專利名稱：一種發(fā)酵培養(yǎng)樺褐孔菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵培養(yǎng)樺褐孔菌的方法。
背景技術(shù)：
樺褐孔菌(Inonotus obliquus)屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、多孔菌科、褐 臥孔菌屬的一種藥用真菌，寄生于樺樹的樹干上，子實體小，黑色塊狀，不孕。野外采集 到的通常是菌絲體形成的黑色瘤狀物，是該真菌的藥用部分。樺褐孔菌主要分布于俄羅 斯北部、北歐、日本(北海道)以及我國的長白山和大興安嶺等北諱40。 -50°的地區(qū) (黃年來.俄羅斯神秘的民間藥用真菌-樺褐孔菌.中國食用菌，2002，21 :7.)。樺褐孔 菌在俄羅斯、北歐、日本、美國及韓國被廣泛用來治療惡性腫瘤(Glowacki， Tomaszewski J. Attempted therapy of inoperablecancer of the female genitalia with Inonotus obliquus. Extract Ginekol Pol， 1962， 33 :445.)、糖尿病、心血管疾病、肝病(Wasser SP， Weis AL.Therapeuticeffect of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms :a modernperspective. Critical Reviewof Immunology,1999，19 :65.) 及 艾滋病(SakumaK. Aids virus multiplication inhibitor and method of culturing activeingredient thereof. JP :93/159,946， 1993-07-07.)等。對多種腫瘤細胞(乳 房癌、唇癌、胃癌、耳下腺癌、肺癌、皮膚癌、直腸癌和霍金斯淋巴癌)有明顯的抑制作用； 能有效地防止癌細胞轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，增強免疫能力并且可用于配合惡性腫瘤患者的放療、 化療，增強病人的耐受性，減輕毒副作用(Mizuno T， Zhuang C， AbeK， et al. Antitumor and hypoglycemic activities of polysaccharides from thesclerotia and mycelia of Inonotus obliquus (Pers.Fr. )Pil. InternationalJournal of Mushrooms,1999，1 : 301-316.)。樺褐孔菌作為抗腫瘤天然藥物在俄羅斯已有一百多年的應(yīng)用歷史，是具有 顯著藥理活性而對人體沒有任何毒副作用的藥用真菌(林壁賢，李華，毛景華等，藥用真 菌樺褐孔菌.海峽藥學(xué)，2004，16:74.)。研究表明，芳香類(丹寧、黃酮)、地花菌素類、 黑色素類等酚類化合物構(gòu)成樺褐孔菌的次生代謝產(chǎn)物的主體，具有抗氧化、誘導(dǎo)腫瘤細 胞調(diào)亡等重要藥理活性，是樺褐孔菌抗氧化、抗腫瘤活性的有效成分(何堅，馮孝章.樺 褐孔菌化學(xué)成分的石開究.中草藥，2001，32 :4. Babitskaya VG， Scherba VV， Ilonnikova NV， et al. Melanin complex from medicinal mushroom Inonotus obliquus (Pers.: Fr.)Pilat (Chaga) (Aphyllophoromycetideae). International Journal ofMedicinal Mushrooms,2001，4 :139-145. Cui Y， Kim DS， Park KC. Antioxidanteffect of Inonotus obliquus. Journal of Ethnopharmacology，2005，96 :79—85.Park, Y. K. ， Lee， H. B. ， Jeon， E. J. ， Jung， H. S. ， Kang， M. H. ，2004. Chagamushroom extract inhibits oxidative DNA damage in human lymphocytes asassessed by comet assy. BioFactors 21:109—112. Burczyk J，Gawron A，Slotwinska M et al…Anitmitotic activity of aqueous extracts of Inonotusobliquus. Bollettino Chimico Farmaceutico， 1996， 135 :306-309.)。由于禪 褐孔菌分布于高寒地區(qū)，生長極為緩慢。有研究表明，生長在活樺樹的野生樺褐孔菌10-15年才具有較好的藥用價值(陳艷秋，李玉.樺褐孔菌的研究進展.微生物通報，2005，32: 124-127.)。因此野生樺褐孔菌資源已遠遠不能滿足日益增長的市場需求。野生樺褐孔菌生 長在高海拔的寒冷地區(qū)，晝夜溫差大。冬季受高強紫外線照射，夏季受病原微生物和昆蟲的入 侵。病原菌感染、紫外輻射以及昆蟲吞噬壓力誘導(dǎo)酚類化合物合成代謝關(guān)鍵酶基因的啟動，表 達諸如查耳酮合成酶和酪氨酸酶，從而在菌體內(nèi)積累大量的酚類化合物(如黃酮類和黑色素 等植物防御素)以平衡生存的環(huán)境壓力。因此，酚類化合物的大量積累是樺褐孔菌在特定的 環(huán)境壓力下實現(xiàn)的。由于人工培養(yǎng)環(huán)境缺少細菌和霉菌入侵以及昆蟲吞噬的壓力，導(dǎo)致樺褐 孔菌酚類化合物積累甚微，從而使人工培養(yǎng)的樺褐孔菌藥理學(xué)活性大大下降(Zheng W， Zhao Y， Zhang M， Yin Z， Chen C， Wei Z. Phenolic compounds from Inonotusobliq皿s and their immune-stimulating effects. Mycosystema 2008，27 :39-47.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵培養(yǎng)樺褐孔菌的方法。 本發(fā)明所提供的發(fā)酵培養(yǎng)樺褐孔菌的方法，是向樺褐孔菌的培養(yǎng)液中添加無菌的 鏈格孢霉菌細胞壁碎片；所述鏈格孢霉菌細胞壁碎片是將鏈格孢霉菌菌絲體破碎后離心得 到的。 其中，所述鏈格孢霉菌細胞壁碎片可用多種方法制備，所述鏈格孢霉菌細胞壁碎 片具體是用超聲破碎鏈格孢霉菌菌絲體，然后在4800-10000Xg下離心獲得的，所述超聲 破碎的條件具體可為250-300w、5000-7000次/分鐘、30_45分鐘。所述樺褐孔菌的培養(yǎng)液 是發(fā)酵72-120小時的發(fā)酵液。所述樺褐孔菌的培養(yǎng)液中所述鏈格孢霉菌細胞壁碎片的濃 度為20-60微克/升，所述的濃度是按照鏈格孢霉菌細胞壁碎片的干重計算的。所述發(fā)酵 培養(yǎng)中，通氣量為0. 3-0. 5立方米/分鐘，攪拌速度為200-300轉(zhuǎn)/分鐘，溫度為25_28°C。 所述鏈格 包霉菌具體可為Alternariaalterna:rata或A. augustiouoidea或A. arborescens 或A. argyranthemi或A. arbusti或A. blumeae或A. brassicicola。 本發(fā)明通過向樺褐孔菌的發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵液中加入鏈格孢霉菌細胞壁碎片來培 養(yǎng)樺褐孔菌，獲得的樺褐孔菌胞內(nèi)和胞外的酚類化合物的積累和抗氧化活性明顯提高。本 發(fā)明的樺褐孔菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法中鏈格孢霉菌細胞壁碎片用量少，制備方法簡單，成本低 廉，具有廣泛的實用價值和經(jīng)濟價值。


圖1為樺褐孔菌生物量積累曲線。 圖2為樺褐孔菌胞外總酚積累曲線。 圖3為樺褐孔菌胞內(nèi)總酚積累的曲線。 圖4為樺褐孔菌胞內(nèi)總酚清除DPPH自由基能力的曲線。 圖5為樺褐孔菌胞內(nèi)總酚清除超氧陰離子自由基能力的曲線。 圖6為樺褐孔菌胞內(nèi)總酚清除羥基自由基能力的曲線。
具體實施例方式
實施例1、樺褐孔菌的發(fā)酵培養(yǎng)
1)鏈格孢霉菌細胞壁碎片的制備 鏈格孢霉菌細胞壁碎片(ACW)按如下方法制備 將鏈格孢霉購自中國科學(xué)院北京微生物研究所中國普通微生物菌種保藏管理中 心(CGMCC 3. 5373)接入含有200毫升鏈格孢霉培養(yǎng)基的500毫升的三角瓶中，在26°C、 140轉(zhuǎn)/分的恒溫振蕩器中培養(yǎng)3-4天。鏈格孢霉培養(yǎng)基為葡萄糖2g/100ml，蛋白胨 0. 5g/100ml， MgS04 0. 01g/100ml， KH2P04 0 . 001g/100ml， p朋.0。 3-4天后將鏈格孢霉培養(yǎng) 液過濾，得到的菌絲體以超純水洗滌三次，之后在超純水中用功率為250w的超聲波破碎30 分鐘。將超聲破碎的鏈孢霉菌絲體在4S00Xg重力條件下離心20分鐘，棄上清液，以純水 洗滌2-3次，在同等條件下離心后60-8(TC烘干。將得到的鏈格孢霉菌細胞壁碎片稱重，用 純凈水按1毫克/毫升定容，在12(TC的消毒鍋中滅菌30分鐘。
2)樺褐孔菌深層發(fā)酵 將樺褐孑L菌(Zheng Weifa， Zhao Yanxia， Zhang Meimei， Yin Zhao juan， ChenCaifa， Wei Zhiwen.Phenolic compounds from Inonotus obliquus and theirimmime-stimulating effects. Mycosystema 2008， 27 (4) :574-581)(徐州師范大 學(xué))無菌接入事先滅菌的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的成分為葡萄糖2克AOOml，蛋白胨0. 5 克/100ml，硫酸鎂0. 05g/100ml，磷酸二氫納0. 01g/100ml， pH 6. 0 ;然后在26。C、轉(zhuǎn)速 為140轉(zhuǎn)/分鐘的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天，之后用滅菌的勻漿探頭對培養(yǎng)的菌球以 4500-6000轉(zhuǎn)/分勻漿8-10秒，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時，得液體菌種。搖瓶培養(yǎng)的液體菌 種按0. 1克/升接入裝有滅菌的7升豆粉玉米汁培養(yǎng)基的10升發(fā)酵罐，豆粉玉米汁培養(yǎng) 基為蔗糖4g/100ml，豆粉5g/100ml，玉米粉3g/100ml，硫酸鎂0. 05g/100ml，磷酸二氫納 0.01g/100ml，pH 6.0。發(fā)酵罐通氣量為0. 3立方米/分鐘，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng) 溫度為26°C。在接種后的第三天，向發(fā)酵罐中加入鏈格孢霉菌細胞壁碎片，使其終濃度為 20、40和60微克/升，繼續(xù)培養(yǎng)12天。以不添加鏈格孢霉菌細胞壁碎片，其他深層發(fā)酵培 養(yǎng)條件相同的樺褐孔菌為對照。 3)樺褐孔菌深層發(fā)酵菌絲體生物量和總酚積累 取步驟2)的加入鏈格孢霉菌細胞壁碎片(20、40和60微克/升)發(fā)酵0_12天的 發(fā)酵液及對照發(fā)酵液50毫升，按如下文獻的的方法進行生物量的測定ZhengW， Zhang M， Zhao Y， Wang Y， Miao K， Wei Z. Accumulation of antioxidantphenolic constituents in submerged cultures of Inonotus obliquus. Bioresource Technology 2008， doi : 10.1016/j. biortech. 2008. 05. 002。 取步驟2)的加入鏈格孢霉菌細胞壁碎片(20、40和60微克/升)發(fā)酵0_12天的發(fā) 酵液及對照發(fā)酵液0. 5毫升，過濾，收集濾液，F(xiàn)olin-Ciocalteu法測定濾液中總酚的含量， 即為樺褐孔菌胞外總酚含量。Folin-Ciocalteu法參照如下文獻Singleton， V. L. ，Rossi， J.A. J. ，1965. Colorimetry of total phenolics withphosphomolybdic phosphotunstic acid reagents. American Journal of Enologyand Viticulture 16,144—158。
取步驟2)的加入鏈格孢霉菌細胞壁碎片(20、40和60微克/升)發(fā)酵0_12天的 發(fā)酵液及對照發(fā)酵液O. 5毫升，過濾，收集菌絲體，菌絲體用純凈水洗滌3次，70%丙酮超 聲冰浴提取30分鐘，然后在4800 X g重力條件下離心20分鐘，上清液真空濃縮，定容，按 Folin-Ciocalteu法測定胞內(nèi)總酚含量。樺褐孔菌生物量的測定方法同上。
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生物量的測定結(jié)果如圖1所示，表明鏈格孢霉菌細胞壁碎片對樺褐孔菌菌絲體生 物量沒有顯著的影響，培養(yǎng)結(jié)束后菌絲體生物量都在8-11克/升。 樺褐孔菌胞外總酚含量的測定結(jié)果如圖2所示，表明20、40和60微克/升的鏈格 孢霉菌細胞壁碎片能顯著提高樺褐孔菌胞外酚類化合物的含量。其中，加入40和60微克 /升的鏈格孢霉菌細胞壁碎片的樺褐孔菌發(fā)酵液中總酚含量在第11天達到最大值，分別是 211和321毫克/升，20微克/升鏈格孢霉菌細胞壁碎片的樺褐孔菌發(fā)酵液中總酚含量在 第10天達到最大值174毫克/升。 樺褐孔菌胞內(nèi)總酚含量的測定結(jié)果如圖3所示，表明20、40和60微克/升的鏈格
孢霉菌細胞壁碎片能顯著提高樺褐孔菌胞內(nèi)總酚的含量。在加入20、40和60微克/升的
鏈格孢霉菌細胞壁碎片后第11天樺褐孔菌胞內(nèi)總酚的含量達到最大值，分別為40. 44毫克
/克菌絲體碎片、68. 54毫克/克菌絲體碎片和53. 54毫克/克菌絲體碎片。 4)樺褐孔菌胞內(nèi)總酚清除2，2-聯(lián)苯-l-三硝基苯肼自由基的能力 2，2-聯(lián)苯-1-三硝基苯肼(DPPH)比色法測定樺褐孔菌胞內(nèi)總酚清除2， 2_聯(lián)
苯-1-三硝基苯肼自由基的能力。 2， 2-聯(lián)苯-1-三硝基苯肼(DPPH)比色法的步驟如下 2ml 0. lmM DPPH溶液和0. 9ml 0. 05mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7. 4)混合后， 分別加入不同培養(yǎng)時間的添加不同濃度鏈格孢霉菌細胞壁碎片獲得的樺褐孔菌胞內(nèi)總酚 0. lml，準確反應(yīng)30min，在517nm處測吸光值。對DDK1自由基的清除率(％)=[(空白吸 光度-樣品吸光度)/空白吸光度]X100/毫克總酚。以加入O. lml甲醇作為空白。
DPra比色法的測定結(jié)果如圖4所示，表明鏈格孢細胞壁碎片能顯著提高樺褐孔菌 總酚對DPra自由基的清除率，加入40微克/升鏈格孢細胞壁碎片能顯著提高樺褐孔菌胞
內(nèi)總酚對DPra自由基的清除率，在添加后的第十二天，對DPra的清除率達到250%左右。 5)樺褐孔菌胞內(nèi)總酚清除超氧陰離子自由基的能力 用如下方法測定樺褐孔菌胞內(nèi)總酚清除超氧陰離子自由基的能力取1. 5ml pH8. 2的50mmol/L Tris-HCl緩沖液，2. 7ml蒸餾水，分別加入不同培養(yǎng)時間的添加不同濃 度鏈格孢霉菌細胞壁碎片獲得的樺褐孔菌胞內(nèi)總酚O. lml，混勻后于25t:水浴20min，取出 后立即加入O. lml 25。C預(yù)熱的3mmol/L的鄰苯三酚，于420nm處測定吸光度，記為V樣，以 Tris-HCl緩沖液為空白，記為Vs。樺褐孔菌胞內(nèi)總酚對超氧陰離子自由基的清除率按每毫 克胞內(nèi)總酚對超氧陰離子清除率計算，即清除率％= (VS-V#)/VSX100% /毫克總酚。
樺褐孔菌胞內(nèi)總酚清除超氧陰離子自由基的能力的測定結(jié)果如圖5所示，表明鏈 格孢霉菌細胞壁碎片能顯著提高樺褐孔菌總酚對超氧陰離子自由基的清除率。
6)樺褐孔菌胞內(nèi)總酚清除清除羥基自由基的能力
用如下方法測定樺褐孔菌胞內(nèi)總酚清除羥基自由基的能力
取lml 150mmol/L的磷酸緩沖液和lml蒸餾水，混勻后作為空白；取lmll50mmo1/ L磷酸緩沖液、0. 2ml 7. 5mmol/L的鄰二氮菲、0. 2ml 7. 5mmol/L的FeS04、0. 6ml蒸餾水混 勻后作為未損傷管；取1. Oml磷酸緩沖液、0. 2ml鄰二氮菲、0. 2ml FeS04、0. 4ml蒸餾水和 0. 2ml H202 (0. 1 % )混勻后作為損傷管；取1. 3ml 150mmol/L磷酸緩沖液、0. 2ml鄰二氮 菲、0. 2ml FeS04、0. 2ml H202混勻，分別加入不同培養(yǎng)時間的添加不同濃度鏈格孢霉菌細 胞壁碎片獲得的樺褐孔菌胞內(nèi)總酚O. lml，混勻后作為樣品管。樺褐孔菌胞內(nèi)總酚對羥基自由基的清除率按每毫克胞內(nèi)總酚對0. 2ml 7. 5mmol/L的鄰二氮菲所產(chǎn)生的自由基的清 除率計算，即清除率％ =(樣品管吸光度-損傷管吸光度)/ (未損管吸光度-損傷管吸光 度)X100% /毫克總酚。 樺褐孔菌胞內(nèi)總酚清除羥基自由基的能力的測定結(jié)果如圖6所示，表明鏈格孢霉 菌細胞壁碎片能顯著提高樺褐孔菌總酚對超氧陰離子自由基的清除率。其中加入40微克/ 升鏈格孢霉菌細胞壁碎片對樺褐孔菌胞內(nèi)總酚清除羥基自由基的能力有顯著的提高，在加 入鏈格孢霉菌細胞壁碎片第十一天達到最大值240% ，加入20和60微克/升的鏈格孢霉菌 細胞壁碎片的對樺褐孔菌胞內(nèi)總酚清除羥基自由基的能力略有提高。
權(quán)利要求
一種培養(yǎng)樺褐孔菌的方法，是向樺褐孔菌的培養(yǎng)液中添加無菌的鏈格孢霉菌細胞壁碎片；所述鏈格孢霉菌細胞壁碎片是將鏈格孢霉菌菌絲體破碎后離心得到的。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述鏈格孢霉菌細胞壁碎片是用超聲 破碎鏈格孢霉菌菌絲體，然后在4800-10000Xg下離心獲得的，所述超聲破碎的條件為 250-300w、 5000-7000次/分鐘、30-45分鐘。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述樺褐孔菌的培養(yǎng)液是發(fā)酵72-96 小時的發(fā)酵液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述樺褐孔菌的培養(yǎng)液中所述鏈格孢霉 菌細胞壁碎片的濃度為20-60微克/升。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)中，通氣量為0. 3-0. 5立方 米/分鐘，攪拌速度為200-300轉(zhuǎn)/分鐘，溫度為25-28°C。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述鏈格孢霉為Alternariaalternata 或A. augustiouoidea或A. arborescens或A. argyranthemi或A. arbusti或A. blumeae或 A. brassicicola。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種發(fā)酵培養(yǎng)樺褐孔菌的方法。本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)樺褐孔菌的方法是向樺褐孔菌的培養(yǎng)液中添加無菌的鏈格孢霉菌細胞壁碎片；所述鏈格孢霉菌細胞壁碎片是將鏈格孢霉菌菌絲體破碎后離心得到的。本發(fā)明通過向樺褐孔菌的發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵液中加入鏈格孢霉菌細胞壁碎片來培養(yǎng)樺褐孔菌，獲得的樺褐孔菌胞內(nèi)和胞外的酚類化合物的積累和抗氧化活性明顯提高。本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)樺褐孔菌的方法中鏈格孢霉菌細胞壁碎片用量少，制備方法簡單，成本低廉，具有廣泛的實用價值和經(jīng)濟價值。
文檔編號C12P7/22GK101748159SQ200810227890
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月2日
發(fā)明者張梅梅, 繆康杰, 趙艷霞, 鄭維發(fā), 魏志文 申請人:徐州師范大學(xué)