專利名稱：：一種通過sftpa1基因拷貝數(shù)預測高原肺水腫發(fā)病風險的試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及檢測用的試劑盒，具體涉及一種通過SFTPA1基因拷貝數(shù)預測高原肺水腫發(fā)病風險的試劑盒，用于評定人體高原肺水腫的易感性。
背景技術：
：高原肺水肺(highaltitudepulmonaryedema,縮寫HAPE)是一種特發(fā)于高原低氧環(huán)境的肺水腫，起病急，進展快，危害大，如果救治不及時，可在較短的時間內(nèi)發(fā)展至呼吸衰竭，甚至死亡，是嚴重威脅進入高原人群健康和生命的急性重癥高原病。近年的調(diào)查表明，在從平原進入海拔3000米以上高原的漢族人群中，高原肺水腫的發(fā)病率高達0.4%-2%。高原肺水腫發(fā)病有明顯的家族和個體易感傾勺，環(huán)境因素和遺傳因素均可以影響高原肺水腫的發(fā)生。近年來，遺傳因素在高原肺水腫發(fā)病機制中的作用逐漸受到重視張雪峰，高原施工人群急性重型高原病患病率調(diào)查，《高原醫(yī)學雜志》，2005;15(3):7-8;陳有，高原肺水腫發(fā)病機制研究進展，《高原醫(yī)學雜志》，2005,15(2):62-64;高鈺琪，高原肺水腫的發(fā)病機制及防治，《人民軍醫(yī)》，2005;482(2):108-111。目前，認為高原肺水腫發(fā)生的基本機制有肺動脈壓過度升高；肺毛細血管通透性增強；肺泡上皮水清除障礙；血漿膠體滲透壓降低。人的肺關聯(lián)蛋A1(surfactantpulmonary-associatedproteinAl縮寫為SFTPA1)能夠有效的清除肺泡上皮的水，當其水清除障礙后容易發(fā)生高原肺水腫，已經(jīng)有文獻報道SFTPA1的單核苷酸多態(tài)性與高原肺水腫的發(fā)生相關Saxena，AssociationofPolymorphismsinPulmonarySurfactantProteinAlandA2GenesWithHigh-AltitudePulmonaryEdema,《Chest》，2005;128(3):1611-1619。目前有文獻報道，一些基因的拷貝數(shù)與疾病的易感性相關BraudeI，Largescalecopynumbervariation(CNV)at14ql2isassociatedwiththepresenceofgenomicabnormalitiesinneoplasia,《BMCGenomics》，2006,7:138.,關于SFTPAl拷貝數(shù)與高原肺水腫易感的相關性尚無報道。通過SYBR(即SYBRGREEN染料，縮寫SYBR)定量PCR(聚合酶鏈反應)的方法檢測SFTPAl拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)SFTPAl拷貝數(shù)與高原肺水腫易感性之間存在相關性。具體做法是(1)健康對照組標本(25例)在成都采集擬進入高原人員靜脈血2ml(EDTA抗凝)，然后與他們一起乘飛機達到拉薩(海拔3658米)，并觀察他們在拉薩一周內(nèi)沒有發(fā)生高原肺水腫；(2)高原肺水腫病例組標本(25例)為與健康對照組標本年齡匹配，按高原病診斷標準我國高原病命名、分型及診斷標準，《高原醫(yī)學雜志》，1996:2-4符合高原肺水腫診斷標準的病例。樣本收集過程中遵循"赫爾辛基"宣言，本研究得到了收集對象的知情同意，采集靜脈血2ml(EDTA抗凝).(3)分別用上海生工生物技術服務有限公司UNIQ-10柱式臨床樣品基因組抽提試劑盒(貨號SK1342)提取健康對照組標本和高原肺水腫病例組標本血液白細胞DNA，然后采用定量PCR(SYBR染料法)的方法分別擴增健康對照組標本和高原肺水肺病例組標本的SFTPAl基因和核基因編碼的看家基因Beta-actin;再分別計算每例標本的SFTPAl拷貝數(shù)與Beta-actin的拷貝數(shù)的比值，結果經(jīng)SPSS12.0(—種統(tǒng)計軟件)中的獨立樣本T檢驗進行檢驗，以P<0.05為相差顯著，并通過該軟件計算出95%的可信區(qū)間，以分別得到健康對照組和高原肺水腫病例組SFTPAl/Beta-actin拷貝數(shù)的參考值，結果發(fā)現(xiàn)在高原肺水腫病例組中SFTPAl/Beta-actin的拷貝數(shù)比值顯著升高(表l)。表l高原肺水腫病例組和健康對照組中SFTPA1/Beta-actin拷貝數(shù)比值<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>高原肺水腫病例組vs健康對照組P=0.00
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測SFTPA1拷貝數(shù)的試劑盒，能用于平原人進入高原前對高原肺水腫易感者的篩選，指導高原肺水腫的預防和治療，減輕急性重癥高原病的威脅。本發(fā)明所述的一種通過SFTPAl基因拷貝數(shù)預測高原肺.水腫發(fā)病風險的試劑盒，包括分離包裝的SFTPA1引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反應液，無菌去離子水，定值標準品，健康對照DNA，其特征是，所述的SFTPA1引物混合液中的上游引物(F)和下游引物(R)的序列為F:5'-GCTCCATAATGACAGTAGGA-3'和R:5'-CGTCTGAGTAGCGGAAGT-3';所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列為F:5，-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3，和R:5，-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3，；所述的PCR反應液，含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs(脫氧核苷三磷酸)、SYBR染料、ExTaq酶；所述的定值標準品是用Beta-actin的上下游引物在PTC〈OOPCR儀中進行目的片段的擴增，得到含有目的片段的PCR產(chǎn)物，然后將目的片段插入克隆栽體pMD18-T中，并將陽性克隆增菌后測序驗證；從證實含Beta-actin基因片段的菌液中提取質(zhì)粒。所述的一種通過SFTPA1基因拷貝數(shù)預測高原肺水腫發(fā)病風險的試劑盒，其所述的健康對照DNA是采集擬進入高原前的人員的靜脈血2ml(EDTA抗凝)，并且到高原后在一周內(nèi)沒有發(fā)生高原肺水腫，然后提取血液白細胞DNA，再將DNA濃度調(diào)為50ng/y1。所述的一種通過SFTPA1基因拷貝數(shù)預測高原肺水腫發(fā)病風險的試劑盒，其所述的SFTPA1引物混合液為100pl;其中上游引物和下游引物各50y1,濃度均為10pmo1/p1。所述的一種通過SFTPA1基因拷貝數(shù)預測高原肺水腫發(fā)病風險的試劑盒，其所述的Beta-actin引物混合液為400ji1;其中上游引物和下游引物各200"1，濃度均為10pmol/p1,所述的一種通過SFTPA1基因拷貝數(shù)預測高原肺水腫發(fā)病風險的試劑盒，其所述的定值標準品用無菌去離子水倍比稀釋為5管，每管體積200jil，濃度分別為lxl04、lxl05、lxl06、lxl07、lxi()8拷貝/nl。所述的一種通過SFTPA1基因拷貝數(shù)預測高原肺水肺發(fā)病風險的試劑盒，其所述的無菌去離子水為1500]il。本發(fā)明建立了利用定量PCR(SYBR染料法)方法檢測來SFTPA1拷貝數(shù)的方法，能用于平原人進入高原前對高原肺水腫易感者的篩選，指導高原肺水腫的預防和治療，減輕急性重癥高原病的威脅，有利于進入高原人群健康；該試劑盒使用簡單，操作方便，檢測快速。具體實施例方式本發(fā)明所述的一種通過SFTPA1基因拷貝數(shù)預測高原肺水腫發(fā)病風險的試劑盒，包括分離包裝的SFTPA1引物混合液，BeU-actin引物混合液，PCR反應液，無菌去離子水，定值標準品，健康對照DNA;試劑盒中的SFTPA1引物混合液中的上游引物和下游引物的序列為F:5'-GCTCCATAATGACAGTAGGA-3'和R:-CGTCTGAGTAGCGGAAGT-3';試劑盒中的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列為F:5，-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3，和R:5，-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3，；試劑盒中的PCR反應液，含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs(脫氧核苷三磷酸)、SYBR染料、ExTaq酶，直接購于寶生物工程(大連)有限公司，貨號DRR041S。試劑盒中的定值標準品是用BeU-actin的上下游引物在PTC-200PCR儀中進行目的片段的擴增，得到含有目的片段的PCR產(chǎn)物，然后將目的片段插入克隆載體pMD18-T中，并將陽性克隆增菌后測序驗證；從證實含Beta-actin基因片段的菌液中提取質(zhì)粒。試劑盒中的健康對照DNA是采集擬進入高原前的人員的靜脈血2ml(EDTA抗凝)，并且到高原后在一周內(nèi)沒有發(fā)生高原肺水腫，然后，提取血液白細胞DNA，再將DM濃度調(diào)為50ng/p1,試劑盒中的SFTPA1引物混合液為100y1;其中上游引物和下游引物各50p1，濃度均為10pmol/n1。試劑盒中的Beta-actin引物混合液為400pl;其中上游引物和下游引物各200pl，濃度均為10pmol/p1,試劑盒中的定值標準品用無菌去離子水倍比稀釋為5管，每管體積200n1，濃度分別為lx104、lx105、lxlO'、lx107、lxlO-拷貝/pl。試劑盒中的無菌去離子水為1500p1試劑盒中的定值標準品用Beta-actin上下游引物，在PTC-200PCR儀中進行擴增，條件為94。C預變性5min，94C變性30s，60X:退火30s，72'C延伸45s，94。C變性30s，60。C退火30s，72。C延伸45s……其中94°C變性30s，60'C退火30s,72。C延伸45s循環(huán)29次，72"C終末延伸8min，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后用將目的片段(擴增產(chǎn)物)插入克隆載體pMD18-T(購于寶生物工程有限公司)中，并將陽性克隆增菌后測序驗證；從證實含有Beta-actin基因片段的菌液中提取質(zhì)粒，采用分光光度儀測得質(zhì)粒濃度，再算出摩爾濃度(質(zhì)量除以堿基數(shù)+324.5+10),再乘以阿拂加的羅常數(shù)(6.02x10")，得到質(zhì)粒的濃度為lxl()S拷貝/iil。將質(zhì)粒進行倍比稀釋(共稀釋五個梯度)，稀釋后將標準品(即上述質(zhì)粒)分別裝在200nl小管內(nèi)，于-20'C的冰箱內(nèi)保存，避免質(zhì)粒反復凍融導致降解；健康對照DNA，在成都采集擬進入高原人員靜脈血2ml，然后與他們一起乘飛機達到拉薩，并觀察他們一周且在這周內(nèi)沒有發(fā)生高原肺水腫，抽取靜脈血2ml(EDTA抗凝)并提^Uk液白細胞DNA。該試劑盒的使用說明第一步，待測個體樣品準備，采用上海生工生物技術服務有限公司UNIQ-10柱式臨床樣品基因組抽提試劑盒(貨號SK1342)提取待測個體靜脈血液中白細胞基因組總DNA,然后用紫外分光光度儀對DNA進行定量；第二步，PCR反應體系配制，共配制十管；第一管到第五管為定值標準品，共5管，濃度分別為取10pl濃度為1x108拷貝/"1的質(zhì)粒；取10pl濃度為1x10'拷貝/y1的質(zhì)粒，加入90pl無菌去離子水，混勻得到濃度為lxl(T拷貝/p1的質(zhì)粒；取lOy1濃度為1x107拷貝/^1的質(zhì)粒，加入90p1無菌去離子水，混勻得到濃度為lxl()6拷貝/nl的質(zhì)粒；取10pl濃度為1x1(^拷貝/ia1的質(zhì)粒，加入90iil無菌去離子水，混勻得到濃度為lxl()5拷貝/nl的質(zhì)粒；取10pl濃度為1x1()5拷貝/p1的質(zhì)粒，加入90pl無菌去離子水，混勻得到濃度為lxl(T拷貝/nl的質(zhì)粒；各取O.5yl濃度從lxl(T至lxl()8拷貝/y1的標準品，然后，每管都依次加入Beta-actin引物混合液lpl，PCR反應液12.5|i1，無菌去離子7jC11P1，混勻；第六管為待測個體SFTPA1的擴增，取待測個體的DMO.5pl，然后，依次加入sftpa1引物混合液1n1，pcr反應液12.5jj1，無菌去離子水llyl,混勻；第七管為待測個體看家基因Beta-actin的擴增，取待測個體的DM0.5p1,然后依次加入Beta-actin引物混合液lpl，PCR反應液12.5m1，無菌去離子水llpl，混勻；第八管為空白對照，分別取Beta-actin引物混合液1y1,PCR反應液12.5)il，無菌去離子水11.5pl，混勻；第九管為健康對照樣本SFTPA1的擴增，取對照DM0.5^1，然后依次加入SFTPA1引物混合液lpl，PCR反應液12.5pl,無菌去離子水llnl，混勻；第十管為健康對照樣本看家基因Beta-actin的擴增，取對照DNA0.5pl，然后依次加入Beta-actin引物混合液lpl，PCR反應液12.5m1，無菌去離子水11ia1,混勻；第三步，PCR擴增條件，將第二步的十管已經(jīng)混勻的物質(zhì)分別;^文入Opticonmonitor1定量PCR儀中，均按以下條件進行PCR反應95'C預變性10s;95。C變性5s，6(TC退火延伸20s，讀板，重復39個循環(huán)；其中，SFTPA1引物擴增產(chǎn)物長度為196bp,序列如下cca1ggagacttccgctactcagacg'，Beta-actin引物擴增產(chǎn)物長度為180bp，序列如下cgggaaatcgtgcgtgacatcaagaagctgtgctacgtcgccctggacttcgagcgggagatggccatggtggccyccagctcctccctggagaagagctacaagctgctcgatggccaggtcatcaccatcggcaacgagcggttccactgccccgaggcgctcttccagccttccttCo第四步，數(shù)據(jù)分析，PCR反應結束后，定量PCR儀通過比較待測標本的Ct值與標準曲線Ct值，自動生成每例樣本SFTPA1和Beta-actin的拷貝數(shù)，然后，分別用待測個體和對照的SFTPA1拷貝數(shù)除以Beta-actin拷貝數(shù)，分別求得待測個體和對照的SFTPA1/Beta-actin拷貝數(shù)比值，如果對照的SFTPA1/Beta-actin(第九管/第十管)拷貝數(shù)比值位于0.2580-0.3505之間時，提示我們實驗準確性和靈敏度可信，當此時待測個體(第六管/第七管)的拷貝數(shù)比值位于高原肺水腫易感者的該基因拷貝數(shù)(0.1718-0.2483)之間時，提示我們該個體有可能就是高原肺水腫的易感個體。第一至第五管為定值標準品的擴增，以荻得標準曲線；第六、七管是為了獲得待測個體的SFTPA1基因和Beta-actin基因的拷貝數(shù)；第八管為空白對照管，以檢測整個PCR過程中是否有污染；第九、十管是為了獲得健康對照的SFTPA1基因和Beta-actin基因的拷貝數(shù)。序列表<110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學<120>—種通過SFTPA1基因拷貝數(shù)預測高原肺水腫發(fā)病風險的試劑盒<130><140>200810232918.3<141>2008-10-24<160>6<170>Patentln3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<221>SFTPA1上游引物<400>1gctccataatgacagtagga20<210>2<211>19<212>DNA<213>人工合成<221>SFTPA1下游引物<400>2cgtctgagtagcggaagt<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成<221>Beta-actin上游引物<400>3cgggaaatcgtgcgtgacat20<210>4.<211>20<212>DM<213>人工合成<221>Beta—actin下游引物<400>4gaaggaaggctggaagagtg20<210〉5<211>222<212>DNA<213>SFTPA1核,列<221>SFTPA1PCR擴增產(chǎn)物<400>5gctccataatgacagtaggagagaaggtcttctccagcaatgggcagtccatcacttttg60atgccattcaggaggcatgtgccagagcaggcggccgcattgctgtcccaaggaatccag120aggaaaatgaggccattgcaagcttcgtgaagaagtacaacacatatgcctatgtaggcc180tgactgagggtcccagccctggagacttccgctactcagaeg222<210>6<211>180<212>腿<213>Beta-actin核紗列<221>Beta-actinPCR擴增片段<400>6cgggaaatcgtgcgtgacatcaagaagctgtgctacgtcgccctggacttcgagcgggag60atggccatggtggccyccagctcctccctggagaagagctacaagctgctcgatggccag120gtcatcaccatcggcaacgagcggttccactgccccgaggcgctcttccagccttccttc180權利要求1、一種通過SFTPA1基因拷貝數(shù)預測高原肺水腫發(fā)病風險的試劑盒，包括分離包裝的SFTPA1引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反應液，無菌去離子水，定值標準品，健康對照DNA，其特征是，所述的SFTPA1引物混合液中的上游引物和下游引物的序列為F5′-GCTCCATAATGACAGTAGGA-3′和R5′-CGTCTGAGTAGCGGAAGT-3′；所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列為F5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’和R5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’；所述的PCR反應液，含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、SYBR染料、ExTaq酶；所述的定值標準品是用Beta-actin的上下游引物在PTC-200PCR儀中進行目的片段的擴增，得到含有目的片段的PCR產(chǎn)物，然后將目的片段插入克隆載體pMD18-T中，并將陽性克隆增菌后測序驗證；從證實含Beta-actin基因片段的菌液中提取質(zhì)粒。2、根據(jù)權利要求1所述的一種通過SFTPA1基因拷貝數(shù)預測高原肺水腫發(fā)病風險的試劑盒，其特征是，所述的健康對照DNA是采集擬進入高原前的人員的靜脈血2ml，并且到高原后在一周內(nèi)沒有發(fā)生高原肺水腫，然后，提取血液白細胞DNA，再將DNA濃度調(diào)為50ng/n1。3、根據(jù)權利要求1所述的一種通過SFTPA1基因拷貝數(shù)預測高原肺水腫發(fā)病風險的試劑盒，其特征是，所述的SFTPA1引物混合液為100n1;其中上游引物和下游引物各50jli1，濃度均為10pmol/y1。4、根據(jù)權利要求1所述的一種通過SFTPA1基因拷貝數(shù)預測高原肺水腫發(fā)病風險的試劑盒，其特征是，所述的Beta-actin引物混合液為400pl;其中上游引物和下游引物各200p1，濃度均為1Opinol/Ml。5、根據(jù)權利要求1所述的一種通過SFTPA1基因拷貝數(shù)預測高原肺水腫發(fā)病風險的試劑盒，其特征是所述的定值標準品用無菌去離子水倍比稀釋為5管，每管體積200Ml，濃度分別為lx104、lxl05、lx106、lxio7、lxi(y拷貝/6、根據(jù)權利要求1所述的一種通過SFTPA1基因拷貝數(shù)預測高原肺水腫發(fā)病風險的試劑盒，其特征是，所述的無菌去離子水為1500jil。全文摘要本發(fā)明涉及一種通過SFTPA1基因拷貝數(shù)預測高原肺水腫發(fā)病風險的試劑盒，包括分離包裝的SFTPA1引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反應液，無菌去離子水，定值標準品，健康對照DNA，其特征是，SFTPA1引物混合液中的上游引物和下游引物的序列為F5′-GCTCCATAATGACAGTAGGA-3′和R5′-CGTCTGAGTAGCGGAAGT-3′；所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列為F5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’和R5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’。本發(fā)明能用于平原人進入高原前對高原肺水腫易感者的篩選，指導高原肺水腫的預防和治療，有利于進入高原人群健康；該試劑盒使用簡單，操作方便，檢測快速。文檔編號C12Q1/68GK101418345SQ200810232918公開日2009年4月29日申請日期2008年10月24日優(yōu)先權日2008年10月24日發(fā)明者劉福玉,羅勇軍,高文祥,高鈺琪申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學