專利名稱：絲氨酸蛋白酶抑制物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及絲氨酸蛋白酶抑制物的長(zhǎng)效重組，且涉及其制備方法。
背景技術(shù)：
絲氨酸蛋白酶抑制物(TFPI)，分子量約40kd，前體有304個(gè)氨基酸，成熟蛋白則有276個(gè)氨基酸，后者由氨基末端、三個(gè)串聯(lián)的K皿itz型結(jié)構(gòu)域和梭基末端組成，動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)證實(shí)TFPI能有效治療嚴(yán)重感染、濃毒血癥、彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)、多臟器功能衰竭(MOF)、高凝狀態(tài)、血栓栓塞性疾病和腫瘤等具有良好療效，是一種具有良好應(yīng)用前景的蛋白質(zhì)。大多數(shù)TFPI由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌，平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞和纖維母細(xì)胞在一定條件下也可產(chǎn)生TFPI 。無(wú)論是人體自身的TFPI，還是給予的重組野生型TFPI，它的半衰期都很短，只有2分鐘左右，會(huì)很快從血液中清除。TFPI進(jìn)入血液循環(huán)后，迅速與肝細(xì)胞膜上的LRP結(jié)合，然后被降解和代謝。半衰期短是TFPI在發(fā)揮治療作用時(shí)最大的缺點(diǎn)，必須連續(xù)72 — 96小時(shí)給藥才能保持療效，每個(gè)療程約需160 —犯omg，如此大的劑量給病人帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，延長(zhǎng)TFPI的半衰期，減少其用藥量，是急需解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供半衰期長(zhǎng)，具有良好抗凝功能的絲氨酸蛋白酶抑制物。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為，本發(fā)明首先在計(jì)算機(jī)工作站上模建了 TFPI和LRP分子，然后將兩者進(jìn)行對(duì)接，發(fā)現(xiàn)TFPI梭基末端的某些關(guān)鍵氨基酸在TFPI和LRP的相互作用發(fā)揮關(guān)鍵作用。本發(fā)明將TFPI梭基末端267 — 304區(qū)域內(nèi)的某些氨基酸進(jìn)行不同程度的替代和缺失突變后，兩者的結(jié)合能力出現(xiàn)了不同程度的下降，所述LTFPI的半衰期較TFPI延長(zhǎng)10倍以上，并具備抗組織因子、凝血因子V工工/Vila和凝血因子X(jué)/Xa功能。其中將269、252、288和289位賴氨酸全部替換為丙氨酸的突變效果為佳。
本發(fā)明還提供了制備LTFPI的方法，包括制備至少包含表達(dá)生物活性的LTFPI編碼序列部分的cDNA，在適合表達(dá)的載體中克隆CDNA片斷，用該載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，在適于表達(dá)該cDNA片斷的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，以及從培養(yǎng)物中回收和純化所需LTFPI。
本發(fā)明中LTFPI基因的制備包括經(jīng)過(guò)點(diǎn)突變后的基因，與相關(guān)質(zhì)粒重組，DNA限制性內(nèi)切酶酶切鑒定篩選陽(yáng)性克隆，核普酸序列分析驗(yàn)證基因是否正確。將本發(fā)明的LTFPICDNA片斷與表達(dá)載體重組，形成重組表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明不限于特定的表達(dá)質(zhì)粒，包括真核表達(dá)載體pP工CgK或原核表達(dá)載體pET28或pLY — 4。 本發(fā)明使用pET28原核表達(dá)載體，上述重組表達(dá)載體可按常規(guī)方法導(dǎo)入適宜宿主細(xì)胞，包括原核表達(dá)宿主細(xì)胞是BLZI或JF1125和真核表達(dá)宿主細(xì)胞GS115。本發(fā)明使用大腸桿菌BLZI作為特定的宿主細(xì)胞，本發(fā)明的表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在于宿主細(xì)胞的胞體中，破菌分離包涵體，高濃度尿素或鹽酸肌溶解包涵體，分離純化LTFPI，經(jīng)適當(dāng)復(fù)性后即獲得有活性的LTFP。
以上技術(shù)方案中所有基本分子生物學(xué)操作均參照〈分子克隆實(shí)驗(yàn)指南>。
本發(fā)明的有益效果 本發(fā)明應(yīng)用基因工程方法對(duì)LTFPI進(jìn)行生產(chǎn)，所得產(chǎn)品具有高效的抗凝、抗血小板和抗炎功能，與野生TFPI性質(zhì)比較表明，LTFPI半衰期明顯延長(zhǎng)，其余功能類似。LT即工為注射劑和非注射劑研究提供了原料，可用于預(yù)防和治療嚴(yán)重感染性疾病和血栓栓塞性疾病等。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l (1) TFPI和LRP在計(jì)算機(jī)工作站上的對(duì)接與分析 應(yīng)用InsightH軟件，在計(jì)算機(jī)工作站上對(duì)TFPI和L即進(jìn)行對(duì)接，尋找到了 TFP工梭基末端269、282、288和289位賴氨酸是兩者相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。
(2)LTFPI的設(shè)計(jì)、制備和性質(zhì)鑒定將TFPI梭基末端269、282、288和289位賴氨酸替換為丙氨酸。序列使用PCR點(diǎn)
突變獲得基因，與PUC19重組，酶解篩選陽(yáng)性克隆，核普酸序列分析證實(shí)基因序列正確。然
后將LTFP工基因切出，與原核表達(dá)載體pET28重組，構(gòu)成原核表達(dá)質(zhì)粒rLTFP工一 pET28。
轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒，以相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶解鑒定，獲得特征性片斷，證實(shí)獲得
陽(yáng)性克隆。 實(shí)施例2 LTFP工基因獲取方法如下 (1)采用重疊延伸法，選用pET28多克隆位點(diǎn)Notl后400bp的一段序列設(shè)計(jì)下游引物5'〉CCA CTA CGT GAA CCA TCA CCC TAA TCA AGT〈3'重疊延伸引物1 :其中斜體密碼從左到右依次為K254A，K241A。 5'> 口尤AAT TAG GCC TCC TTI'TGA '隊(duì)T TCT TTG GATGAA ACC '況，TTT ACATGC CCT CAG ACA〈3'重疊延伸引物2 :斜體密碼從左到右依次為K254A，K260A，K261A。 5， >AAA GGA GGC CTA ATT優(yōu)谷ACC AAA AGA AAA AGA隴谷優(yōu)若CAGAGA GTG AAA ATA GCA TAT〈3'以質(zhì)粒pET28 — TFPI為模板，上游引物與重疊延伸引物1配對(duì)，下游引物與重疊延伸引物2配對(duì)，分別pCR，回收產(chǎn)物后用作中間體，加上游引物和下游引物做PCR， Ncol+Notl雙酶切PCR產(chǎn)物，即得K241A， K254A， K260A， K261A突變的LTFPIO限制性內(nèi)切酶購(gòu)自BRL公司，大腸桿菌JM109、質(zhì)粒puC19Invitrogen公司。pLy4的構(gòu)建按已知方法進(jìn)行。 (2)篩選高拷貝高效表達(dá)菌株 將質(zhì)粒rLTFP I — pLy4電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，使其與大腸桿菌染色體發(fā)生重組，
G418篩選高效表達(dá)菌株。 宿主菌大腸桿菌BL21 培養(yǎng)液LBK Kan工作濃度30ug/ml IPTG工作濃度lmM ①挑單克隆菌落接種至5ml LBK medium, 37oC X 250rpm至0D600 = 1 — 2。②接種至500ml LBK medium, 37°C x250rpm至0D6Qo = 1 — 2。
②接種至25L LBK medium，37。Cx 600rpm，溶氧50% ，至0D6的=0. 6 — 0. 5。
加IM IPTG至終濃度I lnM，誘導(dǎo)表達(dá)3h。
③4。C x4000rpmx35min，收集菌體。
50mM Tri 5. HCI pHS. 0洗滌菌體1次，收集菌體，稱重。 ⑤挑取上述陽(yáng)性克隆接種于IOml低營(yíng)養(yǎng)液BMG巨.34% YNB， (4x10 — 5)生物 素，1%甘油習(xí)中，30°。決速振遙(250RPM)，培養(yǎng)過(guò)夜。次日測(cè)定光密度0，離心棄除BMG培 液，用無(wú)菌水洗滌后用B匪培液巨.34% YNB， (4x10 — 5)生物素，O. 5%甲醇習(xí)稀釋至0D6 訓(xùn)=1。每天補(bǔ)加體積百分?jǐn)?shù)為0. 5%的甲醇。甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)7天，每隔24小時(shí)取樣lml， 測(cè)定抗TF/Fvlla(rhTFPI — API)或抗Fxa(rhTFPI — APZ)活性。離心棄沉淀，上清于一 2(TC保存。直接取培液上清與Zx上樣緩沖液等體積混合后取20ul上樣，作還原性SDS — 以GE電泳?？捡R斯亮藍(lán)R — 250染色后，Pharmacia工magenastervDs掃描定純度、分子 量?？梢?jiàn)誘導(dǎo)后上清液在分子量約6kd處有一濃集的條帶，經(jīng)掃描，目的蛋白約占上清總蛋 白的84% :結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物rhTFPI — API有明顯的抗TF/FVlla作用，rhTFPI — APZ有 明顯的抗FXa作用。上述還原性SDS — PA(況按Lael' nlnli方法進(jìn)行。
(3)發(fā)酵表達(dá)工程菌 按上述篩選高表達(dá)菌株作為工程菌，然后以5L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵。從一7(TC 深低溫冰箱中取出種子菌，室溫下解凍，在種子菌培養(yǎng)室IOO級(jí)潔凈度條件下劃YPD平板， 3(TC溫箱培養(yǎng)2 — 3天。從平板上挑取單菌落，同樣在100級(jí)潔凈度條件下接種于IOml BMG 培養(yǎng)液中，3(TC培養(yǎng)過(guò)夜，此為一級(jí)種子液。再將一級(jí)種子液加入140ml培養(yǎng)液中，3(TC培 養(yǎng)6 — 8小時(shí)，直至0D6。。 =6，此為二級(jí)種子液。種子菌接入后，自然增值，待基礎(chǔ)培養(yǎng)基 中預(yù)加的甘油被耗盡以后，開(kāi)始補(bǔ)充甘油，補(bǔ)充速度16ml/L/h，待0D60。達(dá)到120左右，停 止補(bǔ)加甘油。待培養(yǎng)液中甘油全部耗盡后，開(kāi)始甲醇誘導(dǎo)。甲醇補(bǔ)料速度從lml/L/h逐漸 升高至12ml/L/h，以后一直維持此速度。本發(fā)明的發(fā)酵技術(shù)是用低鹽培養(yǎng)基擴(kuò)增工程菌，誘 導(dǎo)前用含微量元素的甘油溶液進(jìn)行補(bǔ)料，到達(dá)一定菌體濃度后用含微量元素的甲醇溶液進(jìn) 行誘導(dǎo)表達(dá)。 甲醇誘導(dǎo)40h以后，停止發(fā)酵，從發(fā)酵罐中立即放出菌液進(jìn)行離心，分離沉淀菌 體，收集上清進(jìn)行純化。上清中rhTFPI — API對(duì)TF/FVlla的抑制常數(shù)達(dá)Ki = 0. 12uM， rhTFP工一 APZ對(duì)FXa的抑制常數(shù)達(dá)Ki = 0. 09uM。發(fā)酵參數(shù)為溫度30°C ，氧容量控制在 35±5%，pH = 5，攪拌速度與D0連動(dòng)。
(4)超濾濃縮脫鹽將離心所獲上清以l : 10稀釋，經(jīng)Mi llipore超濾裝置(NMWL :3000，Millipore 公司)超濾濃縮至1. OL，脫去無(wú)機(jī)鹽。
(5)凝膠過(guò)濾 S印hadexG — 50 (Pharmacia公司)柱用20nunol/L PB (pH7. 4)平衡后，將超濾濃 縮液上樣，加樣時(shí)注意勿攪動(dòng)S印hadexG — 50膠面。然后用PB洗脫，流速10ml/min，收集 活性峰。 (6)Q — S印harose Fast Flow柱層析 以1(H咅體積的50mmol/L PB(pH 7. 4)平衡Q — S印harose F. F. (Pharmacia公司) 柱，凝膠過(guò)濾后收集的抗凝活力部分以SOml/min的速率將其吸附到Q — S印harose F. F.柱上。用PB洗柱直至0DZ、《)達(dá)O. OO，然后用0 — lmol/L NaCI (50Inlnol/L PB PH 7.4)線性梯度洗脫，收集有抗凝活性部分，分裝，冷凍干燥，一 4(TC保存。
本發(fā)明的色譜操作均為常規(guī)操作。
(7)純度鑒定及分子量測(cè)定 樣品進(jìn)行16. 5% SDS —PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)R — 250染色后，Pharmacia工nagemaster⑧VDS掃描測(cè)定純度、分子量。所得產(chǎn)品純度97%以上，分子量約6kD。
(8)抗TF/FVlla活性測(cè)定使用稀釋后的凝血酶原時(shí)間(d 1 1 utedprothrombintime， dPT)測(cè)定，方法如下。 將凝血活酶干粉試劑加ZmL生理鹽水稀釋至終濃度5000U/L，此為凝血活酶原液，再用生理鹽水分別稀釋10、 100和500倍，置37t:備用。取100pL正常人混合血漿，加10pL蛋白溶液，分別加100協(xié)L不同濃度的凝血活酶溶液，37t:孵育lmin，加100p L 30Inlno1/L Cacl2溶液，開(kāi)始計(jì)時(shí)血漿凝固時(shí)間。反應(yīng)體系中TFP11 — 276和TFP11 — 161終濃度均為0. 2p mol/L，取3次實(shí)驗(yàn)平均值記為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所有試劑均需37t:預(yù)熱，全部操作2h內(nèi)完成。結(jié)果表明LTFP工使dPT明顯延長(zhǎng)。
(9)抗FXa測(cè)定應(yīng)用發(fā)色低物發(fā)測(cè)定，方法如下 采正常人全血，109mM構(gòu)椽酸鈉1 : 9抗凝，4。C離心15min， 4000r/min，等體積混合30份正常人新鮮血槳，56t:孵育巧min，置37。C備用，此為參照血槳。每毫升此參照血槳中的TFPI定義為1個(gè)活性單位(1U)。 將野生型TFPI和LTFpl分別溶于TS(20mM TriS/HCI pH 7. 8+150InM NaCI)96孔板，每孔加100pL待測(cè)定溶液，再加100pL反應(yīng)液(100ng/mL FXa+0. 2% BSA)，室溫孵育30min，加發(fā)色底物SpeCtrozymeXa至終濃度0. 25InM，測(cè)0D10 :。結(jié)果表明LTFPI的抗Xa活性與野生型TFPI類似。
權(quán)利要求
絲氨酸蛋白酶抑制物，其特征在于，首先在計(jì)算機(jī)工作站上模建了TFPI和LRP分子，然后將兩者進(jìn)行對(duì)接，發(fā)現(xiàn)TFPI梭基末端的某些關(guān)鍵氨基酸在TFPI和LRP的相互作用發(fā)揮關(guān)鍵作用。本發(fā)明將TFPI梭基末端267一304區(qū)域內(nèi)的某些氨基酸進(jìn)行不同程度的替代和缺失突變后，兩者的結(jié)合能力出現(xiàn)了不同程度的下降，所述LTFPI的半衰期較TFPI延長(zhǎng)10倍以上，并具備抗組織因子、凝血因子V工工/Vlla和凝血因子X(jué)/Xa功能。其中將269、252、288和289位賴氨酸全部替換為丙氨酸的突變效果為佳。
2. 絲氨酸蛋白酶抑制物的制備方法，其特征在于，包括制備至少包含表達(dá)生物活性 的LTFPI編碼序列部分的cDNA，在適合表達(dá)的載體中克隆CDNA片斷，用該載體轉(zhuǎn)染宿主 細(xì)胞，在適于表達(dá)該cDNA片斷的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，以及從培養(yǎng)物中回收和純化所需 LTFPI。
全文摘要
絲氨酸蛋白酶抑制物及其制備方法屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及絲氨酸蛋白酶抑制物的長(zhǎng)效重組，且涉及其制備方法。本發(fā)明是提供半衰期長(zhǎng)，具有良好抗凝功能的絲氨酸蛋白酶抑制物。本發(fā)明首先在計(jì)算機(jī)工作站上模建了TFPI和LRP分子，然后將兩者進(jìn)行對(duì)接，將TFPI梭基末端267—304區(qū)域內(nèi)的某些氨基酸進(jìn)行不同程度的替代和缺失突變后，所述LTFPI的半衰期較TFPI延長(zhǎng)10倍以上，并具備抗組織因子、凝血因子V工工/Vlla和凝血因子X(jué)/Xa功能。本發(fā)明還提供了制備LTFPI的方法，包括制備至少包含表達(dá)生物活性的LTFPI編碼序列部分的cDNA，在適合表達(dá)的載體中克隆CDNA片斷，用該載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，在適于表達(dá)該cDNA片斷的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，以及從培養(yǎng)物中回收和純化所需LTFPI。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101747431SQ20081022959
公開(kāi)日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者肖懿 申請(qǐng)人:肖懿