專利名稱：一種外源性基因在空腸彎曲桿菌中表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法及其穿梭質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種外源性基因表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法及其穿梭質(zhì)粒，具體涉及一種外源性基因(Lux)在空腸彎曲桿菌中表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法及其穿梭質(zhì)粒。
背景技術(shù)：
近幾年來基因重組技術(shù)得到了迅速的發(fā)展，人們已經(jīng)能將具有某種功能的基因連接到適當?shù)妮d體上并通過化學或物理的方法轉(zhuǎn)化到細菌或植物、動物細胞中，這一技術(shù)已經(jīng)應用于制造外源蛋白質(zhì)產(chǎn)品，器官移植，動、植物轉(zhuǎn)基因育種、基因治療、生物感應器等方面有廣闊的應用前景。 如今，人們利用外源基因表達技術(shù)生產(chǎn)生物傳感器，和傳統(tǒng)檢測方法不同，新的生物傳感器是將編碼某種發(fā)光物質(zhì)的外援基因(DNA或RNA)直接倒入某種微生物體內(nèi)，并通過宿主細胞的表達系統(tǒng)合成外源性基因代謝產(chǎn)物，通過理化檢測代謝產(chǎn)物的合成數(shù)量以達到無害快速檢測監(jiān)測的目的。Lux基因是編碼和調(diào)控發(fā)光細菌生物發(fā)光的操縱子，其中主要有五個基因(Lux ABCDE)共同存在于所有的發(fā)光細菌中，并以lux CDABE順序排列，分別編碼不同的功能亞單位。Lux報告基因生物發(fā)光檢測系統(tǒng)，是用熒光素酶(Lux)基因標記細胞或DNA，利用光學檢測儀器，研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細胞活動和基因行為。通過這個系統(tǒng)，可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展變化、特定基因的表達等生物學過程。然而傳統(tǒng)的動物實驗方法需要在不同的時間點宰殺實驗動物或破碎細胞以獲得數(shù)據(jù)，得到多個時間點的實驗結(jié)果。相比之下，該技術(shù)通過對同一組實驗對象在不同時間點進行記錄，跟蹤同一觀察目標(標記細胞及基因)的移動及變化，所得的數(shù)據(jù)更加真實可信。另外，這一技術(shù)因其操作簡單、不涉及放射性物質(zhì)、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點，近年來在醫(yī)學研究及藥物開發(fā)、高產(chǎn)量藥物的篩選、基因治療實驗、以及在生物傳感器的構(gòu)建中發(fā)揮著其獨特的功能。 1989年P(guān)ARK, S.F.和STIRLING, D. A.第一個成功的將Lux基因用作生物發(fā)光報告基因應用于檢測大腸桿菌Escherichia Coli K12功能基因表達以來，引起了人們的廣泛關(guān)注。由于Lux報告基因生物發(fā)光技術(shù)在使用中具備以下特點(l)由原核基因編碼的基因產(chǎn)物與同轉(zhuǎn)染前真核細胞內(nèi)任何相似的產(chǎn)物相區(qū)別；(2)細胞內(nèi)其它基因產(chǎn)物不會干擾報告基因產(chǎn)物的檢測；(3)編碼產(chǎn)物的檢測快速、簡便、靈敏度高而且重現(xiàn)性好。目前，Lux報告基因生物發(fā)光技術(shù)已經(jīng)被證明是一種有效的、多功能的生物學分析工具，以其獨特的優(yōu)勢，被廣泛地應用于病毒學研究、食源性有害微生物快速檢測、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因微生物及動物模型、siRNA研究、干細胞研究、蛋白質(zhì)相互作用研究以及細胞體外檢測等領(lǐng)域。
但是，迄今為止，國內(nèi)外尚未將見將Lux報告基因生物發(fā)光技術(shù)應用于空腸彎曲桿菌研究領(lǐng)域的報道。本專利依據(jù)Lux報告基因生物發(fā)光技術(shù)的不丟失細胞活性，不破壞細胞膜、快速、靈敏、易于檢測的生物學特點，將Lux報告基因生物發(fā)光技術(shù)引入到空腸彎曲桿菌的研究領(lǐng)域，通過建立穩(wěn)定、靈敏、強發(fā)光可用于動物活體檢測的空腸彎曲桿菌發(fā)光模型，進一步利用Lux報告基因在分子水平研究空腸彎曲桿菌。相信它的成功將為深入研
究空腸彎曲桿菌的生物學特性及致病機理提供堅實的理論基礎(chǔ)和全新的方法途徑。 Lux基因生物傳感器發(fā)展的制約因素是如何將外源發(fā)光基因Lux在表達系統(tǒng)中高
效表達，即如何建立外源基因的高效表達系統(tǒng)，所謂外源基因是指生物體正常基因中原來
不存在的外來的基因，細胞可以通過基因操作技術(shù)來獲得外源基因。外源基因表達系統(tǒng)近
幾年得到了迅速的發(fā)展，被認為是最具有發(fā)展前景的生產(chǎn)功能蛋白質(zhì)及建立生物傳感器的
重要工具之一，外源性Lux基因表達主要分為下列步驟 1.目的基因(Lux)的選擇、克隆和加工 基因由于具有某種功能而被利用，即成為目的基因，目的基因的選擇至關(guān)重要。構(gòu)建生物發(fā)光傳感器時，通常是選擇Lux及gfp基因作為目的基因，因為檢測方便，最好是選擇可進行活體檢測的Lux基因。基因按照其順序一次分為幾部分啟動子，編碼序列，終止序列。所述的目的基因為某一種生物的基因，由于其在此種生物的體內(nèi)的表達量很低，或者由于此種生物缺乏而不能滿足人類的需要，所以將目的基因克隆出來，去掉目的基因的天然啟動子，將強啟動子序列和目的基因合并成融合基因。
2.目的基因(Lux)和載體的結(jié)合 目前常用的載體為質(zhì)粒、病毒體載體、噬菌體載體等，如大腸桿菌質(zhì)粒、腺病毒、M13噬菌體等，載體的必備要素為具有選擇基因、至少一個和目的基因共同的單一限制性內(nèi)切酶位點、能夠自主復制，有些載體還具有啟動子。將目的基因或序列插入載體，主要靠雙鏈粘性末端_即單鏈部分之間的互補，即DNA連接酶的連接作用。如果目的基因序列兩端有與載體上相同的限制性內(nèi)切酶的酶切位點，則不同來源的DNA的同一限制性內(nèi)切酶切開產(chǎn)生的粘性末端，在降低溫度退火時，可以互補配對，在DNA連接酶的作用下，目的序列就可以與載體序列連接。T4DNA連接酶可連接DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA和雙鏈DNA粘性和平頭末端，T4DNA連接酶能催化限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平頭末端的連接，如果目的序列和載體之間沒有相同的限制性酶切位點可供利用，用不同的限制性酶切割后，得到的粘性末端不能互補，則可用適當?shù)拿笇⑼怀龅哪┒讼髌?如綠豆芽核酸酶)或補齊成平末端，T4DNA再有連接酶連接。 以pRY107質(zhì)粒為列，該質(zhì)粒是一個帶有抗卡那霉素(Kana)基因的克隆載體，是一個環(huán)狀質(zhì)粒，在質(zhì)粒中含有三個單一的限制性內(nèi)切酶酶切位點。選擇外源DNA的粘性末端就和pRY107質(zhì)粒的粘性末端互補配對，再用連接酶連接，此時，外源DNA的粘性末端就和pRY107質(zhì)粒的DNA融合，因為多個單克隆位點都位于抗性基因外，外源DNA的插入就可以通過外加抗生素(卡那霉素)來檢測外源DNA是否轉(zhuǎn)入到受體細胞中。
3.目的基因(Lux)在受體中復制或表達 以pRY107質(zhì)粒為例pRY107質(zhì)粒以大腸桿菌質(zhì)粒為基本骨架，帶有細菌復制子(ORI)，包括大腸桿菌和空腸彎曲桿菌的復制區(qū)。將空腸彎曲桿菌致病基因flaA的啟動子promoter通過雙酶切和連接技術(shù)同pRY107質(zhì)粒融合，構(gòu)建成攜帶有外源基因LuxCDABE和空腸彎曲桿菌致病基因flaA的啟動子的pRY107LuxCDABE質(zhì)粒。 攜帶有外源基因LuxCDABE的pRY107LuxCDABE質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，可以在細胞內(nèi)大量復制繁殖，轉(zhuǎn)入空腸彎曲桿菌則表達。 無論是只克隆目的基因、還是將目的基因和載體融合后轉(zhuǎn)入受體中大量表達，都需要應用PCR技術(shù)PCR技術(shù)實際上是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。反應分為3步。1變形(denaturation)通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA ;2退火(annealling)當溫度突然降低時，由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物復雜得多，而且反應體系中引物DNA的量大大多余模板DNA，使引物和其互補的模板在局部形成鉸鏈，而模板DNA雙鏈之間的互補機會較少；3延伸
(extension)在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸底物存在下，5'-----3'的聚合酶催
化以引物為起點的DNA鏈延伸反應。以上三步為一個循環(huán)，每一個循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個循環(huán)的模板，介于兩個引物之間的特異性DNA片段得到了大量復制，數(shù)量可達21067拷貝。常規(guī)的PCR技術(shù)可以擴增基因序列已知的基因(DNA)，也可以擴增序列未知的基因，但所要的基因的兩端的15-30個核苷酸的序列必須是已知的，根據(jù)這一段已知的序列可以設(shè)計引物。近幾年來基因的表達系統(tǒng)得到了迅速的發(fā)展，但表達的高效性還有待提高。
目前，以Lux基因作為報告基因的生物轉(zhuǎn)化體已有報道，但是以空腸彎曲桿菌為受體細胞成功轉(zhuǎn)入Lux基因并表達未見任何試驗報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種外源性基因在空腸彎曲桿菌中表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其構(gòu)建了外源性基因(Lux)的轉(zhuǎn)基因載體，并通過構(gòu)建的有效載體將基因Lux轉(zhuǎn)入受體細胞并表達，建立可發(fā)出生物冷光的轉(zhuǎn)基因空腸彎曲桿菌生物模型。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是 —種外源性基因在空腸彎曲桿菌中表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特殊之處在于，該構(gòu)建方法包括以下步驟 以下步驟的實施條件均為厭氧環(huán)境，溫度控制在37°C ;
1)制備啟動子 a.使用試劑盒分離純化空腸彎曲桿菌DNA; b.對得到的空腸彎曲桿菌DNA，通過PCR克隆空腸彎曲桿菌f laA基因的啟動子
o 28 NC—002163 ; 2)穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 a.用雙酶切已克隆的啟動子，同時用同樣的方法酶切質(zhì)粒pRY107，并去磷酸化處理防止自連； b.用連接酶連接，溫度控制在16t:，反應20 24h，將克隆的空腸彎曲桿菌flaA基因的啟動子o28 NCJ)02163與無啟動子且含來自無色桿菌的luxCDABE基因全序列質(zhì)粒pRY107融合，構(gòu)建融合質(zhì)粒載體pRY1071uxCDABE ; c.將構(gòu)建的質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌，以抗生素卡那霉素為選擇壓，篩選轉(zhuǎn)
化體，并得到可發(fā)出生物冷光的轉(zhuǎn)化體； 3)空腸彎曲桿菌生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因模型的建立 a.將構(gòu)建好的質(zhì)粒載體pRY1071uxCDABE利用電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌，擴大后用質(zhì)粒提取試劑盒，提取質(zhì)粒并純化； b.再通過電轉(zhuǎn)化將構(gòu)建的質(zhì)粒載體pRY1071uxCDABE轉(zhuǎn)入空腸彎曲菌中并表達，形成空腸彎曲桿菌生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因模型，完成外源性基因lux在空腸彎曲桿菌中表達系統(tǒng)的構(gòu)建。 上述通過PCR克隆空腸彎曲桿菌flaA基因的啟動子o 28 NC_002163，具體的引物 和PCR過程如下 上游5， -ACGCGAATTCAATATTTACCAAAAACTTTAACAACC-3， 下游5， -ACGCGTCGACTCCTTTAAATAATTTCAAACTCATCCAT-3' 94°C 4min 94t:變性反應lmin 49。C退火反應lmin 72t:延伸反應lmin 經(jīng)過4個循環(huán) 94"變性反應lmin 59t:退火反應lmin 72t:延伸反應lmin 經(jīng)過25個循環(huán) 72 °C 7min結(jié)束。 上述電轉(zhuǎn)化具體是將感受態(tài)空腸彎曲桿菌同純化質(zhì)粒轉(zhuǎn)入預冷的0. 2cm的電
擊杯中，并輕敲電擊杯，使混合物沉入電擊杯底，在電轉(zhuǎn)化儀上進行轉(zhuǎn)化，其條件為電壓 2. 5kV/cm-l、電容25 ii F、電阻200歐。 上述空腸彎曲桿菌是指空腸彎曲桿菌ATCC33291和空腸彎曲桿菌ATCC35921。 上述大腸桿菌是大腸桿菌DH5 a 。 上述酶切時的酶是限制性內(nèi)切酶Sail和EcoRl。 上述連接酶是指T4 DNA連接酶。 上述厭氧環(huán)境是指體積百分含量在5%氧氣以及10%二氧化碳的厭氧環(huán)境。
—種外源性基因在空腸彎曲桿菌中表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法得到的穿梭質(zhì)粒 pRY107LuxCDABE，該穿梭質(zhì)粒pRY107LuxCDABE包括大腸桿菌和空腸彎曲桿菌的復制區(qū)，從 無色桿菌克隆的報告基因luxCDABE的全序列以及空腸彎曲桿菌致病基因flaA啟動子。
上述空腸彎曲桿菌致病基因flaA啟動子和報告基因luxCDABE直接相連。
本發(fā)明的優(yōu)點在于通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入空腸彎曲桿菌ATCC33291和ATCC35921在卡 那霉素抗生素的選擇壓下表達，無需添加任何底物可以觀測到生物冷光，直觀表達生物信 息。


圖lpR107YluxCDABE質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖；
圖2PCR產(chǎn)物DNA電泳圖； 泳道1為DNA的HindiII酶切片段(分子量對照)；
泳道2為lOObp的分子量對照；
泳道3為FlaA基因啟動子PCR產(chǎn)物；
泳道4為LuxCDABE基因的PCR產(chǎn)物；
泳道5為lOObp的分子量對照；[OOSO] 泳道6為DNA的Hindi 11酶切片段(分子量對照)； 圖3質(zhì)粒的酶切片段電泳以及空腸彎曲桿菌的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA電泳圖； 泳道1為DNA的Hindi 11酶切片段(分子量對照)； 泳道2為質(zhì)粒pRY107的EcoRI酶切片段； 泳道3為質(zhì)粒pRY1071LuxCDABE的EcoRI酶切片段； 泳道4為質(zhì)粒pRY1071LuxCDABE的EcoRI和Sail酶切片段； 泳道5為質(zhì)粒pRY1071LuxCDABE的Sail和Xbal酶切片段； 泳道6為DNA Hindi 11的酶切片段(分子量對照)。
具體實施例方式
—種外源性基因在空腸彎曲桿菌中表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法包括以下步 驟 以下步驟的實施條件均為厭氧環(huán)境，溫度控制在37°C ;
1)制備啟動子 a.使用試劑盒分離純化空腸彎曲桿菌DNA ; b.對得到的空腸彎曲桿菌DNA，通過PCR克隆空腸彎曲桿菌f laA基因的啟動子
o 28 NC—002163 ;具體的引物和PCR過程如下: 上游5， -ACGCGAATTCAATATTTACCAAAAACTTTAACAACC-3， 下游5， -ACGCGTCGACTCCTTTAAATAATTTCAAACTCATCCAT-3' 94°C 4min 94"變性反應lmin 49。C退火反應lmin 72t:延伸反應lmin 經(jīng)過4個循環(huán) 94t:變性反應lmin 59t:退火反應lmin 72t:延伸反應lmin 經(jīng)過25個循環(huán) 72 °C 7min結(jié)束。 2)穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 a.用雙酶切已克隆的啟動子，同時用同樣的方法酶切質(zhì)粒pRY107，并去磷酸化處 理防止自連； b.用連接酶連接，溫度控制在16t:，反應20 24h，將克隆的空腸彎曲桿菌flaA 基因的啟動子o28 NCJ)02163與無啟動子且含來自無色桿菌的luxCDABE基因全序列質(zhì)粒 pRY107融合，構(gòu)建融合質(zhì)粒載體pRY1071uxCDABE ; c.將構(gòu)建的質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌，以抗生素卡那霉素為選擇壓，篩選轉(zhuǎn)
化體，并得到可發(fā)出生物冷光的轉(zhuǎn)化體； 3)空腸彎曲桿菌生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因模型的建立 a.將構(gòu)建好的質(zhì)粒載體pRY1071uxCDABE利用電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌，擴大后用質(zhì)粒提取試劑盒，提取質(zhì)粒并純化；電轉(zhuǎn)化具體是將感受態(tài)空腸彎曲桿菌同純化質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 預冷的0. 2cm的電擊杯中，并輕敲電擊杯，使混合物沉入電擊杯底，在電轉(zhuǎn)化儀上進行轉(zhuǎn) 化，其條件為電壓2. 5kV/cm-l 、電容25 y F、電阻200歐； b.再通過電轉(zhuǎn)化將構(gòu)建的質(zhì)粒載體pRY1071uxCDABE轉(zhuǎn)入空腸彎曲菌中并表達， 形成空腸彎曲桿菌生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因模型，完成外源性基因lux在空腸彎曲桿菌中表達系統(tǒng) 的構(gòu)建； 其中空腸彎曲桿菌是指空腸彎曲桿菌ATCC33291和空腸彎曲桿菌ATCC35921 ;大
腸桿菌是大腸桿菌DH5a ;酶切時的酶是限制性內(nèi)切酶Sall和EcoRl ;連接酶是指T4 DNA
連接酶；厭氧環(huán)境是指體積百分含量在5%氧氣以及10%二氧化碳的厭氧環(huán)境。 —種按權(quán)利要求1方法得到的穿梭質(zhì)粒pRY107LuxCDABE，其特殊之處在于該穿
梭質(zhì)粒pRY107LuxCDABE包括大腸桿菌和空腸彎曲桿菌的復制區(qū)，從無色桿菌克隆的報告
基因luxCDABE的全序列以及空腸彎曲桿菌致病基因flaA啟動子；其中空腸彎曲桿菌致病
基因flaA啟動子和報告基因luxCDABE直接相連。 我們發(fā)明的以Lux基因為報告基因的生物模型-轉(zhuǎn)基因發(fā)光空腸彎曲桿菌生物模 型，不但可以用生物光的強度計量其生長特性，同時可以通過生物光的測量來衡量空腸彎 曲桿菌在食品加工及貯藏過程中的生長分布及環(huán)境對生物本身的影響。本發(fā)明的另一個特 征就是空腸彎曲桿菌的啟動子和報告基因直接相連，這樣可以通過生物發(fā)光的強度直接觀 察和反映空腸彎曲桿菌在環(huán)境中和動物體內(nèi)有害基因flaA的表達情況。
權(quán)利要求
一種外源性基因在空腸彎曲桿菌中表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，該構(gòu)建方法包括以下步驟以下步驟的實施條件均為厭氧環(huán)境，溫度控制在37℃；1)制備啟動子a.使用試劑盒分離純化空腸彎曲桿菌DNA；b.對得到的空腸彎曲桿菌DNA，通過PCR克隆空腸彎曲桿菌flaA基因的啟動子σ28NC_002163；2)穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建a.用雙酶切已克隆的啟動子，同時用同樣的方法酶切質(zhì)粒pRY107，并去磷酸化處理防止自連；b.用連接酶連接(T4DNA連接酶)，溫度控制在16℃，反應20～24h，將克隆的空腸彎曲桿菌flaA基因的啟動子σ28NC_002163與無啟動子且含來自無色桿菌的luxCDABE基因全序列質(zhì)粒pRY107融合，構(gòu)建融合質(zhì)粒載體pRY107luxCDABE；c.將構(gòu)建的質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌，以抗生素卡那霉素(kana)為選擇壓，篩選轉(zhuǎn)化體，并得到可發(fā)出生物冷光的轉(zhuǎn)化體；3)空腸彎曲桿菌生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因模型的建立a.將構(gòu)建好的質(zhì)粒載體pRY107luxCDABE利用電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌，擴大后用質(zhì)粒提取試劑盒，提取質(zhì)粒并純化；b.再通過電轉(zhuǎn)化將構(gòu)建的質(zhì)粒載體pRY107luxCDABE轉(zhuǎn)入空腸彎曲菌中并表達，形成空腸彎曲桿菌生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因模型，完成外源性基因lux在空腸彎曲桿菌中表達系統(tǒng)的構(gòu)建。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述外源性基因在空腸彎曲桿菌中表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在 于，通過PCR克隆空腸彎曲桿菌flaA基因的啟動子o 28NCJ)02163，具體的引物和PCR過程 如下上游5' -ACGCGAATTCAATATTTACCAAAAACTTTAACAACC-3，下游5' -ACGCGTCGACTCCTTTAAATAATTTCAAACTCATCCAT-3'94°C 4min94"C變性反應lmin49。C退火反應lmin72"C延伸反應lmin經(jīng)過4個循環(huán)94"C變性反應lmin59t:退火反應lmin72"C延伸反應lmin經(jīng)過25個循環(huán)72 °C 7min結(jié)束。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述外源性基因在空腸彎曲桿菌中表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征 在于，所述電轉(zhuǎn)化具體是將感受態(tài)空腸彎曲桿菌同純化質(zhì)粒轉(zhuǎn)入預冷的0. 2cm的電擊杯 中，并輕敲電擊杯，使混合物沉入電擊杯底，在電轉(zhuǎn)化儀上進行轉(zhuǎn)化，其條件為電壓2. 5kV/cm-l、電容25 ii F、電阻200歐。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述外源性基因在空腸彎曲桿菌中表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于所述空腸彎曲桿菌是指空腸彎曲桿菌ATCC33291和空腸彎曲桿菌ATCC35921 。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述外源性基因在空腸彎曲桿菌中表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于所述大腸桿菌是大腸桿菌DH5 a 。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1 5任一所述外源性基因在空腸彎曲桿菌中表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于所述酶切時的酶是限制性內(nèi)切酶Sail和EcoRl。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述外源性基因在空腸彎曲桿菌中表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于所述連接酶是指T4DNA連接酶。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述外源性基因在空腸彎曲桿菌中表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于所述厭氧環(huán)境是指體積百分含量在5%氧氣以及10%二氧化碳的厭氧環(huán)境。
9. 一種按權(quán)利要求1方法得到的穿梭質(zhì)粒pRY107LuxCDABE，其特征在于該穿梭質(zhì)粒pRY107LuxCDABE包括大腸桿菌和空腸彎曲桿菌的復制區(qū)，從無色桿菌克隆的報告基因luxCDABE的全序列以及空腸彎曲桿菌致病基因flaA啟動子。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述穿梭質(zhì)粒pRY107LuxCDABE，其特征在于所述空腸彎曲桿菌致病基因flaA啟動子和報告基因luxCDABE直接相連。
全文摘要
一種外源性基因在空腸彎曲桿菌中表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法，在厭氧環(huán)境，溫度控制在37℃的條件下，包括制備啟動子、穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建以及空腸彎曲桿菌生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因模型的建立的步驟。本發(fā)明通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入空腸彎曲桿菌ATCC33291和ATCC35921在卡那霉素抗生素的選擇壓下表達，無需添加任何底物可以觀測到生物冷光，直觀表達生物信息，具有廣闊的研究前景。
文檔編號C12N15/65GK101724643SQ200810231778
公開日2010年6月9日 申請日期2008年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月16日
發(fā)明者丁武, 劉變芳, 宋社果, 寇莉萍, 張靜 申請人:西北農(nóng)林科技大學