專利名稱：用于檢測煙草根黑腐病菌的引物、探針及實(shí)時熒光pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適合于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物保護(hù)等部門使用的生物工程技術(shù)，特 別是 一 種用于檢測煙草生產(chǎn)中的土傳病害——煙草根黑腐病病原菌 w'o/^is》ssicWs的引物、探針及實(shí)時熒光PCR試劑盒。
背景技術(shù)：
煙草根黑腐病是煙草上的重要病害之一，它遍布世界主要產(chǎn)煙區(qū)，在美國、加拿大、 曰本等國曾使煙草生產(chǎn)遭受嚴(yán)重?fù)p失，我國主產(chǎn)煙區(qū)也均有發(fā)生。尤其近年來，此病在一 些煙區(qū)蔓延，在我國云南、貴州、湖北等省發(fā)生較重，嚴(yán)重地塊發(fā)病率可達(dá)30%以上。山 東、河南、安徽、吉林、福建等省也有發(fā)生，近年有加重危害的趨勢。
目前對于植物病原真菌的檢測方法主要有免疫學(xué)技術(shù)，分子標(biāo)記技術(shù)和常規(guī)PCR技術(shù)， 但這些技術(shù)只能確定病原微生物的有無，卻不能對病原真菌的分生孢子及厚亙孢子數(shù)目進(jìn) 行準(zhǔn)確的定量。而傳統(tǒng)的植物病原真菌檢測定量方法是選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)計數(shù)法，但選擇 性培養(yǎng)基培養(yǎng)計數(shù)周期長，耗費(fèi)人力，而且需要操作者具有豐富的形態(tài)學(xué)知識，因而限制 了選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)計數(shù)法的應(yīng)用。
繼常規(guī)PCR檢測技術(shù)之后，新興的實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)憑借其對初始模板 量準(zhǔn)確定量、靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡便迅速等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為國內(nèi)外分子生物 學(xué)研究中的主流技術(shù)，同樣也在植物病原體的檢測和診斷中得到了廣泛使用。近 年來國內(nèi)外陸續(xù)開始將實(shí)時熒光PCR技術(shù)應(yīng)用于植物病害診斷檢測。
實(shí)時定量熒光PCR是利用熒光信號伴隨著PCR產(chǎn)物的增加而增強(qiáng)的原理，在PCR擴(kuò)增 過程中，連續(xù)不斷地檢測反應(yīng)體系中熒光信號的變化。根據(jù)熒光信號基線的平均值和平均 標(biāo)準(zhǔn)差，在99.7%的置信度時計算出大于平均值的熒光值即閾值，然后收集熒光信號增強(qiáng) 到預(yù)定閾值時的PCR循環(huán)次數(shù)(即Ct值)。該參數(shù)和PCR反應(yīng)體系中起始DNA模板量的對 數(shù)值之間有嚴(yán)格的線性關(guān)系。利用陽性梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)檢 測樣品的Ct值就可以準(zhǔn)確地測定耙標(biāo)病原菌的起始模板拷貝數(shù)。實(shí)時熒光PCR根據(jù)其產(chǎn)生 熒光的原理分為使用探針和不使用探針的兩類方法。由于探針與待檢測病原菌DNA序列有 很高的特異性，而且可以有效避免常規(guī)PCR的假陽性問題，所以目前使用較為普遍的是熒 光標(biāo)記探針法。
實(shí)時熒光PCR檢測方法用于植物病原菌的檢測，在國內(nèi)外都還是剛剛起步。目前，在煙草根黑腐病菌的實(shí)時熒光PCR檢測中，以5，-ACC ATA TGT GAA CGT ACC TTT TCT -3，和5，- AGT TTA TAA ATG CTA CCG GCA GAA -3'為引物、以5，- CCC GAG AGG CAC CTGCCAAAGCA -3'序列為探針制備成相應(yīng)的實(shí)時熒光PCR試劑盒，尚無相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一就是提供一種用于檢測煙草根黑腐病菌的引物，它可以在 PCR檢測過程中，定性檢測煙草根黑腐病菌，而且特異性強(qiáng)。
本發(fā)明所提供用于檢測煙草根黑腐病菌的引物包括正向引物Tbl和反向引物Tb2組成 的引物對，所述正向引物Tbl的核苷酸序列見序列表中的序列1所示，Tbl: 5'-ACCATATGT GAA CGT ACC TTT TCT -3，；所述反向引物Tb2核苷酸序列見序列表中的序列2所示，Tb2: 5，- AGT TTA TAA ATG CTA CCG GCA GAA -3，。
申請人是經(jīng)過長期大量的實(shí)驗(yàn)，從眾多用于檢測煙草根黑腐病菌的PCR引物中篩選 出上述的由正向引物Tbl和反向引物Tb2組成的引物，其擴(kuò)增片段大小為76 bp。該引物 的特點(diǎn)是對煙草根黑腐病菌具有高度的保守性，與其它近緣生物種之間不具有顯著的同源 性，用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)煙草根黑腐病菌的準(zhǔn)確定性檢測，且特異性強(qiáng)。
本發(fā)明的目的之二就是提供一種用于檢測煙草根黑腐病菌的探針，它可以在實(shí)時 熒光PCR檢測過程中，定量檢測煙草根黑腐病菌，顯著地提高檢測靈敏度。該探針 的堿基序列是在5，- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3，兩端向上移位2個堿基或下游 移位3個堿基區(qū)域內(nèi)的任意一條核苷酸序列，所述探針一端連接有熒光淬滅基團(tuán)，另一端 連接有熒光報告基團(tuán)。
所述探針熒光報告基團(tuán)標(biāo)記在5'端，熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記在3'端，構(gòu)成熒光標(biāo)記探針。
所述探針是在5，- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3'向上游移位2個堿基的核苷 酸序列5，- GCC CCG AGA GGC ACC TGC CM AGC A -3,，見序列表中的序列4所示。
所述探針的核苷酸序列是序列表中的序列3所示的序列5'- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3，。
所述探針是在5，_ CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3，向下游移位3個堿基的核苷 酸序列5，- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CAG CT -3'，見序列表中的序列5所示。
本發(fā)明的目的之三就是提供一種利用目的一中的引物和目的二中的探針制成 的檢測煙草根黑腐病菌的試劑盒，可以在實(shí)時熒光PCR檢測過程中，快速、準(zhǔn)確 地定量檢測土壤中和植株上的煙草根黑腐病菌，而且穩(wěn)定可靠、靈敏度高。所述試 劑盒還包括待測樣品提取試劑、定量標(biāo)準(zhǔn)品、實(shí)時熒光PCR反應(yīng)液和檢測用品，所述實(shí)時熒光PCR反應(yīng)液包括有如下的組份及其相對應(yīng)的終濃度PCR緩沖液10%; MgCl2: 2.6
mmol/L; dNTPs: 0.2腿ol/L; Taq DNA聚合酶:1 U/20 PL;正向引物Tbl: 0.4 Pmol/L; 反向引物Tb2: 0.4 tool/L;熒光標(biāo)記探針0.4 Mmol/L;采用無菌超純水調(diào)整終濃度。
根據(jù)實(shí)際情況，在實(shí)時熒光PCR反應(yīng)液中各組份采用的是PCR緩沖液是10xPCR緩 沖液；MgCl2的初濃度是25隱ol/L; dNTPs的初濃度是10醒ol/L; Taq DNA聚合酶的初濃 度是正向引物Tbl的初濃度是lOWnol/L;反向引物Tb2的初濃度是10 Mmol/L; 熒光標(biāo)記探針的初濃度是5 Mmol/L; PCR緩沖液、MgCl2、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶、正向 引物Tbl、反向引物Tb2、熒光標(biāo)記探針的體積比是20:21:4:4:8:8:16。該熒光定量PCR 擴(kuò)增體系具有很高的靈敏度，檢測目標(biāo)菌DNA的量達(dá)到IOO fg/化。
在實(shí)時熒光PCR反應(yīng)液中，各組份采用的是PCR緩沖液是10xPCR緩沖液；MgCl2的 初濃度是25 mmol/L; dNTPs的初濃度是2 mmol/L; Taq DNA聚合酶的初濃度是1 U/pL; 正向引物Tbl的初濃度是5剛ol/L;反向引物Tb2的初濃度是5 Wnol/L;熒光標(biāo)記探針的 初濃度是5 Wnol/L; PCR緩沖液、MgCl2、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶、正向引物Tbl、反向引 物Tb2、熒光標(biāo)記探針的體積比是20:21:20:10:16:16:16。該熒光定量PCR擴(kuò)增體系具 有很高的靈敏度，檢測目標(biāo)菌DNA的量達(dá)到IOO fg/A。
采用本發(fā)明中的試劑盒， 一方面，在待測樣品預(yù)處理過程中，待測樣品提取試劑可以 直接提取土壤樣品中的煙草根黑腐病菌DNA用作PCR擴(kuò)增模板，節(jié)約了時間；另一方面， 在待測樣品的實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增過程中，直接將己按最佳組份及其體積比配制好的實(shí)時熒 光PCR反應(yīng)液加入八連管中，既節(jié)約了大量的時間，且穩(wěn)定可靠，從而達(dá)到了快速、準(zhǔn)確 地檢測土壤中和植株上的煙草根黑腐病菌。
由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)
(1) 特異性強(qiáng)本發(fā)明中引物和探針均根據(jù)煙草根黑腐病菌特異性序列設(shè)計，并與其 它生物種比對，沒有顯著同源性，檢測特異性強(qiáng)；
(2) 靈敏度高利用本發(fā)明中實(shí)時熒光PCR試劑盒對煙草根黑腐病菌進(jìn)行檢測時，可 以準(zhǔn)確定量，目標(biāo)菌DNA在lOngAt-100fg/化濃度范圍內(nèi)，都有很好的線性關(guān)系，靈敏 度高；
(3) 實(shí)用性好本發(fā)明中實(shí)時熒光PCR試劑盒具有開啟即用、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一、簡單方便等 優(yōu)點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確地檢測田間土壤中和植株上的煙草根黑腐病菌，實(shí)用性好；
(4) 應(yīng)用范圍廣可以定量檢測土壤和植株上的煙草根黑腐病菌，適用于煙草根黑腐 病菌田間動態(tài)監(jiān)測和病害診斷，同時可用于煙草根黑腐病菌在煙草植株中的增殖速度和種子帶菌的定量檢測。
綜上所述，采用本發(fā)明，能在田間帶病土壤中和植株上快速、準(zhǔn)確地檢測煙草根黑腐 病菌，從而為及時采取措施切斷病害的侵染源提供準(zhǔn)確依據(jù)，也可以快速、準(zhǔn)確地檢測植 株上的病害，其意義十分重大。


圖1熒光定量擴(kuò)增體系特異性檢測 圖2A熒光定量PCR陽性標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線 圖2B熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖3實(shí)際樣品檢測
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明-
在本發(fā)明中，用于檢測煙草根黑腐病菌的引物包括正向引物Tbl和反向引物Tb2，其 堿基序列分別是
Tbl: 5，- ACC ATA TGT GAA CGT ACC TTT TCT _3'，見序列表中的序列1所示； Tb2: 5，- AGT TTA TAA ATG CTA CCG GCA GAA -3，，見序列表中的序列2所示。 用設(shè)計的特異引物對進(jìn)行同源性比對后發(fā)現(xiàn)特異引物對只與煙草根黑腐病菌具有高度的保 守性，與其它近緣生物種之間不具有顯著的同源性，而其他同源性較高的物種在土壤中存 在的可能性極小，說明該引物對的特異性很高。為了更好的驗(yàn)證引物的特異性，在熒光定 量PCR實(shí)驗(yàn)中采用如下土壤中常見的土傳病原菌，如煙草疫霉病菌 7 ic。fi朋ae)，甘薯黑斑病(Cers^ cyW5"/y/ Ar!'ate)惡疫霉(尸力j^9p/ ^ ora ca"or"/z )， 煙草白星病菌(Carcc^jDara"icotJ'a/7ae)， 棉花立枯病病菌(尸iA5aric"/z ay/^; Qry"歷)，棉 花黃妻病菌(Ker"cj7Ji"/z7ok/7iJyae)， 歐文式桿菌(￡nri/w'a car。f。Kora)，枯草芽抱桿 菌(5aci"〃s s〃/7Z^7is)，煙草青枯病菌(/feJsto/7ia w7a/ acear"yz7)和分離培養(yǎng)的土壤 優(yōu)勢菌作為陰性對照菌(表l)，分別提取其基因組DNA，紫外分光光度計檢測其濃度和純 度后，將DNA濃度調(diào)整到50 ng/叱。熒光定量擴(kuò)增曲線(圖l)結(jié)果表明，所有陰性對照 菌都沒有起始擴(kuò)增(Ct=N/A)，再次驗(yàn)證了所設(shè)計的引物對具有很高特異性。 表l
熒光定量PCR供試菌株 _,_—__
齒種 來源 擴(kuò)增結(jié)果
7煙草根黑腐霉(77//e/"v/o戸"6ay/cW") 煙草 +a
甘薯黑斑病(Cera/00/5to力附Z)r/",") 甘薯 一b
煙草疫霧(尸/2聲6ip/^/2ora m'co/towae) 煙草 一
惡疫霉(尸一6^ 她ora c""w訓(xùn)) 人參，蘋果 一
煙草白星病菌(Ce/rMpora ) 煙草 一
棉花立枯病病菌(Fw"r/cww oxj^W7'w附)棉花 一
棉花黃萎病菌(pfe"/a'〃/w附d"/2z7/"e) 棉花 —
歐文式桿菌(5HWm'"cw^ovora) 胡蘿卜，大白菜 一
枯草芽孢桿菌(5"cz7/^57^rifc) 土壤 一
煙草青枯病菌(i "too"/" TO/a"ace"ra加) 煙草 一
分離培養(yǎng)的土壤優(yōu)勢菌I (N/Ae) 土壤 一
分離培養(yǎng)的土壤優(yōu)勢菌II(N/A) 土壤 一
分離培養(yǎng)的土壤優(yōu)勢菌III(N/A) 土壤 一
a+陽性b—陰性
°N/A未知
在本發(fā)明中，用于檢測煙草根黑腐病菌的探針，它的堿基序列是在5'-CCCGAGAGGCAC CTG CCA AAG CA -3'兩端向上移位2個堿基或下游移位3個堿基區(qū)域內(nèi)的任意一條核苷酸 序列，在該條核苷酸序列上，熒光報告基團(tuán)標(biāo)記在5'端，熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記在3'端，以構(gòu) 成熒光標(biāo)記探針。
在由正向引物Tbl和反向引物Tb2組成的引物的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)，按照探針的設(shè)計原理和 設(shè)計方法，設(shè)計出用于煙草根黑腐病菌實(shí)時熒光PCR檢測的探針，它的堿基序列是在5'-CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3'兩端向上移位2個堿基或下游移位3個堿基區(qū)域內(nèi)的任 意一條核苷酸序列；用設(shè)計的探針進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增，對所設(shè)計的探針進(jìn)行篩選；根 據(jù)實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增的結(jié)果，最后篩選出最佳探針。
在5，- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3，向上游移位2個堿基的核苷酸序列可以 是5'- GCC CCG AGA GGC ACC TGC CAA AGC A -3，，見序列表中的序列4所示。
熒光標(biāo)記探針的核苷酸序列也可以是5，- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3，， 見序列表中的序列3所示，它是最佳的實(shí)施方式。
在5'- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3，向下游移位3個堿基的核苷酸序列還可 以是5，- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CAG CT -3，，見序列表中的序列5所示。在熒光標(biāo)記探針的5'端標(biāo)有記報告基團(tuán)FAM， 3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)T扁RA 。當(dāng) 探針完整的時候，報告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測不到信號。隨著 PCR進(jìn)行，TaqDNA聚合酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5' —3'外切核酸酶 活性就會將探針切斷，報告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號，報 告基團(tuán)所釋放的熒光可以被定量檢測儀內(nèi)的熒光計檢測，模板每復(fù)制一次，就有一個探針 被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PCR產(chǎn)物數(shù)量是一對一 的關(guān)系，所以熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈比例關(guān)系。Ct值是PCR過程中熒光量的 積累超過基底熒光量的循環(huán)數(shù)。利用陽性梯度標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測 樣品的Ct值可準(zhǔn)確地定量被檢測樣品中煙草根黑腐病菌的濃度，從而顯著提高檢測靈敏 度。
本發(fā)明所述的檢測煙草根黑腐病菌的試劑盒，它包括有待測樣品提取試劑、定量標(biāo)準(zhǔn) 品、實(shí)時熒光PCR反應(yīng)液和檢測用品，所述實(shí)時熒光PCR反應(yīng)液包括有如下的組份及其相 對應(yīng)的終濃度PCR緩沖液10%; MgCl2: 2.6 mmol/L; dNTPs: 0.2咖ol/L; Taq DNA聚 合酶1 U/25叱；正向引物Tbl: 0.4 Mfliol/L;反向引物Tb2: 0.4 Mmol/L;熒光標(biāo)記探
針0.4 WTK)1/L;采用無菌超純水調(diào)整終濃度。
待測樣品提取試劑由土壤DNA提取緩沖液和TE緩沖液組成，其中TE緩沖液是常規(guī)試 劑，是根據(jù)《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(第四版)》中相關(guān)方法配制而成的。
定量標(biāo)準(zhǔn)品包括基于煙草根黑腐病菌特有核酸序列設(shè)計的標(biāo)準(zhǔn)陽性對照模板和陽性標(biāo) 準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)陽性對照模板由含有插入目標(biāo)片段的pMD18-T載體(Takara)制備而成。制備 過程為采用引物Tbl和Tb2擴(kuò)增煙草根黑腐病菌基因組DNA， PCR產(chǎn)物電泳后切膠回收 目標(biāo)片段，與pMD18-T載體于16'C下連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞， 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含有X-gal和IPTG的氨芐青霉素平板上培養(yǎng)，挑取白斑，搖菌后采用質(zhì)粒 提取試劑盒(Omega Biotek Inc.)提取質(zhì)粒，通過酶切和測序鑒定陽性克隆。陽性克隆的 質(zhì)粒DNA經(jīng)紫外分光光度計A娜定量，經(jīng)10x梯度稀釋為10 ng/叱-100 fg/叱，保存于-20 。C 。
實(shí)時熒光PCR反應(yīng)液包括有如下的組份及其相對應(yīng)的終濃度PCR緩沖液10%; MgCl2:
2. 6ramol/L; dNTPs: 0,2鵬ol/L; TaqDNA聚合酶1 U/20 ^L;正向引物Tbl: 0. 4 Mraol/L; 反向引物Tb2: 0.4 Wnol/L;熒光標(biāo)記探針0.4 Wnol/L;采用無菌超純水調(diào)整終濃度。 其中，PCR緩沖液、MgCl2、 dNTPs、 DNA聚合酶都是PCR常規(guī)試劑，均購自北京鼎國生物技 術(shù)責(zé)任有限公司，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，熒光標(biāo)記探針在Takara公司合成。
檢測用品包括有自封式塑料袋和0.2 mL八連管。
在利用目的一中的引物和目的二中的最佳探針的基礎(chǔ)上，優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條 件，確定最佳的煙草根黑腐病菌實(shí)時熒光PCR檢測體系。
本發(fā)明優(yōu)化的實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系總體積為20 ^ ，其中10xPCR緩沖液 25咖ol/L MgCl2 2. 6叱，2咖ol/L， dNTPs 2. 0叱，2. 5 U/叱Taq DNA聚合酶0. 4叱，5 rtnol/L正向引物Tbl和反向引物Tb2各1. 6叱，5 Mmol/L熒光標(biāo)記探針1. 6叱，DNA模板 1.0叱，無菌超純水8.8 PL。實(shí)時熒光PCR采用兩步法，擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4r， 4 min; 然后42個循環(huán)，每個循環(huán)為94。C， 10 s, 60°C， 20s,在每個循環(huán)的退火/延伸階段(60°C) 收集熒光。
利用本發(fā)明中的實(shí)時熒光PCR試劑盒對煙草根黑腐病菌進(jìn)行檢測，包括待測樣品預(yù)處 理和待測樣品的實(shí)時熒光PCR反應(yīng)。
待測樣品PCR擴(kuò)增模板的制備和待測樣品的實(shí)時熒光PCR反應(yīng)。 待測樣品PCR擴(kuò)增模板的制備為土壤樣品PCR擴(kuò)增模板的制備。 土壤的制樣品PCR擴(kuò)增模板備
(1) 稱取0.5克土壤樣品于5 mL離心管中，加入0.2 g聚乙烯聚吡咯垸酮(PVPP)，渦 旋30 s，再加入3 mL DNA extraction buffer (100腦1/L Tris-HCl， 100mmol/L EDTA， 100mmol/L Na3P04, 1. 5mol/L NaCl, 1% CTAB ,pH8. 0)混合均勻；
(2) 迅速置于-196 。C液氮中冰凍2min，取出后于65 。C水浴融解(約3 min，注意時 間不能太長，融解后馬上取出)，如此反復(fù)2-3次裂解細(xì)胞；
(3) 加入20 HL 10 mg/mL蛋白酶K、 0.5 mL 50 rag/mL溶菌酶，上下顛倒混勻，置于 37 。C搖床上振蕩30 min (225 r/min);
(4) 加入600 PL 10%SDS， 65 。C水浴30 min，其間每隔5-10 rain輕輕顛倒混勻；
(5) 室溫離心(12，000 r/min) 10 min，收集上清液，轉(zhuǎn)移到另一新的5 mL離心管中；
(6) 土壤沉淀再加入0. 5 mL提取液和100叱10% SDS，渦旋30 s， 65 。C水浴10 min， 室溫離心(12，000 r/min) 10 min，收集上清液并與前次上清液合并；
(7) 上清液中加入0. 05gPVPP，室溫結(jié)合20min后，室溫離心(12， 000 r/min) 10 min， 收集上清液，轉(zhuǎn)移到另一新的5 mL離心管中；
(8) 上清液用等體積的氯仿/異戊醇(24:1)抽提兩次，離心(12'000 r/min， 10 min) 后吸取水相轉(zhuǎn)移至另一5 mL離心管中；(9) 用預(yù)冷的0. 6倍體積異丙醇室溫沉淀30 min，室溫離心(12,000 r/min) 10 min， 收集核酸沉淀；
(10) 用冷的70%無水乙醇洗滌沉淀兩次，自然吹干，溶解于100化滅菌的超純水中。 待測樣品的實(shí)時熒光PCR反應(yīng)步驟為
(1) 將實(shí)時熒光PCR儀開機(jī)設(shè)置備用；
(2) 向0. 2 mL八連管中加入18叱實(shí)時熒光PCR反應(yīng)液和1叱起始濃度為10 mg/mL 的牛血清蛋白(BSA);
(3) 加入l叱待測樣品液，將試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)陽性對照模板加入陽性對照管中， 陽性標(biāo)準(zhǔn)管中加入陽性標(biāo)準(zhǔn)品的10x梯度稀釋液，1叱滅菌去離子水代替模板作為空白對 照，對照樣品的用量均為每管l A;
(4) 混合均勻之后即可進(jìn)行PCR反應(yīng)；
(5) 待PCR擴(kuò)增完成，采用儀器自帶的分析軟件，分析擴(kuò)增結(jié)果，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖 2)， Y=-3.296X+4. 327，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測樣品反應(yīng)體系中煙草根黑腐病菌的DNA
采用本發(fā)明中的試劑盒， 一方面，在待測樣品預(yù)處理過程中，待測樣品提取試劑可以 直接提取土壤樣品中的煙草根黑腐病菌DNA用作PCR擴(kuò)增模板，節(jié)約了時間；另一方面， 在待測樣品的實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增過程中，直接將已按最佳組份及其體積比配制好的實(shí)時熒 光PCR反應(yīng)液加入八連管中，既節(jié)約了大量的時間，且穩(wěn)定可靠，從而達(dá)到了快速、準(zhǔn)確 地檢測土壤中的煙草根黑腐病菌(圖3)。
在上述實(shí)時熒光PCR反應(yīng)液中，各組份采用的是PCR緩沖液是10xPCR緩沖液；MgCl2 的初濃度是25 mmol/L; dNTPs的初濃度是10 mmol/L; Taq DNA聚合酶的初濃度是2. 5 U/ 叱；正向引物Tbl的初濃度是10他ol/L;反向引物Tb2的初濃度是10 Mmol/L;熒光標(biāo)記 探針的初濃度是5 Wnol/L; PCR緩沖液、MgCl2、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶、正向引物Tbl、 反向引物Tb2、熒光標(biāo)記探針的體積比是20:21:4:4:8:8:16。
PCR緩沖液是10xPCR緩沖液；MgCl2的初濃度是25鵬ol/L; dNTPs的初濃度是2 腿ol/L; Taq DNA聚合酶的初濃度是1 U/PL;正向引物Tbl的初濃度是5 Mmol/L;反向引 物Tb2的初濃度是5 mol/L;熒光標(biāo)記探針的初濃度是5陶ol/L; PCR緩沖液、MgCl2、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶、正向引物Tbl、反向引物Tb2、熒光標(biāo)記探針的體積比是 20:21:20:10:16:16:16。
11序列表
<110>重慶大學(xué)
<120>用于檢測煙草根黑腐病菌的引物、探針及實(shí)時熒光PCR試劑盒 〈130〉 無 〈160> 5
〈170〉 Patent In version 3. 5 〈210〉 1 〈211〉 19 <212> 腿
〈213> 煙草根黑腐病病原菌(7^'e7蹈-,A Z 頻.co7a) 〈400〉 1
accatatgtg aacgtacctt ttct 19
<210> 2 <211〉 22 <212〉 薩
〈213〉 煙草根黑腐病病原菌(7Me7a",j."aw'co7a:) 〈400> 2
agtttataaa tgctaccggc agaa 22
<210> 3
〈211〉 23
〈212> ■
〈213〉煙草根黑腐病病原菌(7力/e/ari^^is Z^5"ico7a)〈400> 3
cccgagaggc acctgccaaa gca 23
〈210〉 4 〈211〉 25 <212> 謹(jǐn)
〈213>煙草根黑腐病病原菌(r力/e7諮.，is Z 扁'co7s) 〈400> 4
gccccgagag gcacctgcca aagca 25
〈210〉 5 <211> 26 <212〉 畫
〈213〉 煙草根黑腐病病原菌(7Me7a"'。p^ Z aw.co73) 〈400〉 5
cccgagaggc acctgccaaa gcagct 2權(quán)利要求
1. 一種用于檢測煙草根黑腐病菌的引物，它包括正向引物Tb1和反向引物Tb2組成的引物對，所述正向引物Tb1的核苷酸序列見序列表中的序列1所示，Tb15’-ACC ATA TGTGAA CGT ACC TTT TCT-3’；所述反向引物Tb2核苷酸序列見序列表中的序列2所示，Tb25’-AGT TTA TAA ATG CTA CCG GCA GAA-3’。
2. —種用于檢測煙草根黑腐病菌的探針，其堿基序列是在5'- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3'兩端向上游移位2個堿基或下游移位3個堿基區(qū)域內(nèi)的任意一條核苷酸序 列，熒光報告基團(tuán)標(biāo)記在5'端，熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記在3'端，構(gòu)成熒光標(biāo)記探針。
3. 如權(quán)利要求2所述的用于檢測煙草根黑腐病菌的探針,其特征在于所述探針是在5'-CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3，向上游移位2個堿基的核苷酸序列5，- GCC CCG AGA GGC ACC TGC CAA AGC A -3'，見序列表中的序列4所示。
4. 如權(quán)利要求2所述的用于檢測煙草根黑腐病菌的探針，其特征在于所述探針的核苷 酸序列是序列表中的序列3所示的序列5，- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3'。
5. 如權(quán)利要求2所述的用于檢測煙草根黑腐病菌的探針，其特征在于所述探針是在5'-CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3'向下游移位3個堿基的核苷酸序列5，- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CAG CT -3'，見序列表中的序列5所示。
6. —種檢測煙草根黑腐病菌的試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的引物和權(quán)利要求2、 3、 4或5所述的探針。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括待測樣品提取試劑、 定量標(biāo)準(zhǔn)品、實(shí)時熒光PCR反應(yīng)液和檢測用品，所述實(shí)時熒光PCR反應(yīng)液包括有如下的組 份及其相對應(yīng)的終濃度:PCR緩沖液10%; MgCl2: 2. 6,1/L; dNTPs: 0. 2腸1/L; Taq DNA聚合酶1 U/20 PL;正向引物Tbl: 0.4 Mmol/L;反向引物Tb2: 0.4陶ol/L;熒光標(biāo)記探針0.4陶0l/L;采用無菌超純水調(diào)整終濃度。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測煙草根黑腐病菌的試劑盒，其特征在于在實(shí)時熒光PCR 反應(yīng)液中，各組份采用的是PCR緩沖液是10xPCR緩沖液；MgCl2的初濃度是25mraol/L; dNTPs的初濃度是10 mmol/L; Taq DNA聚合酶的初濃度是2. 5 U/叱；正向引物Tbl的初 濃度是IO陶ol/L;反向引物Tb2的初濃度是10 Mmol/L;熒光標(biāo)記探針的初濃度是5陶ol/L; PCR緩沖液、MgCl2、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶、正向引物Tbl、反向引物Tb2、熒光標(biāo)記探 針的體積比是:20:21:4:4:8:8:16。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測煙草青枯病菌的試劑盒，其特征在于在實(shí)時熒光PCR反應(yīng)液中，各組份采用的是PCR緩沖液是10xPCR緩沖液；MgCl2的初濃度是25 mmol/L; dNTPs的初濃度是2咖ol/L; Taq DNA聚合酶的初濃度是1 U/叱；正向引物Tbl的初濃度 是5 Wnol/L;反向引物Tb2的初濃度是5 Wnol/L;熒光標(biāo)記探針的初濃度是5 Wnol/L; PCR緩沖液、MgCl2、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶、正向引物Tbl、反向引物Tb2、熒光標(biāo)記探 針的體積比是20:21:20:10:16:16:16。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測煙草根黑腐病菌的引物、探針及實(shí)時熒光PCR試劑盒，所述的引物包括正向引物Tb1和反向引物Tb2，其堿基序列分別是Tb15’-ACC ATA TGT GAACGT ACC TTT TCT-3’，Tb25’-AGT TTA TAA ATG CTA CCG GCA GAA-3’。所述的探針的堿基序列是在5’-CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA-3’兩端向上游移位2個堿基或下游移位3個堿基區(qū)域內(nèi)的任意一條核苷酸序列，在該條核苷酸序列上，熒光報告基團(tuán)標(biāo)記在5’端，熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記在3’端，以構(gòu)成熒光標(biāo)記探針，并用上述的引物和探針制備成相應(yīng)的試劑盒。本發(fā)明能在田間病土中快速、準(zhǔn)確地檢測煙草根黑腐病菌，從而為及時采取措施切斷病害的侵染源提供準(zhǔn)確依據(jù)，也可以快速、準(zhǔn)確地檢測植株上的病害。
文檔編號C12Q1/68GK101451162SQ20081023331
公開日2009年6月10日 申請日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者劉映紅, 康振輝, 李常軍, 黃俊麗 申請人:重慶大學(xué)