了 造血干細胞的細胞遷移和運動，抑制RhoA的活性會促進造血干細胞的遷移、粘附和重 建研究還發(fā)現(xiàn)，在間充質(zhì)干細胞的分化決定過程中，間充質(zhì)千細胞與不同的分化細胞如 平滑肌細胞和血管內(nèi)皮細胞接觸培養(yǎng)時，會呈現(xiàn)不同的細胞狀態(tài)，此外，結(jié)合間充質(zhì)干 細胞本身的細胞形態(tài)、應(yīng)力等，RhoA蛋白的失活突變會促進間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞 分化，相反的大量活性RhoA蛋白則誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向肌肉或者成骨細胞分化。 Sordella的研究發(fā)現(xiàn)小鼠的表皮成纖維細胞能夠在pl90GAP和RhoA的作用下調(diào)控著向 成肌肉和脂肪細胞分化(Sordella R, Jiang W， Chen GC， et al. Modulation of Rho GTPase Signaling Regulates a Switch between Adipogenesis and Myogenesis. Cell, 2003, 113: 147-158)?？偠灾?，在干細胞的分化發(fā)育過程中，RhoA在維持著細胞 基本運動特性的同時，還對干細胞的自我更新、分化決定以及定向分化過程中起著調(diào)控 作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡便易行的用于體外誘導(dǎo)肝卵圓細胞向膽管細胞分化的 專用培養(yǎng)基。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案用于體外誘導(dǎo)肝卵圓細胞分化為
膽管細胞的專用培養(yǎng)基，是在RPMI1640培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了 1-6% (體積/體積百分 比濃度，V/V)胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) ， 1-3% (體積/體積百分比濃度， V/V) B27和0.05-0. 15% (體積/體積百分比濃度，V/V)青-鏈霉素。
所述培養(yǎng)基中胎牛血清的含量優(yōu)選為5%， B27的含量優(yōu)選為2X，青-鏈霉素的濃 度優(yōu)選為0.1%。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種體外誘導(dǎo)肝卵圓細胞分化為膽管細胞的方法。 本發(fā)明所提供的體外誘導(dǎo)肝卵圓細胞分化為膽管細胞的方法，包括以下步驟-
1) 將RhoA基因活性突變體導(dǎo)入卵圓細胞TO-F344，得到高表達RhoA基因活性突 變體的WB-F344細胞；
2) 將高表達RhoA基因活性突變體的WB-F344細胞接種于上述體外誘導(dǎo)肝卵圓細胞 分化為膽管細胞的專用培養(yǎng)基中，在37。C、 5% C02下培養(yǎng)，促使WB-F344細胞向膽管 細胞分化并形成管腔樣結(jié)構(gòu)，得到膽管細胞。
在上述誘導(dǎo)方法中，步驟O中的RhoA基因活性突變體命名為RhoA V14，具有序 列表中序列1的核苷酸序列，編碼序列表中序列2的氨基酸殘基序列。
可按照常規(guī)方法將RhoA基因活性突變體基因轉(zhuǎn)染W(wǎng)B-F344細胞，如通過含有RhoA基因活性突變體基因的重組真核表達載體或利用慢病毒載體系統(tǒng)等將RhoA基因突變體 基因?qū)隬B-F344細胞。
所述利用慢病毒載體系統(tǒng)將RhoA基因活性突變體基因?qū)隬B-F344細胞的方法， 可包括以下步驟
A) 將RhoA基因活性突變體基因?qū)肼《据d體系統(tǒng)中的目的基因轉(zhuǎn)移載體中，得 到攜帶有RhoA基因活性突變體基因的重組慢病毒載體；
B) 將攜帶有RhoA基因活性突變體基因的重組慢病毒載體與慢病毒載體系統(tǒng)中的兩 種包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒按4. 5-5. 5: 3.7-4.7: 1.5-2.5: 2. 3-3. 3的重量份數(shù)比混合后， 用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染慢病毒包裝細胞，得到攜帶有RhoA基因活性突變體基因的重組慢
病毒；
C) 將攜帶有RhoA基因活性突變體基因的重組慢病毒轉(zhuǎn)染W(wǎng)B-F344細胞，得到表 達RhoA基因活性突變體的WB-F344細胞。
在上述表達RhoA基因活性突變體的WB-F344細胞的構(gòu)建方法中，所述步驟A)中的慢 病毒載體系統(tǒng)中的目的基因轉(zhuǎn)移載體為pBPLV，是將pMAl載體(該載體參考文獻
(Amendola M， et a7. Coordinate dual-gene transgenesis by lentiviral vectors carrying synthetic bidirectional promoters. Nat Biotechnol, 2005， 23(1) :108-116) 用限制性內(nèi)切酶/^"和&〗/進行雙酶切(切除兩個酶切位點之間的基因片段)后與正 義鏈為5， -ggctagcatgctctagagcgctg-3'，反義鏈為 3， -acgtccgatcgtacgagatctcgcgacagct-5，的多克隆位點序列連接得到。)。
步驟B)中的慢病毒載體系統(tǒng)中的兩種包裝質(zhì)?？蔀閜LPl和pLP2 (均可購自 Invitrogen公司)，該包裝質(zhì)粒主要起到病毒包裝作用，其轉(zhuǎn)錄表達后形成病毒衣殼 結(jié)構(gòu)蛋白及酶蛋白；包膜質(zhì)粒可為pLP/VSVG (可購自Invitrogen公司)，該包膜質(zhì)粒 轉(zhuǎn)錄表達后形成病毒包膜蛋白；慢病毒包裝細胞可為293-FT細胞(可購自Invitrogen . 公司)。
用上述方法誘導(dǎo)得到的膽管細胞也屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)肝卵圓細胞向膽管細胞分化的方法及其專用培養(yǎng)基。該方法 通過RhoA基因活性突變體及慢病毒載體系統(tǒng)包裝形成慢病毒，將RhoA基因活性突變體 導(dǎo)入WB-F344細胞，獲得高表達活性RhoA基因突變體的WB-F344細胞，再在體外培養(yǎng) 的條件下自主分化為膽管細胞并形成管腔樣結(jié)構(gòu)。形態(tài)學(xué)觀察、基因和蛋白水平的驗證 結(jié)果表明用本發(fā)明的方法及培養(yǎng)基可獲得表達有膽管系相關(guān)標志CK19、 Yp、 Aquaporin-1、 GGT IV等的膽管細胞。本發(fā)明提供了一條獲得膽管細胞的新途徑，應(yīng)用 前景廣闊。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。


圖1為RT-PCR擴增的RhoA基因的1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果 圖2為轉(zhuǎn)染有RhoA V14基因的WB-F344細胞的形態(tài)圖
圖3A為轉(zhuǎn)染有RhoA V14基因的WB-F344細胞中RhoA V14基因表達情況的RT-PCR 檢測結(jié)果
圖3B為轉(zhuǎn)染有RhoA V14基因的WB-F344細胞中RhoA V14表達情況的Western Blotting檢測結(jié)果
圖4為RhoA V14 TO-F344細胞分化形成的管腔樣結(jié)構(gòu) 圖5為分化細胞膽管標志物的RT-PCR和免疫熒光檢測結(jié)果
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別均為常規(guī)方法，所用引物均由上海英俊公司合成，
所述百分比濃度均為質(zhì)量/體積(w/v)百分比濃度或體積/體積(v/v)百分比濃度。
實施例l、體外誘導(dǎo)肝卵圓細胞分化為膽管細胞
用本發(fā)明的方法體外誘導(dǎo)肝卵圓細胞分化為膽管細胞，包括以下步驟
一、攜帶RhoA V14基因的重組慢病毒載體的構(gòu)建
離心收集2-3X106293FT細胞，抽提總RNA，用常規(guī)方法構(gòu)建cDNA文庫(J 薩姆 布魯克，E* F'弗里奇，T'曼尼阿第斯。分子克隆實驗指南第二版，科學(xué)出版社， p396-p455)。以cDNA為模板，在PCR引物F: 5， ctgcagatggctgccatccggaagaa3' 和R: 5， gtcgactcacaagacaaggcaaggcaac3'的引導(dǎo)下，克隆RhoA基因的cDNA，以P -actin基因為對照，反應(yīng)結(jié)束后，對RT-PCR擴增產(chǎn)物進行P/。-2X瓊脂糖凝膠電泳檢 測，檢測結(jié)果如圖l所示，經(jīng)擴增獲得了 594bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符，然后將 該目的片段連接到T-載體pGEM-T (購自Promega公司)上進行測序，測序結(jié)果表明獲 得了序列正確的RhoA基因的cDNA。將測序正確的重組質(zhì)粒進行pfu點突變
(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit)，點突變引物為F: 5， CTG GTG ATT GTT GGT GAT GTT GCC TGT GGA AAG ACA TGC3，和R: 5， GAC CAC TAA CAA CCA CTA CAA CGG ACA CCT TTC TGT ACG3，，突變后再次進行測序，測序結(jié)果表明獲得了序列正確的 RhoA基因活性突變體，命名為RhoAV14，具有序列表中序列1的核苷酸序列，編碼序 列表中序列2的氨基酸殘基序列。最后，對攜帶RhoA V14基因的重組T載體用尸"I 和&7I雙酶切，回收并純化獲得的594bp的DNA片段，將其連入經(jīng)同樣酶雙酶切的慢 病毒載體系統(tǒng)中的目的基因轉(zhuǎn)移載體pBPLV (pBPLV是通過將pMAl載體(該載體參考文獻
(Amendola M， et <3_Z. Coordinate dual-gene transgenesis by lentiviral vectorscarrying synthetic bidirectional promoters. Nat Biotechnol， 2005， 23(1) :108-116))用 限制性內(nèi)切酶尸"I和5"WI進行雙酶切(切除兩個酶切位點之間的基因片段)后與正 義 鏈為 5, -ggctagcatgctct,gcgctg-3， ， 反義鏈為
3' -acgtccgatcgtacgagatctcgcgacagct-5，的多克隆位點序列連接而得到的新的慢病 毒載體)中，對得到的重組慢病毒載體用限制性內(nèi)切酶尸st I和5"a7 I進行酶切鑒定，對 酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果經(jīng)酶切獲得了約594bp的DNA片段，與預(yù) 期結(jié)果相符，表明獲得了攜帶有RhoA V14基因的重組慢病毒載體，將其命名為 pBPLV-RhoAV14。
二、通過慢病毒感染轉(zhuǎn)導(dǎo)RhoA V14基因
1、慢病毒的包裝
① 培養(yǎng)293FT細胞(購自Invitrogen公司)，從不使其生長過度，長至90%匯合 即傳代，傳代超過20代后不應(yīng)使用。
② 制備DNA-Lipofectamine 2000 (購自Invitrogen公司)復(fù)合物，方法為在一 個無菌的5mL管中，加入1.5raL無血清0pti-MEM8 I培養(yǎng)基(購自Gibco公司)，依次 加入包裝質(zhì)粒4. 2嗎pLPl (購自Invitrogen公司)、2pg pLP2 (購自Invitrogen公 司)、2.8ng pLP/VSVG (購自Invitrogen公司)包膜蛋白質(zhì)粒和5pg步驟一構(gòu)建的攜 帶RhoA V14基因慢病毒表達質(zhì)粒pBPLV-RhoAV14，輕輕混勻。在另一個無菌的5mL管 中，將42ial Lipofectamine 2000稀釋于1. 5mL無血清Opti-MENf I培養(yǎng)基中，輕輕混 勻，室溫放置5分鐘。注意，吸取Lipofectamine 2000前要輕輕混勻?；旌弦陨?管 液體，輕輕混勻。室溫孵育20分鐘以形成DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物。
③ 在DNA-Lipofectaraine 2000復(fù)合物形成過程中，用胰蛋白酶消化293 FT細胞， 計數(shù)，將細胞重懸于含血清的生長培養(yǎng)基中，使其密度為1.2xl06個/mL。注意培養(yǎng) 基中不能含有抗生素。
將DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物加入到含有5mL生長培養(yǎng)基(購自Gibco公 司)的10cra細胞培養(yǎng)皿中。注意培養(yǎng)基中不能含有抗生素。
⑤ 將5mL 293FT細胞懸液(共6xlC)6個細胞)加入到含有DNA-Lipofectamine 2000 復(fù)合物和生長培養(yǎng)基的10cm細胞培養(yǎng)皿中，輕輕地前后移動培養(yǎng)皿混勻。將細胞置于 37°C C02孵箱中過夜培養(yǎng)(10-12小時)。
⑥ 次日，用10mL包含丙酮酸鈉的完全培養(yǎng)基(高糖DMEM， 10%胎牛血清，0. l咖ol/L 非必需氨基酸，2 mmol/L L-谷氨酰胺，1%青_鏈霉素，lmmol/L丙酮酸鈉)更換含有 DNA-Lipofectamine復(fù)合物的培養(yǎng)基。VSVG糖蛋白會使293FT融合形成多核合胞體，這 種形態(tài)上的改變是正常的，不影響慢病毒的產(chǎn)生。⑦ 轉(zhuǎn)染48-72小時后收集上清于15mL無菌離心管中。轉(zhuǎn)染后48小時或72小時收 集病毒上清，產(chǎn)量并沒有太大差別。注意此時操作的是有感染性的病毒，請帶口罩和 手套。
⑧ 4'C、 3， 000rpm離心15分鐘去除細胞碎片。如果要體內(nèi)應(yīng)用，則采用0. 45|am濾
膜過濾。
⑨ 如果需要濃縮，可用0.45,濾膜過濾后，用水平轉(zhuǎn)頭如Beckman SW41t轉(zhuǎn)頭于 4'C、 26， OOOrpm超速離心90分鐘收集沉淀；或用Amicon的Centricon-100分子質(zhì)量 截留濾膜4r、 5，000g離心進行濃縮，離心時間越長，病毒原液越濃。
⑩ 最后，將病毒液分裝，凍存于-80'C備用。 2、慢病毒感染W(wǎng)B-F344細胞
將常規(guī)培養(yǎng)的WB-F344細胞接種于24孔板中，15，000個細胞/孔，待細胞長至70 %豐度時，棄去培養(yǎng)液，加入步驟1獲得的病毒毒液，同時每孔補加1-Polybrene (購自Sigma公司)促進病毒的入侵。24小時后棄去毒液，加入RPMI1640完全培養(yǎng)基 (購自Gibco公司)進行繼續(xù)培養(yǎng)，48小時后觀察有無綠色熒光的產(chǎn)生(注意:Polybrene 在-20。C可儲存達1年，在4'C可放置2周，反復(fù)凍融不宜超過3次。)。
如圖2所示(對照為未轉(zhuǎn)染W(wǎng)B-F344細胞)(比例尺IOO咖)，細胞在轉(zhuǎn)染后48 小時發(fā)出綠色熒光，細胞收縮呈圓形，核質(zhì)比升高，證明攜帶有RhoA V14基因的慢病 毒成功將該基因轉(zhuǎn)進WB-F344細胞中。然后，提取轉(zhuǎn)染細胞的mRNA和蛋白，分別進行 RT-PCR (引物1為5， CTGCAGATGGCTGCCATCCGGAAGAA3，，引物2為 5' GTCGACTCACAAGACAAGGCAAGGCAAC3，)和Western Blotting (—抗為兔源RhoA(119)， 購自SANTA CRUZ公司；二抗為TRITC標記的山羊抗兔Ig，購自北京中杉公司)檢測， 檢測結(jié)果如圖3A和圖3B (active RhoA為活性RhoA蛋白量，total RhoA為RhoA全蛋 白量)所示，經(jīng)驗證RhoA V14基因在基因和蛋白水平上均高度表達，說明RhoAV14 基因細胞己成功地轉(zhuǎn)進WB-F344細胞中，得到高表達活性RhoA基因突變體的TO-F344 細胞，命名為RhoA V14 WB-F344細胞。
三、將RhoA V14 WB-F344細胞分化為膽管細胞并形成管腔樣結(jié)構(gòu) 1、誘導(dǎo)分化
分化培養(yǎng)基在RPMI1640培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了 5%(4-6X均可)胎牛血清(fetal bovine serum， FBS) ， 2% (1_3%均可)B27和0. 1% (0. 05-0. 15%均可)青-鏈霉素。
將高表達活性RhoA基因突變體的WB-F344細胞接種于上述體外誘導(dǎo)肝卵圓細胞分 化為膽管細胞的專用培養(yǎng)基中，在37'C、 5% C02下培養(yǎng)，促使WB-F344細胞向膽管細胞分化并形成管腔樣結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)4-7天后，在熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，結(jié)果如圖4 所示(比例尺100uni) ， RhoA V14 WB-F344細胞在接種培養(yǎng)后逐漸形成管腔樣結(jié)構(gòu)。 2、標志物檢測
提取分化細胞(以未誘導(dǎo)分化的WB-F344細胞為對照)的mRNA和蛋白，對膽管系 相關(guān)標志CK19、 Yp、 Aqu即orin-1、 GGT IV分別進行RT-PCR (檢測CK19基因的引物為 5， -TTGCGCGACAAGATTCTTGG-3，(正向)和5， -CATCTCACTCAGGATCTTGG-3，(反向)， 檢測Yp基因的引物為5 ， -TGGAAGGAGGAGGTGGTTAC-3 ，(正向)和 5， -TGTCCCTTCGTCCACTACTG-3，(反向)，檢測Aquaporin-1基因的引物為 5， 一CAGCAGCGACTTTACAGACC—3，(正向)和5， —GGGGACTTTCTAGCACACTC—3，(反向)， 檢測GGT基因的弓I物為5， -GGCTTGTTGACCTTGGGCATCTG-3，(正向)和 5， -CCAGCACCAGAAACCGATTCTTCAT-3'(反向))和免疫熒光(檢測CK19的抗體為鼠源 CK19，購自SANTA CRUZ公司和TRITC標記的山羊抗小鼠Ig，購自北京中杉公司)檢觀!(， 結(jié)果如圖5所示(圖A為RT-PCR檢測結(jié)果，圖B為免疫熒光檢測結(jié)果，比例尺100um， 圖a為CK19基因表達分析圖，b為Yp基因表達分析圖，c為Aquaporin-1基因表達分 析圖，d為RhoA V14 WB-F344細胞形成的管腔樣結(jié)構(gòu)，e為該結(jié)構(gòu)上CK19蛋白表達情 況的免疫熒光圖，f為d圖和e圖的合并，g為對照細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)圖，h為對照細胞CK19 蛋白表達情況，i為g圖和h圖的合并。)，與陰性對照細胞相比，膽管系相關(guān)標志CK19、 Yp、 Aqu邵orin-l、 GGT IV等在基因和蛋白水平表達量均上調(diào)，表明RhoA V14 WB-F344 細胞經(jīng)誘導(dǎo)分化成為膽管細胞。序列表
<160〉 2
<210〉 1
〈211〉 582
<212〉 DNA
〈213〉 人屬人(〃o衡5"柳'e/ s)
<400> 1
atggctgccatccgga^gaaactggtgattgttggtgatgttgcctgtggaaagacatgc60
ttgCtC3C6lgtcttcagcaaggaccaigttccc卿ggtgtatgtgcccax:agtgtttg恥120
aactatgtggcagatatcgaggtggatggBagttggctttgtgggacaca180
gctgggc鄉(xiāng)犯gatt3tgatcgcctgaggcccctctcctacccagatacCg3tgtt3t3240
ctgatgtgtttttccatcgacagccctgatagtttaga犯acatcccagaaaagtggacc300
ccagaagtcaagcatttctgtcccaacgtgcccatcatcctggttggg33360
cttcggaatgatgagcacac鄉(xiāng)gCgggBgctagccaagatg卿cag印gccggtgaaa420
cctgaag肌ggC￡lg￡Lg3tatggca認agg3ttggCgCttttgggt8Cfltgg敏gttC3480
gcaaag3ccaa卿tggagtgag卿ggtttttgaaatggctacgagagctgctctgc肌540
gct卿cgtggg犯g犯犯aatctgggtgccttgtcttgt582
〈210> 2 〈211〉 193 <212〉 PRT
<213〉 人屬人(〃OM3 5"apie/ 5) 〈400〉 2
Met Ala Ala lie Arg Lys Lys Leu Val lie Val Gly Asp Ala Ala Cys
1、 5 10 15
Gly Lys Thr Cys Leu Leu Thr Val Phe Ser Lys Asp'Gin Phe Pro Glu
20 25 30
Val Tyr Val Pro Thr Val Phe Glu Asn Tyr Val Ala Asp lie Glu Val35 40 45
Asp Gly Lys Gin Val Glu Leu Ala Leu Trp Asp Thr Ala Gly Gin Glu
50 55 60
Asp Tyr Asp Arg Leu Arg Pro Leu Ser Tyr Pro Asp Thr Asp Val lie 65 70 75 80
Leu Met Cys Phe Ser lie Asp Ser Pro Asp Ser Leu Glu Asn lie Pro
85 90 95
Glu Lys Trp Thr Pro Glu Val Lys His Phe Cys Pro Asn Val Pro lie
100 105 110
lie Leu Val Gly Asn Lys Lys Asp Leu Arg Asn Asp Glu His Thr Arg
115 120 125
Arg Glu Leu Ala Lys Met Lys Gin Glu Pro Val Lys Pro Glu Glu Gly
130 135 140
Arg Asp Met Ala Asn Arg lie Gly Ala Phe Gly Tyr Met Glu Cys Ser 145 150 155 160
Ala Lys Thr Lys Asp Gly Val Arg Glu Val Phe Glu Met Ala Thr Arg
165 170 175
Ala Ala Leu Gin Ala Arg Arg Gly Lys Lys Lys Ser Gly Cys Leu Val 180 185 190
Leu
權(quán)利要求
1、用于體外誘導(dǎo)肝卵圓細胞分化為膽管細胞的培養(yǎng)基，是在RPMI1640培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了1-6％胎牛血清，1-3％B27和0.05-0.15％青-鏈霉素。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基中胎牛血清的含量為 5%， B27的含量為2X，青-鏈霉素的濃度為0. 1%。'
3、 一種體外誘導(dǎo)肝卵圓細胞分化為膽管細胞的方法，包括以下步驟1) 將RhoA基因活性突變體導(dǎo)入卵圓細胞WB-F344，得到高表達RhoA基因活性突 變體的WB-F344細胞；2) 將高表達RhoA基因活性突變體的WB-F344細胞接種于權(quán)利要求1或2所述體外 誘導(dǎo)肝卵圓細胞分化為膽管細胞的專用培養(yǎng)基中，在37'C、 5% C02下培養(yǎng)，得到膽管 細胞。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于所述步驟l)中的RhoA基因活性突變體具有序列表中序列1的核苷酸序列。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于通過含有RhoA基因活性突 變體的重組真核表達載體或利用慢病毒載體系統(tǒng)將RhoA基因活性突變體導(dǎo)入WB-F344 細胞。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于所述利用慢病毒載體系統(tǒng)將 RhoA基因突變體基因?qū)隬B-F344細胞的方法，包括以下步驟A) 將RhoA基因突變體基因?qū)肼《据d體系統(tǒng)中的目的基因轉(zhuǎn)移載體中，得到攜 帶有RhoA基因突變體基因的重組慢病毒載體；B) 將攜帶有RhoA基因突變體基因的重組慢病毒載體與慢病毒載體系統(tǒng)中的兩種包 裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒按4. 5-5.5: 3.7-4.7: 1.5-2.5: 2. 3-3. 3的重量份數(shù)比混合后，用 脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染慢病毒包裝細胞，得到攜帶有RhoA基因突變體基因的重組慢病毒；C) 將攜帶有RhoA基因突變體基因的重組慢病毒轉(zhuǎn)染W(wǎng)B-F344細胞，得到表達 RhoA基因突變體的WB-F344細胞。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于所述步驟A)中的慢病毒載體系 統(tǒng)中的目的基因轉(zhuǎn)移載體為pBPLV 。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于所述步驟B)中的慢病毒載體系 統(tǒng)中的兩種包裝質(zhì)粒為pLPl和pLP2;包膜質(zhì)粒為pLP/VSVG;慢病毒包裝細胞為293-FT 細胞。
9、 用權(quán)利要求3-8任一項所述方法誘導(dǎo)得到的膽管細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種誘導(dǎo)肝卵圓細胞向膽管細胞分化的方法及其專用培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基是在RPMI1640培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了1-6％胎牛血清，1-3％B27和0.05-0.15％青-鏈霉素。該誘導(dǎo)分化方法包括以下步驟1)將RhoA基因突變體導(dǎo)入卵圓細胞WB-F344，得到高表達RhoA基因活性突變體的WB-F344細胞；2)將高表達活性RhoA基因突變體的WB-F344細胞接種于上述體外誘導(dǎo)肝卵圓細胞分化為膽管細胞的專用培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO₂下培養(yǎng)，得到膽管細胞。本發(fā)明提供了一條獲得膽管細胞的新途徑，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12N5/10GK101418285SQ20081022767
公開日2009年4月29日 申請日期2008年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日
發(fā)明者姚海雷, 文 岳, 偉 師, 李艷華, 王韞芳, 裴雪濤, 賈雅麗 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所