專利名稱：重組胸腺素β4二串體蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及目的蛋白質(zhì)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建、原
核表達(dá)、純化及鑒定，特別涉及胸腺素P4 (T卩4) 二串體蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
1、胸腺素P4的生物化學(xué)特性 1. l胸腺素P家族
胸腺素主要是由胸腺產(chǎn)生，最初由Goldstein自胎牛胸腺蛋白提取液中 制備得到，含40多種多肽成分，根據(jù)這些多肽在等電聚焦電泳分析圖譜上的 位置，劃分為oc、 P、 Y三個(gè)區(qū)ot區(qū)p1〈5， P區(qū)pl在5 7之間，Y區(qū)pl〉7， 其中位于3區(qū)的多肽被稱為P族胸腺素，其結(jié)構(gòu)高度保守，由40 44個(gè)氨 基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為5000Da。至今，己發(fā)現(xiàn)的P族胸腺素有15種， 人體內(nèi)存在3種，即胸腺素3 4、胸腺素P9和胸腺素其氨基酸序列 具有高度同源性，在維持肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)平衡以及腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋 亡、炎癥、血管生成和創(chuàng)傷愈合等很多生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。
1. 2胸腺素P4的化學(xué)結(jié)構(gòu)
胸腺素3 4是由43個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，分子量4963Da，等電點(diǎn) PI為5.1，在哺乳動(dòng)物中高度保守。與胸腺素a原或類胸腺素不同，胸腺素 3 4是胞漿蛋白而非核蛋白，并且它只含有較少的疏水性氨基酸，不含有Lys-Lys-Xaa-Lys結(jié)構(gòu)區(qū)域。其氨基酸序列如下AcSDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEK NPLPSKETIEQEKQAGES。
化學(xué)構(gòu)象研究表明，胸腺素P4是以單鏈形式存在及發(fā)揮作用，其第18 30殘基和第31 43殘基間是一內(nèi)部重復(fù)區(qū)域，有6個(gè)氨基酸相同。雖然存在第 5 6殘基和第31 40殘基兩個(gè)a螺旋，但是胸腺素^ 4沒有P轉(zhuǎn)角形成。
1. 3胸腺素P4的生物學(xué)分布
因?yàn)樾叵偎? 4首先是從胸腺中分離純化得到的，因此最早人們認(rèn)為它是 一種胸腺激素作用于T細(xì)胞成熟早期，但是胸腺素P 4又廣泛存在于其他組織、 器官和細(xì)胞中，其中含量最高的分別是脾臟、胸腺、肺和腹膜巨噬細(xì)胞，其 次是腦、肝、腎臟、睪丸、心臟，甚至非網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細(xì)胞如成肌細(xì)胞、 成纖維細(xì)胞等也能合成TP4。胸腺細(xì)胞中胸腺素P4 mRNA含量高于胸腺基質(zhì) 細(xì)胞7倍，并且各型血細(xì)胞中均有胸腺素3 4表達(dá)。
2、 胸腺素P4的生理功能研究進(jìn)展 2. l胸腺素P4與免疫學(xué)功能
胸腺素3 4不但在胸腺依賴性淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)與分化方面具有重要功能， 可顯著增強(qiáng)胸腺細(xì)胞、骨髓細(xì)胞末端核苷酰轉(zhuǎn)移酶活性，還可刺激下丘腦促 黃體激素釋放激素以及黃體激素的分泌，誘導(dǎo)T細(xì)胞系分型轉(zhuǎn)變，在CD4細(xì)胞 增殖抑制時(shí)激活CD8細(xì)胞；胸腺素P 4與袓B細(xì)胞共培養(yǎng)降低Fca受體的表達(dá)， 具有抗體依賴細(xì)胞的細(xì)胞毒活性；HIV-1感染的T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中胸腺素P4 翻譯量降低2 3倍，AIDS病人淋巴細(xì)胞中胸腺素P4mRNA量減少5倍。這些研 究結(jié)果表明，胸腺素P 4在宿主防御過程中發(fā)揮基礎(chǔ)作用。
2. 2胸腺素3 4與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育
研究發(fā)現(xiàn)胸腺素P4在腦發(fā)育中顯示復(fù)雜的表達(dá)模式，盡管在體內(nèi)未成 熟的粒細(xì)胞表達(dá)較高，當(dāng)粒細(xì)胞分化后便減弱至消失，但在星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì) 胞及小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中一直高水平表達(dá)；原位雜交表明，胸腺素P4在中樞 神經(jīng)系統(tǒng)及外周神經(jīng)節(jié)中與神經(jīng)分化同步高效表達(dá)；研究斑紋魚胚胎發(fā)育過 程發(fā)現(xiàn)，胸腺素P4mRNA在神經(jīng)和腦分化時(shí)豐度增力fl，注射反義RNA到斑紋魚胚胎，導(dǎo)致腦發(fā)育缺陷和視神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙。
2. 3胸腺素0 4與造血干細(xì)胞
使用乙酰膽堿酯酶競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫跟蹤胸腺素e 4及其N端AcSDKP序列表 明，二者是造血干細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控因子，抑制人骨髓干/祖細(xì)胞生長，降低 S期細(xì)胞百分率，在細(xì)胞因子存在時(shí)降低CD34+細(xì)胞的增殖率，可保護(hù)造血干 細(xì)胞免于過度分化。AcSDKP序列是胸腺素P4和TNFoc的共享序列，促進(jìn)5-FU 處理后小鼠HPP-CFC、 BFU-E、 CFU-GM的恢復(fù)，可能具有保護(hù)造血細(xì)胞抵抗化 療藥物殺傷的作用。
2. 4胸腺素3 4與肌動(dòng)蛋白
1991年Safer等從人血小板分離到G-肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白胸腺素P 4，能調(diào) 節(jié)肌動(dòng)蛋白聚合的動(dòng)力學(xué)變化，抑制肌動(dòng)蛋白的聚合。研究胸腺素P4與肌動(dòng) 蛋白的相互關(guān)系發(fā)現(xiàn)，胸腺素P 4與肌動(dòng)蛋白結(jié)合比例為1:1，其oc螺旋是相互 結(jié)合的必需結(jié)構(gòu)。胸腺素P 4對(duì)肌動(dòng)蛋白聚合的調(diào)控作用影響了細(xì)胞的粘附、 運(yùn)動(dòng)、分裂、增殖等活動(dòng)，還可能參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移。
2. 5胸腺素P4與炎癥反應(yīng)
胸腺素P 4第六位的Met氧化形成胸腺素P 4亞砜后具有抗炎癥作用，胸腺 素P4亞砜失去了對(duì)肌動(dòng)蛋白聚合的調(diào)控作用，能有效地防止人體發(fā)炎而形成 的腫脹。此外，胸腺素M和胸腺素P4亞砜還可能作為化學(xué)誘導(dǎo)劑來調(diào)節(jié)炎 性應(yīng)答。
體外試驗(yàn)表明，外傷性角膜的損傷部位，胸腺素M能夠降低多核白細(xì)胞 的侵潤及炎癥細(xì)胞因子和趨化因子mRNA的表達(dá)水平。另外，在體外和動(dòng)物炎 癥模型中的胸腺素P 4亞砜還能夠抑制中性粒細(xì)胞趨化和組織炎癥反應(yīng)，同時(shí)
在體外能夠抑制巨噬細(xì)胞遷移。
2. 6胸腺素0 4與血管生成及創(chuàng)傷愈合有研究發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞分化形成管狀時(shí)，胸腺素P4mRNA增加5倍，轉(zhuǎn)染 胸腺素P4的內(nèi)皮細(xì)胞克隆顯示管狀形成加速。同樣Philp等報(bào)道顯示，胸腺 素P 4能夠刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞定向移動(dòng)到損傷區(qū)域，促進(jìn)體內(nèi)外血管生成。 動(dòng)物試驗(yàn)表明，胸腺素P 4也能夠促進(jìn)正常和衰老的嚙齒類動(dòng)物血管生成。
胸腺素P 4的創(chuàng)傷愈合作用是通過促進(jìn)損傷部位的內(nèi)皮細(xì)胞增生移行、膠 原沉著以及血管生成綜合作用。有實(shí)驗(yàn)表明胸腺素M基因表達(dá)上調(diào)，有利于 增強(qiáng)細(xì)胞抗缺氧的能力；人血小板釋放的胸腺素P 4能通過XIIIa因子介導(dǎo)， 與纖維蛋白和膠原相連；胸腺素P 4有促進(jìn)正常大鼠皮膚和角膜修復(fù)的功能， 在糖尿病和老年小鼠的全層皮膚損傷實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)加速創(chuàng)傷修復(fù)的能力。
2. 7胸腺素P4與毛囊生長
毛發(fā)生長過程中牽涉到許多細(xì)胞及分子機(jī)制，如細(xì)胞遷移、分化和細(xì)胞 外基質(zhì)的重塑等。研究表明，胸腺素P4可促進(jìn)正常大鼠及小鼠的毛發(fā)生長， 其可能的作用機(jī)制如下(1)胸腺素P 4可促進(jìn)毛囊干細(xì)胞及其子代細(xì)胞的移 動(dòng)來促進(jìn)毛發(fā)生長。(2)胸腺素P 4通過促M(fèi)MP-2的合成和分泌來影響毛發(fā)的 生長。(3)胸腺素P 4也有可能通過誘導(dǎo)毛乳頭及其毛囊周圍的血管形成而調(diào) 控毛囊的周期性循環(huán)和促進(jìn)毛發(fā)生長。
2. 8胸腺素P4與腫瘤
胸腺素P4基因表達(dá)的上調(diào)與某些腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切人類髓狀甲狀腺 癌伴轉(zhuǎn)移的細(xì)胞中、非小細(xì)胞肺癌早期腫瘤細(xì)胞中、人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系中 及口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的細(xì)胞系中胸腺素P 4基因呈高度表達(dá)；高度惡性 黑色素瘤和乳腺癌細(xì)胞中胸腺素e 4表達(dá)也明顯上調(diào)。目前通過蛋白芯片生物 標(biāo)記系統(tǒng)，已經(jīng)確認(rèn)胸腺素P 4為多種腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞分泌的差異性蛋 白。
胸腺素P 4表達(dá)上調(diào)與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切可能是由于胸腺素P 4可以有效誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的表達(dá)而促使血管生成，并激活細(xì)胞遷移性，
促使腫瘤惡性化；胸腺素P 4可使細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞間的粘連作用發(fā)生異常， 引起表皮細(xì)胞侵染和惡性化；胸腺素^4有抗凋亡能力，其表達(dá)增加可使腫瘤 細(xì)胞的凋亡程度降低。
2. 9胸腺素P4與心臟
冠狀動(dòng)脈的形成可以分為血管發(fā)生、血管形成和動(dòng)脈形成3個(gè)階段。 Smart等通過選擇性的敲除胸腺素P4基因，觀察胸腺素P 4在心臟發(fā)育過 程中的作用，發(fā)現(xiàn)胸腺素P4在心血管形成的上述3個(gè)關(guān)鍵時(shí)期是不可缺少 的..胸腺素P4裂解產(chǎn)物AcSDKP可促進(jìn)心外膜細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞，而且可 能是胸腺素M促進(jìn)血管發(fā)生作用的基礎(chǔ)；胸腺素M能夠誘導(dǎo)心外膜發(fā)揮 其血管生成的潛能。
Bock-Mrguett等研究發(fā)現(xiàn)，胸腺素P 4從心肌層中分泌，剌激心外膜細(xì) 胞的旁分泌，促使心外膜的細(xì)胞移到心肌層并分化成形成冠狀動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì) 胞和固定血管的平滑肌細(xì)胞。在研究胸腺素P4對(duì)成年小鼠局部缺血心臟的 修復(fù)作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)胸腺素P4可以促進(jìn)心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在胚胎心臟中的 遷移，并可顯著地增強(qiáng)心臟的修復(fù)功能，增加心肌細(xì)胞的存活率和減小瘢痕 形成。
3、 胸腺素P4的應(yīng)用前景 3. l治療創(chuàng)傷
因?yàn)樾叵偎豍4可促進(jìn)血管生成，并可促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，因此可以用來治 療皮膚、角膜、結(jié)膜等組織的損傷。目前FDA批準(zhǔn)RegeneRx生物制藥公司進(jìn) 行五項(xiàng)關(guān)于胸腺素3 4的臨床試驗(yàn)，包括壓迫性潰瘍、大皰性表皮松解、靜 脈淤積性潰瘍、糖尿病玻璃體切割術(shù)后和急性心肌梗死，其中前四項(xiàng)已進(jìn)入 II期臨床試驗(yàn)。3. 2治療腫瘤
細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性是腫瘤轉(zhuǎn)移的前提，胸腺素P 4具有調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的作用， 與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性有必然的聯(lián)系。應(yīng)用表面加強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技 術(shù)可檢測(cè)胸腺素P 4在癌組織中表達(dá)增高，提示胸腺素3 4可否作為檢測(cè)腫瘤 惡變的標(biāo)志物，對(duì)胸腺素3 4研究的深入將有助于腫瘤的診斷、分級(jí)及預(yù)后等 方面的工作；胸腺素e 4在腫瘤發(fā)生中的重要作用使其可能成為腫瘤治療的一 個(gè)重要目標(biāo)，即通過調(diào)節(jié)胸腺素P4功能而實(shí)現(xiàn)治療目的；此外，運(yùn)用反義胸 腺素P 4 mRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞或胸腺素3 4抗體會(huì)導(dǎo)致腫瘤形成和轉(zhuǎn)移減少，為臨床 治療提供重要的理論意義，獲得控制腫瘤轉(zhuǎn)移的有效治療措施。
3. 3治療脫發(fā)
盡管胸腺素P 4促毛囊生長作用的許多分子生物學(xué)機(jī)制目前尚未闡明， 但已有的實(shí)驗(yàn)證據(jù)已經(jīng)給研究者們一些啟示，通過開展相關(guān)的基礎(chǔ)與臨床研 究，胸腺素P4很有希望引入到頑固的脫發(fā)疾病的治療中。
3. 4治療炎癥
感染性休克引起胸腺素P 4快速消失，提示胸腺素P 4也許參與炎癥早期 級(jí)聯(lián)激活過程和膿毒血癥引起的臨床后遺癥，胸腺素P 4也許有治療感染性休 克和與actin中毒相關(guān)綜合征的作用。胸腺素3 4亞砜失去了對(duì)肌動(dòng)蛋白聚合 的調(diào)控作用，能有效地防止人體發(fā)炎而形成的腫脹，還能避免人體免疫反應(yīng) 失去控制，并可充當(dāng)信號(hào)顯示人體免疫系統(tǒng)已無法完全保護(hù)自身組織免受損 傷?？蒲腥藛T以這種蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)開發(fā)研制出治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等慢性炎癥 的新藥，其副作用小于常用的類固醇消炎藥，已開始用于慢性褥瘡、糖尿病 潰瘍、眼部損傷、皮膚老化、敗血性休克、化膿性感染等疾病的臨床試驗(yàn)治 療。
4、 胸腺素P 4原核表達(dá)的研究雖然胸腺素P 4有著廣泛的應(yīng)用前景，但由于其分子太小，難于直接在大 腸桿菌中表達(dá)。目前用于實(shí)驗(yàn)室及臨床試驗(yàn)的胸腺素e4多為化學(xué)合成品，價(jià) 格昂貴；而從哺乳動(dòng)物組織中提取胸腺素P4，過程復(fù)雜而且產(chǎn)量較低，使其 應(yīng)用受到限制，如何以更經(jīng)濟(jì)的方法獲取此多肽顯得非常重要。
Tsuji Y等用大腸桿菌高效表達(dá)了胸腺素P4與TNF構(gòu)成的嵌合體蛋白， 在適當(dāng)?shù)乃嵝原h(huán)境中將二者之間的Asp-Pro橋切開，胸腺素P4從嵌合體蛋 白中釋放，經(jīng)過純化便可得到較多的胸腺素P4蛋白。
陳妍柯等將胸腺素M基因片段克隆入質(zhì)粒pLDH4的EcoR V和Hind III位 點(diǎn)之間，重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5oc，誘導(dǎo)后的菌體經(jīng)硫酸銨鹽析技術(shù)、 Source RPC反相層析柱和Q S印harose HP陰離子交換柱純化，得到的N端融合 5個(gè)氨基酸的HKCDI-T(34蛋白，可提高E-玫瑰花環(huán)結(jié)花率并能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞 的增殖和分化。
賈琪等構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-TP4，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng) IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)帶6 X His標(biāo)簽的融合蛋白，并經(jīng)鎳柱一步親和層析即獲得 純化，CAM試驗(yàn)證明Hisr T3 4蛋白有促進(jìn)毛細(xì)血管生成的活性。
XKLi等構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pTXB-TP4，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER 2566， IPTG 誘導(dǎo)得到的融合蛋白經(jīng)一步親和純化、DTT自動(dòng)水解后，得到的胸腺素P4 C 端融合5個(gè)氨基酸(LEGSS)，不僅可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖和分化，而且可以 促進(jìn)傷口愈合。
如上述所述，雖然構(gòu)建的胸腺素P4的不同表達(dá)載體，表達(dá)及純化融合或 嵌合蛋白，并有一定的生物活性，但同時(shí)存在以下缺陷純化工藝復(fù)雜成本 較高，表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定表達(dá)。帶有蛋白橋的融合蛋白還需要重新酶切、純化； 帶有His標(biāo)簽的重組蛋白純化工藝需要昂貴的鎳柱親和純化，大大增加了成 本，不適于工業(yè)化生產(chǎn)；而且His標(biāo)簽影響了重組蛋白在臨床試驗(yàn)的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重會(huì)IW腺素3 4 二串體蛋白及其制備方法，本發(fā) 明將胸腺素P 4以二串體的形式在大腸桿菌中高效表達(dá)并純化，得到具有胸 腺素P 4生物學(xué)活性的重組胸腺素P 4 二串體蛋白，其分離純化過程簡便、廉 價(jià)、易于擴(kuò)大化生產(chǎn)，為其廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明重纟鵬腺素M二串體蛋白為通過甘氨酸和 絲氨酸串連兩分子的胸腺素P4 (T(34)，其連接方式為Tp4~Gly-Ser-TP4， 其MS^^列如SEQ ID NO. 1戶標(biāo)。
本發(fā)明編碼重組核苷酸是用^a/zH I酶切位點(diǎn)連接2段胸腺素|34的基因序 列，在5'端加入廁e I酶切位點(diǎn)、3'端加入終止密碼子TAG和&2 I酶切 位點(diǎn)，其連接方式為謝e I酶切位點(diǎn)-T(34基因-I酶切位點(diǎn)-T(34基因 -TAG-&7 I酶切位點(diǎn)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。重組胸腺素p4 二 串體核苷酸構(gòu)建于表達(dá)載體或重組質(zhì)粒PET-22b(+)-TP4②，所述的 pET-22b(+)-TP4②是通過7fefel酶切位點(diǎn)和6"s7 I酶切位點(diǎn)將重組胸腺素p4 二串體核苷酸克隆入質(zhì)粒pET-22b(+)。
重組胸腺素(34二串體蛋白的制備方法，按照以下步驟
1)構(gòu)^H腺素p4二串體基因^i^體^S纟IM粒pET—22b(+)—Tp4②
a) pET-22b(+)-TM①的構(gòu)建
依據(jù)鄉(xiāng)桿菌偏愛的密碼子，將胸腺素P4的織,列轉(zhuǎn)化為c靈序列，5， 端引入廁el酶切位點(diǎn)，3，端弓I入扁I酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)的基因序列如下 catatgagtg ataaaccgga tatggccgag attgagaaat ttgataagtc aaaattgaag aaaacggaaa ctcaggaaaa gaacccgttg ccttcaaaag agaccatcga acaggaaaag caggcggggg aaagcggatc c，
AX合^lh^基因并將其克隆A^i載體pET-22b (+) 7We I 、 M I酶切位點(diǎn)之間，得到重纟M粒pET-22b(+)-TM①； b) pET-22b(+)-Te4②的構(gòu)建
PCR將步驟a)所述的胸腺素曰4基因兩端的酶切位點(diǎn)yifefe I 、 I突
^fe免/zHI和&71，并引入終止密碼子TAG，設(shè)計(jì)PCR引物如下
F: cgcggatcca gtgataaacc ggatatggc
R: gacgtcgacc tagctttccc ccgcctgctt ttcc
PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)95。C予^ft5min后，按下列參fcf盾環(huán)30次94。C變性 30s, 65。C退火30s， 72。C延伸lmin，蔬再于72。C延伸10min; TOPCR退^ 物；
用皿I和雙酶切位點(diǎn)將PCR退火產(chǎn)物克(tA pET-22b (+) -T P 4①，構(gòu) ^m纟IM粒pET-22b(+)-TM②，重纟!M粒轉(zhuǎn)化鄉(xiāng)桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提 BRM粒，經(jīng)酶切鑒定獲得風(fēng)期大小的插入片段，兩個(gè)胸腺素M基因在的重纟服 米^^接方式為廁e I酶切位點(diǎn)-T P 4基因-fe出I酶切位點(diǎn)-T P 4基因-TAG-&71 酶切位點(diǎn)，^t亥苷^^列如SEQ ID NO. 2戶庥；
3)胸腺素(B4二串體蛋白的純化
a) 用重纟IM粒pET-22b (+) -T P 4^f化熵桿離L21感受態(tài)細(xì)胞，0. OlmM IPTG 誘熟h后i^^菌體,按lg菌働Q10ml裂菌STE緩沖液的比例將菌^m懸,戶腿的STE 緩沖液20mM Tris-HCl pH 7.5， lOOnM NaCl， lnM EDTA; 在冰浴中超聲織率菌 體4。C^j牛下離心12000rpmX 20min,收歡清液，力口 (肌)2804至頓口度為60%， 4。C靜置lh; 4。C^f牛下離心12000rpm X 20 min,收赴清；
b) 上清麵細(xì)A航辨衡的疏冰腺蹄屯化；用B,辦度,O個(gè)柱 床體積，收集目的蛋白胸腺素P4二串體蛋白所在tt峰的^I^液，用50倍M峰 術(shù)只的C析，中間換C液三到四次；透析后用鵬分平衡的陰離子交換l提 蹄屯化，用D^^^度洗脫10個(gè)腺^^只，收集目的蛋白所在M峰的^^液，用50倍,銜科只磷^:緩沖^PBS透析，用0.22iim濾月皿濾除菌，得到純化的 胸腺素P仁串體蛋白；
戶脫的A液20nM Tris-HCl pH 7. 5， 60% (NHJ^Oa, 1 rrM EDTA， B液20 mM Tris-HC1 pH 7. 5， 1 raM EDTA， C液20 mM Tris-HC1 pH 7. 0， 1 mM EDTA， D液 20謹(jǐn)Tris-HC1 pH 7. 0， 1 M NaCl， 1 nM EDTA。
本發(fā)明采用免疫印跡分析證明胸腺素P4二串體蛋白可與兔抗人胸腺素 3 4多克隆抗體特異性結(jié)合，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)得胸腺 素0 4二串體蛋白的分子量與理論分子量相一致，說明本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體 成功表達(dá)，得到預(yù)期的重組胸腺素P4二串體蛋白。
純化的重組胸腺素3 4二串體蛋白與標(biāo)準(zhǔn)品胸腺素P4均可促進(jìn)小鼠脾 淋巴細(xì)胞的增殖和分化，說明重組胸腺素P4二串體蛋白具有胸腺素P4的 生物活性。
ELISA結(jié)果顯示胸腺素P 4二串體蛋白免疫組小鼠血清與PBS對(duì)照組小鼠 血清相比幾乎一樣，不含有抗人胸腺素P4二串體蛋白的抗體；這表明純化胸 腺素e4二串體蛋白免疫原性低，短期使用不會(huì)誘發(fā)抗體產(chǎn)生，為其在體內(nèi)發(fā) 揮生物學(xué)效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用以二串體的形式在大腸桿菌中高效表達(dá)并 純化，得到具有胸腺素P 4生物學(xué)活性的重組胸腺素P4二串體蛋白，解決 了胸腺素3 4分子太小無法在大腸桿菌中直接表達(dá)的問題，克服了其他形式 的融合或嵌合蛋白純化工藝復(fù)雜成本較高，表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定表達(dá)的缺陷；而 且胸腺素P4二串體蛋白免疫原性低，短期使用不會(huì)誘發(fā)抗體產(chǎn)生，為其廣 泛代替其他形式的胸腺素0 4的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。


圖1是胸腺素P4基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖；圖2是胸腺素P 4二串體重組質(zhì)粒pET-22b (+) -T P 4②的雙酶切瓊脂糖電 泳鑒定圖3是胸腺素P 4 二串體重組質(zhì)粒pET-22b (+) -T e 4②的DNA測(cè)序結(jié)果
圖4是胸腺素e 4二串體蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化聚丙烯酰胺電泳圖5是胸腺素M二串體蛋白的免疫印跡鑒定圖6是胸腺素P 4二串體蛋白的質(zhì)譜結(jié)果圖7是用MTT法測(cè)定胸腺素P 4二串體蛋白對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果Excel統(tǒng)計(jì)圖8是用胸腺素P 4二串體蛋白與小鼠抗胸腺素P 4二串體蛋白抗血清 ELISA結(jié)果Excel統(tǒng)計(jì)圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明利用大腸桿菌偏愛密碼子，合成人胸腺素e4全長基因，結(jié)合PCR 技術(shù)構(gòu)建了人胸腺素^ 4二串體基因表達(dá)載體pET-22b(+)-TP 4②，重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)鹽析、疏水作用層析和 離子交換作用層析純化重組蛋白，最終獲得了高純度的人胸腺素P 4二串體蛋 白，并采用Western blot和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDI-TOF-MS)對(duì)其進(jìn)行鑒定，通過脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)定其活性。
具體按照以下步驟實(shí)現(xiàn)
1)構(gòu) 腺素P 4二串體基因^i載體皿纟IM^)ET—22b (+) —T P 4 a) pET-22b(+)-TM①的構(gòu)建
依據(jù)鄉(xiāng)桿菌偏愛的密碼子，將胸腺素P 4的錢鵬列轉(zhuǎn)化為cDNA序列， 5'端弓l入麗el酶切位點(diǎn)，3'端引入扁I酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)的基因序列如下 catatg觀tg ataaaccgga tatggccgag attgagaaat ttgataagtc aaaattgaagaa朋cggaaa ctcaggaaaa gaacccgttg ccttcaaaag agaccatcga acaggaaaag
caggcggggg aaagcggatc c，劃線部分分別為Ue I 、 ^Ss/zHl酶切位點(diǎn)，委托
北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成上述基因并克隆入pGH載體中。將人胸
腺素P 4基因亞克隆入表達(dá)載體pET-22b(+) (NOVAGEN公司)中，構(gòu)建重組質(zhì)
粒pET-22b(+)-TP4①。
b) pET-22b(+)-TP4②的構(gòu)建
M PCR將步驟a)戶艦的胸腺素P 4基因兩端的酶切位點(diǎn)廁e I 、 M I突 涵1禾口6^1，并引A^冬ih密碼子TAG，設(shè)計(jì)PCR引物如下 F: cgcggatcca gtgataaacc ggatatggc R: gacgtcgacc tagctttccc ccgcctgctt ttcc
劃線部分分別為I和6k/ I酶切位點(diǎn)，委托上海英峻生物公司合成上述 引物。
PCR反應(yīng)體系如下
20 ng/ml模板DNA 20 iiM Primer 1 20 yM Primer 2 2 X Taq PCR Mix ddH20 總計(jì)
1 ul 1 ul 1
12.5 ul 9.5
25 ul
PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)95。C預(yù)變性5min后，按下列參數(shù)循環(huán)30次94 。C變性30s， 65。C退火30s， 72。C延伸lmin。最后再于72。C延伸10min。 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，可見預(yù)期大小144bp的DNA片段，如圖l泳 道2所示；圖中泳道l: DNA marker;泳道2: P4基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
用皿I和6k I雙酶切位點(diǎn)將PCR退火f^t/克PiA pET-22b (+) -T 0 4①，構(gòu)^S頓粒pET-22b(+)-TM②，彭頓粒轉(zhuǎn)化鄉(xiāng)桿菌DH5oc感魏細(xì)胞，提 ^M粒，纟5^切鑒定獲得預(yù)期大小的插入片段，兩個(gè)胸腺素M基因在的重纟頗 米5^接方式為廁e I酶切位點(diǎn)-T P 4基因-泡flH I酶切位點(diǎn)-T P 4基因-TAG-&2 I 酶切位點(diǎn)，^t亥苷^l^列如SEQ ID NO. 2戶標(biāo)；
重iaM粒轉(zhuǎn)化DH5ot感受態(tài)細(xì)胞，提^M粒，經(jīng)酶切鑒定獲得風(fēng)期大小273bp 的插入片段，如圖2泳道4所示，泳道3為TM大小為138bp片段；圖2中泳 道l: DNA marker;泳道2: pET-22b(+)-TP 4②/M/e I和勘/tH I雙酶切；泳 道3: pET-22b (+) -T P 4②/泡/zH I和&2 I雙酶切；泳道4: pET-22b (+) -T P 4 ②/廁e I和&71雙酶切。DNA測(cè)序結(jié)果(如圖3所示)，^t亥苷,列如SEQ IDN0.2戶標(biāo)，鄉(xiāng)敏比^:現(xiàn)PCR過程中有一個(gè)堿基發(fā)生突變，第207個(gè)堿基 由T突變以C，三聯(lián)密碼子由ACT突變?yōu)锳CC，均編碼蘇氨酸，為同義突變。
3)胸腺素M二串體蛋白的純化
a) 用重鄉(xiāng)!M粒pET-22b (+) -T P 4離化;^湯桿鄘L21感受態(tài)細(xì)胞，12h后挑取 邊緣整齊，生長狀態(tài)良好的菌落，接種于含氨芐青霉素100mg/L的LB培養(yǎng)液 中，搖床37'C培養(yǎng)過夜，次日以l : 100的比例接種于新鮮LB培養(yǎng)液(含氨芐 青霉素IOO mg/L)中，37。C繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)菌密度達(dá)到OD6oc = 0. 4 0. 6;加入O. 01 rnM IPTG，誘導(dǎo)4h后收集菌體。按lg菌働卩10 ml裂菌STE緩沖液的比例將菌^S 懸，所述的STE緩沖液20 nM Tris-HCl pH 7.5， 100 mM NaCl, 1 mM EDTA;在 冰浴中超聲裂解菌體，4"C條件下離心12000rpmX 20 min，收集上清液，加 (NH4)2S04至t頓B度為600/。， 4。C靜置lh; 4。C條件下離心12000rpm X 20 min，蝶 上清；
b) 上清順次用A液充分平衡的疏水柱(苯基瓊脂糖凝膠6 FF ， Phenyl S印harose 6 Fast Flow, high sub， Pharmacia公司)層豐形屯化；用B^^^^度 洗脫10個(gè)TO術(shù)只；收集目的蛋白胸腺素M二串體蛋白所在淵兌峰盼淵兌液，用50倍i^兌峰i^只的C磁析，中間換C液三到四次；i^斤后用C棘分平衡的陰離 子交換柱(Q瓊月i^M)K FF， Q S印harose Fast Flow ， Pharmacia公司)層豐形屯 化，用D液遊^^度^I兌10個(gè)腺^f只，麟目的蛋白所在、湖兌峰，將淵兌峰用50 倍皿峰^IR磷M&緩沖^PBS3tl斤，用0.22 um濾M:濾除菌，得到純化的胸腺 素M二串體蛋白，分裝后-2(TC保存?zhèn)溆茫?br> 戶腿嫌液20 nM Tris-HC1 pH 7. 5， 60% (NH4)2S04， 1慮EDTA， B液20 mM Tris-HCl pH 7. 5， 1 nM EDTA， C液20 nM Tris-HC1 pH 7. 0， 1 niM EDTA， D液 20 nM Tris-HCl pH 7.0， 1 M NaCl， 1 nM E隱。
SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)和純化胸腺素3 4二串體 蛋白，參見圖4，圖中M: protein marker;泳道l:未誘導(dǎo)BL21/pET-22b(+) -TP4②；泳道2: O.OlmM IPTG誘導(dǎo)BL21/pET-22b(+) -TP4②4 h;泳道3: 超聲裂菌沉淀；泳道4:超聲裂菌上清；泳道5:硫酸銨鹽析沉淀；泳道6:硫 酸銨鹽析上清；泳道7:疏水作用純化目的蛋白；泳道8:陰離子交換作用純 化目的蛋白；電泳結(jié)果顯示，IPTG誘導(dǎo)后目的蛋白表達(dá)，且誘導(dǎo)后4小時(shí)表達(dá) 量最高，如泳道l-2所示；采用本發(fā)明所述純化方法可以成功純化目的蛋白，
得到純度大于95%的目的蛋白，如泳道8所示。 4)胸腺素P4二串體蛋白的鑒定 a)免疫印跡
未經(jīng)誘導(dǎo)及誘導(dǎo)后的BL21菌體在SDS-PAGE結(jié)束后，拆下凝膠，按照 Bio-Rad產(chǎn)品說明，將凝膠靠近陰極一側(cè)、硝酸纖維(NC)膜靠近陽極一側(cè)， 在預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液(25 mM Tris、 192 mM Glycine、 20%甲醇)中100 V恒壓 電泳lh，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上。電泳結(jié)束后，取出NC膜，洗滌液TBST(20mM Tris-HC1 pH7. 5， 150mMNaCl， 0. 05。/。Tween-20)清洗后浸入封閉液(含2%BSA 的TBST)中室溫封閉lh， TBST室溫洗3次，每次5min，加入兔抗人胸腺素P4多克隆抗體(Abcam公司，按1:500稀釋)，室溫孵育1 h， TBST室溫洗3 次，每次5min，再加入HRP-山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司， 按1:4000稀釋)，室溫孵育1 h， TBST室溫洗3次，每次5 min，最后用TBS (20 mM Tris-HCl pH 7.5， 150 niM NaCl)洗3次，NC膜浸入DAB顯色液中，室溫 避光顯色1 min，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。DAB顯色后在相應(yīng)電泳位置有條帶顯 現(xiàn)，如附圖5泳道1所示，表明胸腺素P 4 二串體蛋白可與兔抗人胸腺素P 4 多克隆抗體特異性結(jié)合；圖中M: protein marker ;泳道l: 0.01 mM IPTG 誘導(dǎo)BL21/ pET-22b(+) -T 3 4②4 h;泳道2:未誘導(dǎo)BL21/ pET-22b(+)-T P 4。 b)質(zhì)譜分析
用截留分子量為5000Da的超濾離心管對(duì)純化的蛋白進(jìn)行除鹽、濃縮， . 22 y m濾器過濾除菌后，委托軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院儀器測(cè)試分析中心對(duì)其進(jìn)行分子量 測(cè)定。胸腺素e4二串體蛋白的理論分子量約為胸腺素P4的分子量X2+甘 氨酸分子量+絲氨酸分子量-水分子量X 3=4963 X 2+75+105-18 X 3=10052 。質(zhì) 譜分析測(cè)得胸腺素M二串體蛋白的實(shí)際分子量為10020.5，如附圖6所示，與
理論分子量相近。
5)人胸腺素P4二串體蛋白體外生物學(xué)活性檢測(cè)
將兩只BALB/c小鼠(購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)頸椎脫臼處死， 75Q/o乙醇浸泡3min，取出小鼠瀝干，置于無菌紙上，在小鼠左腹側(cè)中部剪開 小口，取出脾臟，置于不銹鋼濾網(wǎng)上，濾網(wǎng)置于盛有10 ml 10%FCS RPMI 1640 液的培養(yǎng)皿上方，用注射器針芯輕輕研壓脾臟，并用培養(yǎng)液反復(fù)淋洗，收集 脾細(xì)胞懸液；取4個(gè)10 ml離心管，每管加入5 ml小鼠淋巴細(xì)胞分離液后， 再緩慢加入脾細(xì)胞懸液2. 5 ml，離心(1500 rpm X 20 min)后吸出淋巴細(xì)胞 層，用10% FCS RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次，離心(1500 rpm X 10 min) 后傾倒上清液，加入5 ml 10% FCS RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2 X 106細(xì)胞/ml，加入ConA，使其終濃度為2. 5 ug/ml，按4 X 105細(xì)胞/孔鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。
將96孔板置37'C、 5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，再分別加入胸腺素3 4二串體 蛋白及標(biāo)準(zhǔn)品胸腺素P4(Pro-Spec公司)，使其終濃度為2 uM、 4 yM、 8 uM， 對(duì)照組加入等量的PBS，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后加入20 ul MTT(5 mg/ml)， 37°C 5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，離心(2000 rpm X 10 min)后小心吸 棄上清，加入150nlDMS0， 10min后在波長570nm處讀數(shù)，此實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次， 結(jié)果如圖7所示。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知:各濃度的胸腺素3 4二串體蛋白和標(biāo)準(zhǔn) 品胸腺素e4所對(duì)應(yīng)的吸光值均高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同一濃度 的胸腺素P 4二串體蛋白和標(biāo)準(zhǔn)品胸腺素P 4所對(duì)應(yīng)的吸光值無明顯差異。表 明各濃度的胸腺素P 4二串體蛋白和標(biāo)準(zhǔn)品胸腺素0 4均可刺激小鼠脾淋巴細(xì) 胞增殖，并且同一濃度的胸腺素3 4二串體蛋白和標(biāo)準(zhǔn)品胸腺素P 4刺激淋巴 細(xì)胞增殖的確能力相同。
6)胸腺素P 4二串體蛋白免疫原性鑒定
將12只BALB/c小鼠(6 8周齡，雄性，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心
提供)隨機(jī)分成2組，每組6只。胸腺素P4二串體蛋白免疫組腹腔注射
二串體蛋白的PBS溶液，劑量為40ug/天，對(duì)照組給予等量的PBS， 7天后
將每只小鼠摘眼球取血，血液置于4。C過夜，離心(12000 rpmX 5min， 4°C)
后收集血清，用ELISA法檢測(cè)血清中抗體滴度，具體方法如下
將胸腺素3 4二串體蛋白溶解于包被液(Na2C03 0.32 g， NaHC030.59g,
純水定容至200ml， pH9.6)中，終濃度為1 ug/ml，加入ELISA板孔中(100
ul/孔)，4匸包被過夜；倒掉包被液，加入封閉液(含1% BSA、 0.05。％
Tween-20的PBS， pH7.4)， 37。C封閉2h;棄去封閉液，用洗滌液(含0.05
% Tween-20的PBS， pH 7.4)洗6次，每次2 min，分別加入稀釋25、 50、100、 200倍的各小鼠血清，100 ul/孔，37。C孵育2 h;棄去血清，用洗漆 液洗6次，每次2min，加入二抗HRP-山羊抗鼠IgG(l: 10000) ， 100 y 1/ 孔，37。C孵育lh;棄去二抗，用洗滌液洗6次，每次2min;加入底物顯色 液(Na2HP0J2H20 0.184 g， 0^07貼0.051 g，純水定容至10 ml pH 5.0， 再加入OPD 8 mg， 30% H202 30 ul)， 100 u 1/孔，37°C，顯色10-20 min; 加入終止液(1M H2S04)， 100 "l/孔，終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀讀數(shù)，測(cè)定每孔在 490nm的吸光值。
ELISA結(jié)果如圖8所示，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知在不同血清稀釋度下， 免疫組與對(duì)照組所對(duì)應(yīng)的吸光值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明胸腺素P4二串體蛋白 免疫原性小，短期使用不會(huì)誘發(fā)抗體產(chǎn)生。重組胸腺素P 4 二串體氨基酸及核苷酸序列 <110>中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
〈120〉重組胸腺素e 4 二串體蛋白及其制備方法
<歸2
〈210〉1
〈211〉88
<212〉PRT
<213>人工合成
<400>1
Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu lie Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys Lys Thr
15 10 15 20
Glu Thr Gin Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr lie Glu Gin Glu Lys Gin Ala
21 25 30 35 40
Gly Glu Ser Gly Ser Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu lie Glu Lys Phe Asp Lys Ser
41 45 50 55 60
Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gin Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr lie Glu
61 65 70 75 80
Gin Glu Lys Gin Ala Gly Glu Ser
81 85 88
〈210>2
〈211>279
<212〉DNA
〈213〉人工合成<formula>formula see original document page 23</formula>
權(quán)利要求
1、一種重組胸腺素β4二串體蛋白，其特征在于，通過甘氨酸和絲氨酸串連兩分子的胸腺素β4(Tβ4)，其連接方式為Tβ4-Gly-Ser-Tβ4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、 一種編碼重組胸腺素P4 二串體蛋白的重組核苷酸，其特征在于，所 述重組核苷酸是用泡^U酶切位點(diǎn)連接2段胸腺素I34的基因序列，在5'端 加入M/el酶切位點(diǎn)、3，端加入終止密碼子TAG和5^I酶切位點(diǎn)，.其連接 方式為廁e I酶切位點(diǎn)-TP4基因I酶切位點(diǎn)-Tp4基因-TAG-5^ I酶 切位點(diǎn)，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3、 如權(quán)利要求2所述的編碼重組胸腺素f34二串體蛋白的核苷酸，其特 征在于，所述的重組胸腺素f34 二串體核苷酸構(gòu)建于表達(dá)載體或重組質(zhì)粒 pET-22b (+) -T卩4②，所述的pET-22b (+) -T卩4②是通過廁e I酶切位點(diǎn)和I 酶切位點(diǎn)將重組胸腺素(34 二串體核苷酸克隆入質(zhì)粒pET-22b (+)。
4、 一種重組胸腺素P4 二串體蛋白的制備方法，其特征在于，其制備方法按照以下步驟.-1)構(gòu)Ml腺素卩4二串體基因^i載體^S纟IM粒pET-22b(+)-Tp4②a) pET-22b(+)-TM①的構(gòu)建依據(jù);W桿菌偏愛的密碼子，將胸腺素卩4的ES,列轉(zhuǎn)化為cDNA序列，5' 端引入M/el酶切位點(diǎn)，3，端弓1入扁I酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)的基因序列如下 catatgagtg ataaaccgga tatggccgag attgagaaat ttgataagtc aaaattgaag aaaacggaaa ctcagga肪a gaacccgttg ccttc犯aag卿ccatcga acaggaaaag caggcggggg aaagcggatc c，AX合^Jt^基因并將其克^A^i載體pET-22b (+) I 、 M I酶切位點(diǎn)之間，得到重纟IM粒pET-22b(+)-TM①； b) pET-22b(+)—TP4②的構(gòu)建M PCR將步驟a)所述的胸腺素P 4基因兩端的酶切位點(diǎn)M/e I 、 fe出I突 ^^^zHI和&il，并引A^止密，TAG，設(shè)計(jì)PCR引嫩口下 F: cgcggatcca gtgataaacc ggatatggc R: gacgtcgacc tagctttccc ccgcctgctt ttccPCR反應(yīng)的循環(huán)，95。C!M45min后，按下列M^盾環(huán)30次94。C 30s， 65。C退火30s， 72。C延伸lmin，蔬再于72。C延伸10min;麟PCR退火產(chǎn) 物；用皿I和&71 ) XII切位點(diǎn)將PCR退^t/克^A pET-22b (+) -T P 4①，構(gòu) ^S艦粒pET-22b(+)-TM②，彭鵬立轉(zhuǎn)化鄉(xiāng)桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提 粒，^K切鑒定獲得風(fēng)期大小的插入片段，兩個(gè)胸腺素M基因在的重鄉(xiāng)頗 茅^i接方式為廁e I酶切位點(diǎn)-T 0 4基因-皿I酶切位點(diǎn)-T P 4基因-TAG-&71 酶切位點(diǎn)，賺苷^1^列如SEQ ID NO. 2戶標(biāo)；2)胸腺素j34二串體蛋白的純化a) 用重纟I^粒pET-22b (+) -T P 4^化:^i桿飾L21感免態(tài)細(xì)胞，0. OlnM IPTG 誘對(duì)h后i^^M體，按lg菌働QlOml裂菌STE緩沖液的比例將菌^E懸，戶腿的STE 緩沖液20iiM Tris-HC1 pH 7. 5， IO歸NaCl， lnM EDTA; 在冰浴中超聲,菌 體，4'C^f牛下離心12000rpmX 20min， iB^il清液，加(船2S04至頓Q度為6(B， 4。C靜置lh; 4。C^(牛下離心12000rpm X 20 min， ij^Jl清；b) 上清潮頓糊A航辨衡的疏冰瞎鵬化；用 )^^ 10個(gè)柱 床體積，1^目的蛋白胸腺素|34二串體蛋白所在 峰的 ￡液，用50倍 峰 W^的CM析，中間換C^三到四次；透析后用( ￡分平衡的陰離子交換, 蹄屯化，用0^ ^^ 10個(gè)^^^只，收集目的蛋白所在i5feE峰盼MM，用50倍^l兌峰^f只磷,緩沖^PBS透析，用0.22歸濾自濾除菌，得到純化的 胸腺素P4二串體蛋白；戶腿的A液20mM Tris-HCl pH 7. 5， 60% (肌)2804， 1 mM EDTA， B液20 mM Tris-HCl pH 7. 5， 1 nM EDTA， C液20慮Tris-HCl pH 7. 0， 1 mM EDTA， D液 20 mM Tris-HCl pH 7.0， 1 M NaCl， 1 mM EDTA。
全文摘要
重組胸腺素β4二串體蛋白及其制備方法，通過合成人胸腺素β4全長cDNA結(jié)合PCR技術(shù)，構(gòu)建了人胸腺素β4二串體基因表達(dá)載體pET-22b(+)-Tβ4②，使無法在大腸桿菌中直接表達(dá)的人胸腺素β4以二串體的形式在大腸桿菌中高效表達(dá)，并且純化的人胸腺素β4二串體蛋白具有生物學(xué)活性，可以促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞增殖，并且免疫原性低，為人胸腺素β4的進(jìn)一步研究和廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/70GK101434651SQ200810232709
公開日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者珍 張, 張英起, 李維娜, 葦 韓 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)