專利名稱：一種新的抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗菌肽及其制備領(lǐng)域，特別涉及一種具有抗菌和抗癌活性的中 國(guó)林蛙基因編碼的抗菌肽及其制備方法和制藥方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近十年來(lái)，抗生素藥物的廣泛使用導(dǎo)致很多細(xì)菌和病毒對(duì)現(xiàn)有的抗生素都 產(chǎn)生了耐藥性，耐藥性病原株的擴(kuò)散使得抗生素的療效迅速下降甚至消失。因 此，尋找以全新的機(jī)制殺傷病原微生物，且不易形成耐藥性的新型抗生素己經(jīng) 成為目前研究的熱點(diǎn)之一。
抗菌肽是生物體經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有廣譜抗菌活性的小分子多肽， 一般
由20-60個(gè)氨基酸組成，分子量在1000-7000 Da左右，具有熱穩(wěn)定、水溶性好、
廣譜抗菌等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)部分細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)、病毒及癌細(xì)胞等均具有強(qiáng)大的殺
傷作用。這些基因編碼的抗菌肽的作用機(jī)理不同于傳統(tǒng)的抗生素，它不是通過(guò)
抑制細(xì)菌的代謝過(guò)程來(lái)殺死細(xì)菌，而是直接在細(xì)菌細(xì)胞膜上穿孔，使細(xì)胞內(nèi)的
活性物質(zhì)泄漏導(dǎo)致細(xì)菌死亡。因此，抗菌肽不存在使用后產(chǎn)生耐藥性的問(wèn)題，
有望成為新一代的抗菌、抗病毒、抗癌藥物。
林蛙(7 a"a c/ era/"em&)是我國(guó)東北地區(qū)長(zhǎng)白山麓藥、食兩用的珍貴蛙種。
林蛙是兩棲類動(dòng)物，生存環(huán)境復(fù)雜多樣，它們的皮膚在維持它們生存和適應(yīng)廣
闊棲息地中起著重要作用，為了適應(yīng)生存環(huán)境，蛙類的皮膚中分布了種類繁多、
具有特殊分子結(jié)構(gòu)、功能復(fù)雜的生物活性物質(zhì)，是一個(gè)巨大的生物活性分子資 源庫(kù)和藥物資源庫(kù)。
兩棲動(dòng)物皮膚抗菌肽是其先天防御系統(tǒng)中的重要組成成分，由基因編碼， 核糖體合成，10-50個(gè)氨基酸殘基組成，分子表面帶有正電荷，大都可形成兩親的a螺旋結(jié)構(gòu)。不同種屬兩棲動(dòng)物的抗菌肽在分子量，氨基酸組成，帶電性， 疏水性，空間結(jié)構(gòu)和抗菌譜等方面均各自不同。兩棲動(dòng)物皮膚抗菌肽大多都是 堿性多肽，容易與酸性的生物膜的層狀排列的脂類雙分子層相結(jié)合，依靠?jī)捎H 的a-螺旋結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)形成跨膜的離子通道，介導(dǎo)一系列的生物效應(yīng)，可以在不 損傷正常細(xì)胞的前提下對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒和癌細(xì)胞有抑殺作用，近年來(lái)成為 國(guó)際上動(dòng)物學(xué)、生理學(xué)、藥理學(xué)研究的熱點(diǎn)，作為新一代抗生素，倍受人們關(guān) 注。
抗菌肽從發(fā)現(xiàn)到局部使用已經(jīng)經(jīng)歷了相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間，但對(duì)它們的分子 結(jié)構(gòu)及遺傳效應(yīng)研究較少，使得多數(shù)的抗菌肽無(wú)法應(yīng)用于臨床。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的具有抗菌活性和抗癌活性的抗菌肽，以及該 多肽的編碼序列和制備方法及其在制藥中的應(yīng)用。
本發(fā)明的抗菌肽temporin-lCEa，是中國(guó)林蛙基因編碼的抗菌肽，其全序列 為Phe Val Asp Leu Lys Lys lie Ala Asn lie He Asn Ser lie Phe—AMIDATION,分子 量為1733道爾頓，可以形成明顯的兩親性a-螺旋結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明中國(guó)林蛙抗菌肽temporin=lCEa的編碼基因preprotemporin-lCEa，其 為從中國(guó)林蛙皮膚分離提取總RNA，純化mRNA, mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后，以cDNA為模板，GSPl/3'RACE Outer Primer為正反向引物，進(jìn)行第一次 PCR，以此產(chǎn)物為模板，GSPl/3'RACE Inner Primer為正反向引物，進(jìn)行第二次 PCR。
所用引物的核苷酸序列為
引物GSP1: 5'腸ATGTTCACCTTGAAGAAATCCCTG-3';3，RACE Outer Primer: TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT;
3'RACE Inner Primer: CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG。
PCR程序如下94°C 3 min， 94°C 30 s， 55°C 30 s， 72°C 1 min，共30個(gè)循 環(huán)，72'C延長(zhǎng)10min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)3 %瓊脂糖凝膠電泳分離并回收目的片段(見(jiàn) 圖1)，目的片段用BcaBEST Primer RV-M測(cè)序，得到中國(guó)林蛙皮膚抗菌肽 temporin-lCEa完整核苷酸序列，序列全長(zhǎng)315bp，其序列見(jiàn)序列表。
抗菌肽temporin-lCEa的基因工程的制備方法如下
1、 將編碼抗菌肽的基因preprotemporin-lCEa中的第144-192位核苷酸進(jìn)行 人工合成，并在合成的51bpDNA序列5'端加1個(gè)甲硫氨酸密碼子ATG，為54bp 的DNA片段；串聯(lián)連接6段54bp目的DNA片段后，在3'端加終止密碼子TAA， 最后在5，和3'端分別加入兩個(gè)酶切位點(diǎn)Smal/Hindlll,全長(zhǎng)339bp;將編碼抗 菌肽的該339bp的DNA片段通過(guò)PCR拼接成完整的雙鏈DNA，即為T(mén)6AMP 基因(見(jiàn)圖2);
2、 CAG556-5質(zhì)粒的制備將T6AMP基因的DNA與Vector DNA (pSIMPLE-19EcoRV/BAP)混合并用T4DNA連接酶連接，16。C保溫30分鐘，
連接液轉(zhuǎn)化至E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，得到含有目的抗菌肽基因T6AMP的 CAG556-5質(zhì)粒。
3、 目的基因亞克隆使用Sma 1/ Hind III對(duì)CAG556-5質(zhì)粒進(jìn)行酶切后， 取樣進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收約340bp片段后，命名為CTB651 insert
(見(jiàn)圖3);使用PshAI/HindIII對(duì)pET-42a ( + )質(zhì)粒進(jìn)行過(guò)夜酶切，取樣進(jìn)行 3%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收后，命名為CTB651載體(見(jiàn)圖4);用T4DNA 連接酶將CTB651 insert DNA與CTB651載體DNA進(jìn)行16。C連接后，將連接產(chǎn)物命名為CTB651 (見(jiàn)圖5)，熱轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli JM109中，涂布平板，過(guò) 夜培養(yǎng)菌體；從轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落，以T7/T7t為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取l PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)到陽(yáng)性克隆CTB651-6基因(見(jiàn)圖 6)。將CTB651-6號(hào)菌體植菌并提取質(zhì)粒后，用T7t引物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確。
4、 基因表達(dá)CTB651-6基因轉(zhuǎn)化至五.co/z'BL21(DE3)中，轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)，抽 提蛋白質(zhì)并進(jìn)行SDS-PAGE解析，CTB651-6基因在標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)條件下可以表達(dá)， 且有可溶表達(dá)，其分子量與預(yù)測(cè)的理論值43kD相符(見(jiàn)圖7)。
5、 目的蛋白純化用GE公司的GST-tag親和層析柱純化重組蛋白，將得 到的上清蛋白(約4mg)加到用平衡液(l X PBS)平衡好的柱子上，用5倍柱 體積平衡液沖洗柱子2次后，用IO倍柱體積洗脫液(50 mM Tris-HC1， 10 mM 還原型谷光甘肽，pH 8.0)洗脫柱子，并收集流出液，得到GST-T6AMP融合蛋 白，在GST-T6AMP融合蛋白溶液中加入Xa因子混合液，室溫下反應(yīng)16h,用GE 公司的GST-tag親和層析柱純化反應(yīng)液，得到T6認(rèn)P抗菌肽蛋白，T6AMP經(jīng)溴化 氫作用，斷裂為temporin-lCEa抗菌肽。
本發(fā)明的抗菌肽temporin-lCEa可采用固相化學(xué)的方法進(jìn)行制備，按照標(biāo)準(zhǔn) 的Fmoc固相肽合成程序進(jìn)行人工合成，合成肽經(jīng)反相HPLC(Vydac218TP1022 柱2,2cmx25cm)純化，采用乙腈/水/三氟乙酸系統(tǒng)洗脫，得到的合成肽純度高達(dá) 98%， HPLC圖如圖8;其MALDI-TOF和EPI質(zhì)譜分析圖見(jiàn)圖9。
抗菌肽的抗菌作用是通過(guò)本身所帶的正電荷與細(xì)菌表面的負(fù)電荷的吸引相 互接觸，然后通過(guò)疏水氨基酸形成跨膜離子通道，引起細(xì)胞內(nèi)容物流失，從而 造成細(xì)胞死亡。本發(fā)明的抗菌肽temporin-lCEa屬于陽(yáng)離子抗菌肽，含有堿性氨 基酸及部分疏水性氨基酸，兩親性使得螺旋的側(cè)面上形成了疏水矩，并與a-螺 旋在N端和C端形成的電荷偶極一起，對(duì)抗菌肽活性起關(guān)鍵作用，因此具有廣譜抗菌活性。
本發(fā)明的抗菌肽temporin-lCEa采用96孔板法和M TT比色法進(jìn)行了抗菌、 抗癌實(shí)驗(yàn)以及溶血試驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明temporin-lCEa對(duì)三種革蘭氏陽(yáng)性細(xì) 菌的抗菌活性好，抗癌活性最高，IC5。值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞發(fā)生溶血作用 時(shí)的藥物濃度，這說(shuō)明在不破壞哺乳動(dòng)物細(xì)胞完整性的情況下，它可以抑制部 分革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，并能有效的抑制乳腺癌和宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，顯示出作為 新型抗生素和抗腫瘤藥物的應(yīng)用前景。


圖1中國(guó)林蛙皮膚抗菌肽基因preprotemporin-lCEa的瓊脂糖凝膠電泳圖2人工合成的6個(gè)串聯(lián)中國(guó)林蛙肽temporin-lCEa基因T6AMP;
圖3表達(dá)載體pET42a PshAI/Hind III酶切后3%瓊脂糖凝膠電泳圖
Ml: mind III DNA Marker;1 :pET42a-PshAI/Hind III;
圖4質(zhì)粒CAG556-5經(jīng)Sma I/Hind III酶切后3%瓊脂糖凝膠電泳圖 Ml: XHind III DNA Marker;2: CAG556隱5-Sma 1/ Hind HI;M2: DNA Marker DL2000; 圖5目的基因T6AMP與表達(dá)載體pET42a連接示意圖6陽(yáng)性克隆CTB651-6擴(kuò)增產(chǎn)物的3%瓊脂糖凝膠電泳圖
M: DNA Marker DL2000;卜3PCR產(chǎn)物；
圖7基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白SDS-PAGE圖
M:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1-3:載體pET42a全細(xì)胞蛋白、可溶蛋白和包涵體部分；3-6:重組 載體pET42a-T6AMP全細(xì)胞蛋白、可溶蛋白和包涵體部分；
圖8抗菌肽temporin-lCEa固相化學(xué)合成的HPLC圖； 圖9抗菌肽temporin-lCEa固相化學(xué)合成的MS圖10中國(guó)林蛙皮膚總RNA的l。/。瓊脂糖凝膠電泳圖 M: DNA Marker DL2，000 1:中國(guó)林蛙皮膚總RN.A。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例子進(jìn)一步解釋本發(fā)明的內(nèi)容，但并不用以限制本發(fā)明。 實(shí)施例l
抗菌肽temporin-lCEa基因preprotemporin-lCEa的克隆
1、 引物的設(shè)計(jì)
根據(jù)GenBank中蛙類皮膚抗菌肽基因前體信號(hào)肽N-端的氨基酸序列，設(shè)計(jì)并 合成了 3 'RACE基因特異性引物GSP 1:5 '-ATGTTCACCTTGAAGAAATCCCTG-3 '， 3'RACE Outer Primer: TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT, 3'RACE Inner Primer: CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG，引物由日本TaKaRa大連公司合成。
2、 抗菌肽基因的cDNA克隆
(1) 從中國(guó)林蛙皮膚中提取總RNA:取中國(guó)林蛙背部皮膚，在液氮中凍干。 稱取300mg凍干皮膚，加RNAiso溶液10mL， (TC勻槳30分鐘；勻漿液中加入等 體積的酚/氯仿溶液，劇烈震蕩約10分鐘，離心(12000rpm， 4°C) IO分鐘，去 除蛋白質(zhì)沉淀；取卜.清液加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，離心
(12000rpm， 4°C) IO分鐘，沉淀用75%乙醇清洗1-2次，吹干，獲得中國(guó)林蛙皮 膚總RNA。將10iig中國(guó)林蛙皮膚總RNA溶于10uLDEPC水中，1%瓊脂糖凝膠 電泳，可見(jiàn)清晰的18S和28S兩條帶，比值大于l (見(jiàn)圖IO)，表明總RNA完整性 良好。
(2) RT-PCR和3，RACE:取l P g上述中國(guó)林蛙皮膚總RNA，采用TaKaRa公司 3'-Ful1 RACE Core Set Ver.2.0試劑盒合成cDNA。首先按照下列反應(yīng)體系進(jìn)行反 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA:
中國(guó)林蛙皮膚總RNA l嗎 3' RACE Adaptor (5,) 1 (il5xM-MLV Buffer 2pl
dNTP Mixture (10mM each) 1 pi
RNase Lnhibitor (40U/ 1) 0.25nl
Reverse Transcriptase M-MLV (Rnase H—) (200，) 0.25^1
RNase Free dH20 4.5pl
Total ,
42t:反應(yīng)60分鐘后，7(TC變性反應(yīng)15分鐘，獲得cDNA溶液。以獲得的cDNA為模 板，進(jìn)行套式PCR反應(yīng)。首先進(jìn)行outerPCR反應(yīng)，按照下列反應(yīng)體系進(jìn)行
上述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液 2nl
lXcDNA Dilution Buffer II 8)il
Gene Specific Outer Primer (10 nM) 2 pi
3， RACE Outer Primer (10nM) 2pl
10 X LA PCR Buffer II (Mg2+Free) 化l
Mgcl2 (25 mM) 3jil
TaKaRa LA Taq (5U/W)*1 0.25nl
dFT20 28.75(il
Total 50nl
PCR程序如下:94°C 3min， 94°C 30 s， 55°C 30 s， 72°C 1 min，共30個(gè)循環(huán)，
72'C延長(zhǎng)10min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行i皿er PCR，按照下列反應(yīng)體系進(jìn)行
Outer PCR產(chǎn)物 1 W
dNTP Mixture (2.5mM each) 8 )il
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free) 5…
Mgcl2(25mM) 5 pi
TaKaRa LA Taq (5，) 0.5 ^il
Gene Specific Lnner Primer (10 (xM) 2 (xl
3 ， RACE Lnner Primer (10 pM) 2 pi
dH20 26.5 pi
Total 50 (J
PCR程序如下:94。C 3min， 94°C 30 s， 55°C 30 s, 72°C 1 min，共30個(gè)循環(huán)， 72"C延長(zhǎng)10 min。取10 u 1 PCR產(chǎn)物經(jīng)3 %瓊脂糖凝膠電泳分離并回收目的片段， 回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，熱轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞JM109中，37X:過(guò)夜培養(yǎng)， 挑選陽(yáng)性菌落植菌，提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行DNA測(cè)序。
3、抗菌肽基因的序列分析
取其中cDNA克隆使用BcaBEST Primer RV-M測(cè)序，得到中國(guó)林蛙皮膚抗菌 肽temporin-1 CEa基因preprotemporin-1 CEa完整核苷酸序列。BcaBEST Primer RV-M 的序列為GAGCGGATAA CAATT TCACACAGG?；虻臏y(cè)序結(jié)果如序列表。
實(shí)施例2抗菌肽temporin-lCEa的基因工程的制備
一、人工合成基因
1、 DNA片段的制作
目的序列的DNA片段為(分子量:51bp) : 5'-TTTGTAGATTTGAAAAAGA TTGCAAATATTATCAATTCTATATTTGGAAAA-3 ，。在目的序列5 ，端加1個(gè)甲 硫氨酸密碼子ATG，為54bp的DNA片段。串聯(lián)連接6次后，在3，端加終止密碼子 TAA，最后在5，和3'端分別加入兩個(gè)酶切位點(diǎn)Smal/Hindin，全長(zhǎng)339bp。合成 339bp單鏈小片段DNA，再通過(guò)PCR方法，把單鏈小片段DNA拼接成一條完整的 雙鏈DNA片段，稱作T6AMP基因，見(jiàn)圖2。 PCR程序如下94°C3min， 94°C 30 s， 55。C30s， 72。C 1 min，共30個(gè)循環(huán)，72。C延長(zhǎng)10min。
2、 連接及轉(zhuǎn)化
在小離心管中加入2^1 T6AMP DNA (約200 ng ) 、載體DNA (pSIMPLE-19EcoRV/BAP)(約50 ng)和&0 2^1， 16。C保溫30分鐘，連接液 全量轉(zhuǎn)化至E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞。
3、陽(yáng)性克隆檢測(cè)及質(zhì)粒DNA的提取 對(duì)平板上的菌落用M13-47/RV-M引物進(jìn)行PCR， PCR程序同上；檢測(cè)所含質(zhì) 粒中插入片段的長(zhǎng)度大小，CAG556-5菌落中含有目的長(zhǎng)度的插入片段。提取 CAG556-5質(zhì)粒DNA，進(jìn)行DNA序列測(cè)定。使用儀器為Applied Biosystems373A 全自動(dòng)核苷酸序列測(cè)定儀，測(cè)序引物為BcaBESTPrimerRV-M (GAGCGGATA ACA ATT TCA CAC AGG)、BcaBEST Primer M13-47(CGC CAG GGT TTT CCC AGTCACGAC ) 、 BcaBEST Primer pMDl8 F (GCC TCT TCG CTA TTA CGC CA )。測(cè)序結(jié)果CAG556-5質(zhì)粒中的插入片段完全正確。
二、目的基因亞克隆使用CAG556-5質(zhì)粒，利用Sma I/Hind III將目的基因片段亞克隆至 pET42a-PshAI /Hind III表達(dá)載體中，并測(cè)序驗(yàn)證。
使用PshAI / Hind ni對(duì)pET-42a質(zhì)粒進(jìn)行過(guò)夜酶切，取5(al進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳 分離，使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (Code No. DV805A) 切膠回收目的片段，命名為CTB651載體。使用Sma 1/Hind 11I對(duì)CAG556-5質(zhì)粒 進(jìn)行酶切，取5nl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (Code No. DV805A)切膠回收約340bp片段后，命名為CTB651插入 片段。使用TaKaRa DNA Ligation Kit (Code No. D6022)中的SolutionI，將插 入片段DNA與載體DNA進(jìn)行16'C連接后，將連接產(chǎn)物命名為CTB651 ，熱轉(zhuǎn)化 至E.coli感受態(tài)細(xì)胞JM109 (CodeNo.D9052)中，涂布平板，過(guò)夜培養(yǎng)菌體。
從轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落，以T7/T7t為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5^ilPCR擴(kuò)增 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)結(jié)果表明存在陽(yáng)性克隆。
將CTB651-6號(hào)菌體植菌并提取質(zhì)粒后，用T7t引物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確。 檢測(cè)及測(cè)序引物序列T7: 5，-TAATACGACTCACTATAGGG- 3， (20nt)
T7t: 5，- GCTAGTTATTGCTCAGCGG - 3， (19nt)
三、CTB651-6基因表達(dá)
1、 轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)
挑取CTB651-6單菌落至2ml含有50mg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37。C過(guò)夜 培養(yǎng)。取培養(yǎng)菌液100pl加入5ml含有50mg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37"C培養(yǎng) 至OD6oonm值約為0.55-0.7。添力口100mM IPTG 5(Vl使其終濃度為lmM， 37'C誘導(dǎo) 3hr， OD,nm吸光值為0.988。
2、 蛋白質(zhì)抽提
培養(yǎng)液4。C 6,500rpm離心10min，收獲沉淀菌體。菌體添加PBS緩沖液達(dá)到10OD/ml,混勻，取200nl進(jìn)行超聲2-3次，每次10秒，直至液體透明。取50pl作 為全細(xì)胞樣品。剩余部分20,000xg (約14，000rpm) 4"C離心5分鐘，得上清(可 溶性)液和沉淀，沉淀加15(HilPBS緩沖液混勻。取各抽提液(全蛋白、上清、 沉淀)10nl，加入2.5pl5xSDS上樣緩沖液，95。C加熱10分鐘，上樣進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。電泳條件(c.c.) 20mA/枚、約90分；12 %聚丙烯酰胺；1(Hil/wdl。結(jié) 果表明CTB651-6基因在標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)條件下可以表達(dá)，且有可溶表達(dá)，其分子量與 預(yù)測(cè)的理論值43kD相符。 四、重組蛋白純化
用GE公司的GST-tag親和層析柱純化重組蛋白。具體操作方法如下將得 到的24ml上清蛋白在過(guò)柱前用0.45 um的濾膜過(guò)濾。用平衡液(l X PBS)平 衡，流速1-2 ml/min (1 ml column)。用注射器吸取樣品液20ml (約4mg)加 到柱子里，為取得最佳效果，使用低流速0.2-1 ml/min (1 ml column)，用 5倍柱體積平衡液洗脫2次，流速1 - 2 ml/min (1 ml column)，每次臨近結(jié) 束時(shí)收集1ml平衡液測(cè)OD280值。用10倍柱體積洗脫液(50 mM Tris-HCl， 10 mM還原型谷光甘肽，pH 8.0)洗脫柱子，并收集流出液，得到GST-T6AMP融合 蛋白。流速l -2 ml/min (1 ml column)。取20mLGST-T6AMP融合蛋白溶液(蛋 白含量4mg)，加入lmL Xa因子混合液(40 ul Xa因子加960 tUXa因子斷裂 緩沖液)，室溫F反應(yīng)16h。用GE公司的GST-tag親和層析柱純化反應(yīng)液。具 體操作方法如上面相同將得到的反應(yīng)液用注射器加到用平衡液(l X PBS)平 衡過(guò)的柱子里，用5倍柱體積平衡液洗脫2次，流速l-2ml/min (1ml column)， 然后用IO倍柱體積洗脫液(50 mM Tris-HCl， 10 mM還原型谷光甘肽，pH 8.0) 洗脫柱子，并收集流出液，得到T6AMP抗菌肽蛋白。在T6雄P抗菌肽蛋白溶液 中加入CNBr溶液，室溫下作用2小時(shí)，得到temporin-lCEa混合溶液，冷凍干燥后，得到temporin-lCEa抗菌肽粉。 實(shí)施例3
中國(guó)林蛙抗菌肽temporin-lCEa的固相合成
按照標(biāo)準(zhǔn)Fmoc固相肽合成程序人工合成中國(guó)林蛙抗菌肽temporin-lCEa (PheValAspLeuLysLysIleAIaAsnllelleAsnSerllePhe-AMIDATION)合成肽經(jīng)反相 HPLC(Vydac 218TP1022柱2.2 cmx25 cm)純化，采用乙腈/水/三氟乙酸系統(tǒng)洗 脫，MALDI-TOF和EPI質(zhì)譜分析?？咕暮铣捎杀本┵惏偈⒐?SBS Genetech
Co"Ltd. Bejing， China)完成。
實(shí)施例4
抗菌肽的藥理活性 1、抗菌活性的測(cè)定
按照Conlon等人方法(Conlon JM， e/ a/.awd丄eftera， 2006, 13(4): 411-415.)，在96孔板中分別加入不同濃度(1.0至U-100 pmol/L)的抗菌 肽溶液50 ^L，再在各孔中分別加入處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的的4種細(xì)菌五^/2en'c/n'" co/z', 5"鄉(xiāng)A[y/ococcws awrews, 5a"7/ws cerews, ^e/ tococcws aga/ac"ae菌液各50 pL，最終菌量為每孔5xl()SCFU/mL。最后在每孔中加入10 jiL 0.5% TTC溶液， 振蕩lmin使其混勻，加蓋后放入37'C溫箱中孵育24 h，觀察顏色變化，讀取 各最低抑菌濃度值(MICs)。有菌生長(zhǎng)則孔內(nèi)呈紅色，無(wú)菌生長(zhǎng)則孔內(nèi)無(wú)顏色變 化。MICs定義為無(wú)菌生長(zhǎng)的抗菌肽的最低濃度。液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，慶 大霉素作為陽(yáng)性對(duì)照。
表1中國(guó)林畦皮膚抗菌肽temporin-lCEa的最小抑菌濃度
MicroorganismsM1C (nmol/L)
14.4
14.4
14.4
>100
temporin-lCEa只對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有抑制作用，對(duì)金黃葡萄球菌、蠟狀芽孢 桿菌和乳鏈球菌抑制作用較強(qiáng)，MIC值均為14.4pmol/L;2、 抗癌活性的測(cè)定
米用MTT比色法(Sargent JM. J ecey7f Afes〃7ts C朋car j esearc/ , 2003， 161: 13.)，在96孔板中分別加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7和HeLa 細(xì)胞懸液200 uL， 37X:培養(yǎng)24 h后加入4 u L 5種不同濃度(1.0-200 umol/L)的抗菌肽溶液，繼續(xù)培養(yǎng)20、 44、 68 h后加入20 uL 5 mg/mL 的MTT溶液，孵育4小時(shí)終止培養(yǎng)，棄去上清，加150 u L DMSO振蕩10 min。 用免疫酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)570 nm)測(cè)定各孔的吸光值，計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC5。) 值。ICs。定義為腫瘤細(xì)胞半致死率的抗菌肽濃度。培養(yǎng)液組作為陰性對(duì)照， 絲裂霉素組作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果見(jiàn)表2。
3、 抗菌肽溶血性的測(cè)定
將小鼠紅細(xì)胞用0.9%氯化鈉溶液配成2%的混懸液，取l mL紅細(xì)胞混懸液分 別加入7種不同濃度的抗菌肽溶液(終濃度為1.0-500 )imol/L)，輕混后置37'C的 恒溫箱中溫育。3 h后離心，取上清，測(cè)545 nm吸光值，計(jì)算溶血率和LDso值。 溶血率(％)=(試驗(yàn)管吸光度一陰性對(duì)照管吸光度)/ (陽(yáng)性對(duì)照管吸光度一 陰性對(duì)照管吸光度)xl00% 。 0.9%生理鹽水作為陰性對(duì)照，蒸餾水作為陽(yáng)性 對(duì)照。LD5。值為溶血率達(dá)50。/。時(shí)的抗菌肽溶液的濃度。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2中國(guó)林蛙皮膚抗菌肽temporin-lCEa的抗癌活性及溶血活性
Cell linesIC50 (|xmol/L)
8
40
丄￡>50160
由表2可知temporin-lCEa對(duì)MCF-7和HeLa細(xì)胞均有不同程度的抑制 作用。在LD5。值范圍內(nèi)，temporin-lCEa對(duì)兩種癌細(xì)胞均有明顯的抑制作用，作 用MCF-7細(xì)胞的ICs。值僅為8 pmol/L，抑制作用遠(yuǎn)強(qiáng)于HeLa細(xì)胞，不會(huì)對(duì)哺 乳動(dòng)物的紅細(xì)胞產(chǎn)生溶血作用。序列表
SEQUENCE LISTING <110>遼寧師范大學(xué)
<120> —種新的抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用
<130>
<160> 2
<210> 1
<211> 315
<212> DNA
<213> 中國(guó)林蛙(Ranachensinensis) <400> 1
atgttcacct tgaagaaatc cctgttgctc cttttcUcc ttgggaccat caacUatct 60 ctctgtgagg aagagagaga cgccgatgag gaagaaagaa gagatgatcc cgaagaaagg 120 gctgUgaag tggaaaaacg atttgtagat ttgaaaaaga ttgcaaatat tatcaattct 180 atatttggaa aataacccca aaattgtaaa aettttgaaa tgaaattgga aatcatctga 240 tgtggaatat catttagcta aatgcatatc agatgtctta caaaaaataa agatatcaca 300 tgcaaaaaaaaaaaa 315 <210> 2 <211> 15 <212> PRT
<213> 中國(guó)林蛙(Rana chensinensis)<220>
<221> AMIDATION <222> (15) <400> 2
Phe Val Asp Leu Lys Lys lie Ala Asn lie lie Asn Ser lie Phe-AMIDATION 1 5 10 1權(quán)利要求
1、一種中國(guó)林蛙基因編碼的抗菌肽temporin-1CEa，其特征在于多肽的全序列為Phe Val Asp Leu Lys Lys Ile Ala Asn Ile Ile Asn Ser Ile Phe-AMIDATION，分子量1733道爾頓。
2、 中國(guó)林蛙抗菌肽temporin-lCEa基因核苷酸序列，其特征在于cDNA的序列 全長(zhǎng)315bp，其自5'端至3，端的序列見(jiàn)序列表。
3、 如權(quán)利要求2所述的中國(guó)林蛙抗菌肽temporin-lCEa基因核苷酸序列，其特 征在于編碼中國(guó)林蛙成熟抗菌肽為第144-192位核苷酸，其核苷酸序列為 TTTGTAGATTTGAAAAAGATTGCAAATATTATCAATTCTATATTTGGAAAA。
4、 一種權(quán)利要求1所述的抗菌肽temporin-lCEa的基因工程制備方法如下(1) 人工合成T6AMP基因?qū)⒕幋a權(quán)利要求1所述的抗菌肽的基因中的 第144-192位核苷酸進(jìn)行人工合成，在序列5'端加1個(gè)甲硫氨酸密碼子ATG， 串聯(lián)連接6段后，在3，端加終止密碼子TAA，最后在5，和3'端分別加入兩個(gè)酶 切位點(diǎn)Smal / HindIII，并將該339bp的DNA片段拼接成雙鏈DNA，即為T(mén)6AMP 基丙；(2) 基因工程菌的制備利用Sma I/Hind III將T6AMP基因片段亞克隆至 pET42a-PshAI /Hind III表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化至五.co// BL21(DE3)中，得到高效表 達(dá)的中國(guó)林蛙抗菌肽temporin-lCEa的基因工程菌；(3) 目的蛋白純化用GST-tag親和層析柱純化重組蛋白，得到 temporin-lCEa抗菌肽。
5、 權(quán)利要求1所述的抗菌肽temporin-lCEa在制備抗菌和抗癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用，屬于抗菌肽及其制備領(lǐng)域。本發(fā)明是從中國(guó)林蛙皮膚總RNA中克隆出新的抗菌肽temporin-1CEa基因，其全部DNA序列如序列表所示。該基因中第144-192位核苷酸編碼成熟抗菌肽temporin-1CEa，其全序列為Phe Val Asp Leu Lys Lys Ile Ala Asn Ile Ile Asn Ser IlePhe-AMIDATION，分子量為1733道爾頓，該抗菌肽temporin-1CEa可通過(guò)氨基酸合成儀或基因工程方法進(jìn)行制備，其具有顯著的抗菌抗癌活性，并且不會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞產(chǎn)生溶血作用，可用于制備抗菌和抗癌藥物。
文檔編號(hào)C12N15/70GK101418039SQ20081022948
公開(kāi)日2009年4月29日 申請(qǐng)日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者尚德靜 申請(qǐng)人:遼寧師范大學(xué)