專利名稱：：一株可代謝尼古丁的紅球菌及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一株可代謝尼古丁的紅球菌及其應用，屬應用微生物
技術領域：
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背景技術：
：煙草是我國財政的重要支柱之一，隨著我國巻煙和煙葉市場的國際化程度逐步加深，《煙草控制框架公約》對煙草制品的限制愈加嚴格，中國煙草面臨著新的形勢與新的挑戰(zhàn)。為此，國家煙草專賣局制定了《中國巻煙科技發(fā)展綱要》，明確提出中國巻煙發(fā)展的方向是以市場為導向，大力發(fā)展中式巻煙。而發(fā)展中式巻煙的關鍵技術就是要在保持高香氣的前提下"減害降焦"，開發(fā)"低焦油、低危害、高香氣"的中式巻煙品牌。因此，降低煙草中尼古丁等有害成分的含量，是促進巻煙工業(yè)健康發(fā)展的關鍵技術之一。尼古丁是煙草生物堿中的主要成分，在煙草中，尼古丁大部分是以有機酸(如擰檬酸和蘋果酸)鹽的狀態(tài)存在，也有少量的以自由狀態(tài)存在。尼古丁進入人體內，90%被肺部吸收，進入血液后6秒鐘即可到達大腦。尼古丁對人體最顯著的作用是對交感神經產生影響，通常表現為短暫的興奮，緊接著就是抑制。尼古丁的作用除了增加煙味和感受刺激外，主要還在于它所產生的生理強度，通常稱為"勁頭"。一般來講，尼古丁含量高的煙葉，煙氣勁頭大，反之則小。因此，煙氣中含有一定量的尼古丁是必要的，但尼古丁的含量也不能過高，否則不但會增加煙氣的刺激性，影響巻煙吸味，而且從安全性的角度來講也是一個非常不利的因素。我國部分煙區(qū)的煙葉外觀質量已接近國際水平，但就其內在質量而言還有一定差距，其中一個較普遍且較突出的問題就是尼古丁含量偏高。目前，我國烤煙尼古丁的平均含量為3%4%，白肋煙平均高達6%，而美國烤煙的尼古丁含量在1.5%3.5%之間；一般優(yōu)質白肋煙的尼古丁含量在1.5%4.0%之間，以3.0%為佳，美國白肋煙的尼古丁含量為2.9%左右。國內巻煙企業(yè)目前貯存的上部煙葉較多，一般因其尼古丁含量較高而難以較多用于葉組配方中，不僅占用了大量的倉儲空間，而且也造成了大量的浪費。這個問題已引起有關方面的重視，如何降低這些煙葉中的尼古丁含量是各巻煙企業(yè)所面臨的一個現實問題。同時由于煙草的連續(xù)栽培和大量廢棄煙葉的存在使土壤中的尼古丁含量大大提高，對土壤環(huán)境和地下水質造成了較大的影響，如何有效的消除尼古丁對環(huán)境的污染也是當前人類發(fā)展所面臨的關鍵問題。目前，關于利用微生物降解尼古丁(煙堿)的研究己有報道。但經文獻檢索，未發(fā)現與本
發(fā)明內容相同文獻的公開報道。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于通過對一株能夠降解煙草中尼古丁(煙堿)含量的微生物紅球菌Y22(i/2oAcoccmsp.Y22)的研究，提供一種降低煙草中尼古丁含量的方法。本發(fā)明從云南省嵩明縣楊林鎮(zhèn)煙草栽培土壤中分離了一株具有降解尼古丁能力的細菌Y22，對其進行了形態(tài)學、生理生化性質和16SrRNA分析，鑒定結果表明該細菌屬于紅球菌屬，該菌株命名為i^wfococciwsp.Y22。本該菌株已經保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所；保藏日期2008年9月28日；保藏號為CGMCCNo.2683。紅球菌Y22(7/w^coccMsp.Y22)菌株的主要形態(tài)特征和生理生化性質為紅球菌Y22菌株在培養(yǎng)早期為分支桿狀，中期呈短桿狀，后期變?yōu)榍蛐?。無芽孢，不能運動。革蘭氏染色陽性。硝酸鹽還原和接觸酶試驗為陽性。不能液化吲哚，不能水解淀粉。甲基紅(MR)實驗和乙酰甲基甲醇(VP)實驗均為陰性。本齒株對葡萄糖、甘露醇和山梨醇發(fā)酵產酸；甘油、麥芽糖、乳糖和蔗糖發(fā)酵不產酸。另外本菌株不能在45。C生長。Y22菌株在Luria-Bertani(LB)平板上于28。C下培養(yǎng)48小時的培養(yǎng)特征為圓形，不透明，中間突起，白色，邊緣有毛狀突起。在以尼古丁為唯一碳氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)48后會產生灰色色素。紅球菌Y22(朋o^cocciwsp.Y22)菌株的分子鑒定特征為利用通用引物20F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)禾口1500R(5'-GGTTACCTTGTTACGACT-3')，以紅球菌Y22的基因組DNA作為模板擴增得到1500bp左右的PCR產物，回收測序、校正之后得到的Y22菌株的部分16SrRNA基因序列1485bp,該序列已經遞交國際核苷酸序列數據庫(GenBank)，序列索引號為FJ236510。本發(fā)明按常規(guī)方法用常規(guī)設備制備。即將紅球菌Y22(i/wAcoccwssp.Y22)擴大發(fā)酵培養(yǎng)后得到。本發(fā)明的紅球菌Y22(i/w^"cc^sp.Y22)作為降低煙草中尼古丁含量的的生物催化劑應用。本發(fā)明具有可調整煙葉原料的尼古丁含量，提高煙葉可用性，及可分解煙塵中的尼古丁，減少其對環(huán)境的污染等優(yōu)點。圖1為7/20^cocc^sp.Y22耐受尼古丁濃度試驗結果。圖2為紅球菌Y22Y22)降解尼古丁的生長曲線。具體實施例方式以下是本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明的內容并不局限于此。本發(fā)明是這樣實現的1.紅球菌Y22(及/^/toocc"Jsp.Y22)的培養(yǎng)方法1)試管斜面培養(yǎng)采用Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基，重量百分比配方為1%蛋白胨，1%氯化鈉，0.5%酵母提取物，2%瓊脂。121。C滅菌25分鐘，擺成斜面。接種i^octococa^sp.Y22，28"C培養(yǎng)48小時，獲得試管種。2)液體擴大培養(yǎng)A.種子培養(yǎng)(LB培養(yǎng)基)，重量百分比配方為1%蛋白胨，1%氯化鈉，0.5%酵母提取物。12rC滅菌25分鐘。Y22，28'C培養(yǎng)48小時，獲得液體菌種。B.發(fā)酵培養(yǎng)基lg尼古丁，0.26gK2HP04.3H20，0.8gKH2P04，0.41gMgS04.7H20,O.lgCaS04'H20,0.0039gNaMo04,0.005gFeS04'7H20,0.3g(NH4)2S04，加水至1000mL,pH7.0。培養(yǎng)基初始pH7.0，接種量(體積百分比，v/v)2%，轉速150rpm，溫度28'C。發(fā)酵培養(yǎng)24小時。2.紅球菌Y22(l/^<toaccMssp.Y22)耐受尼古丁濃度試驗將培養(yǎng)12小時的液體菌種(OD600"0.4)以1%(液體菌種體積百分比，v/v)的接種量接于尼古丁梯度的發(fā)酵培養(yǎng)基中，尼古丁的梯度為0gL—1、0.5gL"、1.0gL—1、1.5g1/1、2.0gl/1、2.5gL"和3.0gL"，轉速150rpm，溫度28。C，培養(yǎng)48小時離心收集菌體，用50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)洗滌三次后用等體積緩沖液重懸并測定OD600(圖1)。由圖l的試驗結果可見紅球菌Y22菌株在本試驗條件下，最適生長尼古丁濃度為1.5gL—1，最高尼古丁耐受濃度為3gL—1。3.紅球菌Y22(J/uwtococcwsp.Y22)降解尼古丁的生長曲線將培養(yǎng)12小時的液體菌種(OD600^0.4)以1%(液體菌種體積百分比，v/v)的接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉速150rpm，溫度28X:，每隔49小時取菌液，用高效液相測定尼古丁含量，并測定OD600(圖2)。由圖2得出如下結果隨著紅球菌Y22菌株在發(fā)酵液的濃度逐漸增加，尼古丁的濃度逐漸下降。當發(fā)酵時間為52小時，尼古丁基本被完全降解。在本試驗條件下，尼古丁減少和菌體濃度的增加保持一致，020小時為其延滯期，2047小時為指數生長期,到52小時尼古丁降解完畢細菌生長進入穩(wěn)定期。4.紅球菌Y22(及^wtofWT附sp.Y22)降解尼古丁菌制劑的制備利用發(fā)酵培養(yǎng)基制備1000mL的發(fā)酵液，8000rpm離心15min收集菌體，把菌體用滅菌的緩沖液(50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0)進行懸浮，8000rpm離心15min收集菌體，重復兩次，菌體細胞最后用50ml的緩沖液進行懸浮，即能用于降解尼古丁。5.紅球菌Y22(及Aorfococc附sp.Y22)制劑的降解煙葉中尼古丁試驗分別稱取2g保山B3F煙葉，噴灑5ml菌制劑，并分別噴灑5ml、10ml和15ml緩沖液(50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0)作為三個梯度，每個梯度三個重復，以未噴灑菌制劑的煙葉作為對照，置于恒溫培養(yǎng)箱中28"C反應3天，每隔12小時搖勻一次。反應完畢后每一組都添加緩沖液至總體積為30tnl并放于4'C冰箱中過夜，浸出液經離心和稀釋2倍后用高效液相進行尼古丁含量測定(表1)。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>87.6由表1得知在本試驗的條件下，Y22菌株降解煙葉中尼古丁的效果明顯；緩沖液的用量對Y22菌株降解煙葉中尼古丁的影響較大，尼古丁的降解率與緩沖液的用量呈正相關。權利要求1、一株能代謝尼古丁的紅球菌，其特征在于紅球菌(Rhodococcussp.Y22)已于2008年9月28日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.2683。2、權利要求1所述能代謝尼古丁的紅球菌，其特征在于該紅球菌作為降低煙草中尼古丁含量的生物催化劑應用。全文摘要本發(fā)明涉及一株能代謝尼古丁的紅球菌及其應用，屬應用微生物
技術領域：
。本發(fā)明的紅球菌(Rhodococcussp.Y22)，已于2008年9月28日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.2683。紅球菌(Rhodococcussp.Y22)具有較強的尼古丁代謝能力和尼古丁毒性抗性能力，能在高達3g/L尼古丁濃度下生長。通過大量培養(yǎng)該菌株，利用該菌株的完整細胞為生物催化劑將純煙堿完全降解，同時能降解煙葉中的尼古丁含量。本發(fā)明具有能調整煙葉原料的尼古丁含量，提高煙葉可用性，及可分解煙塵中的尼古丁，減少其對環(huán)境的污染等優(yōu)點。文檔編號C12N1/20GK101434926SQ20081023351公開日2009年5月20日申請日期2008年10月31日優(yōu)先權日2008年10月31日發(fā)明者鞏效偉,張克勤,曾曉鷹,李慶華,楊金奎,段焰青,為者申請人:云南大學